high-throughput-purification-of-affinity-tagged-recombinant-proteins

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Imperial College London 

RNA &#x805A;&#x5408;&#x9176; (RNAPs) &#x9700;&#x8981;&#x57FA;&#x5E95;&#x7684;&#x8F6C;&#x5F55;&#x56E0;&#x5B50;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x534F;&#x52A9;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x5728;&#x8F6C;&#x5F55;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x7684;&#x542F;&#x52A8;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x3002;&#x5176;&#x4E2D;&#x4E00;&#x4E2A;&#x56E0;&#x7D20;&#xFF0C;TFIIB&#xFF0C;&#x7ED3;&#x5408;&#x62DB;&#x8058; RNAP&#xFF0C;&#x7194;&#x5316;&#x7684;&#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x8BC6;&#x522B;&#x3001; &#x5F00;&#x59CB;&#x9009;&#x5740;&#x548C;&#x5404;&#x79CD; post-initiation &#x529F;&#x80FD;&#x3002;&#x94FE;&#x63A5;&#x5668;&#x57DF;&#39; TFIIB 381 &#x5B9A;&#x70B9;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x6765;&#x523A;&#x6FC0;&#x6D41;&#x4EA7;&#x8F6C;&#x5F55;&#x6709;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x5730;&#x91CF;&#x5316;&#x4F7F;&#x7528;&#x72EC;&#x7ACB;&#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x7684;&#x4E8C;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x6269;&#x5C55;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x7ED3;&#x679C;&#x663E;&#x793A;&#x4E24;&#x4E2A;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x7FA4;&#x96C6; &#xFF08;mjTFIIB E78 R80 &#x548C; mjTFIIB R90-G94&#xFF0C;&#x5206;&#x522B;)&#xFF0C;&#x662F;&#x7279;&#x522B;&#x654F;&#x611F;&#x7684;&#x66FF;&#x6362;&#x3002;&#x4E0E;&#x6B64;&#x76F8;&#x53CD;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x4E24;&#x4E2A;&#x7FA4;&#x96C6;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x77ED;&#x5E8F;&#x5217; &#xFF08;mjTFIIB A81 K89) &#x5BB9;&#x5FCD;&#x6FC0;&#x8FDB;&#x7684;&#x5355;&#x4E2A;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x7684;&#x66FF;&#x6362; &#xFF1B;&#x77ED;&#x5220;&#x9664;&#x8BE5;&#x5730;&#x533A;&#x751A;&#x81F3;&#x9020;&#x6210;&#x523A;&#x6FC0;&#x6D41;&#x4EA7;&#x8F6C;&#x5F55; (&#39;superstimulation&#39;) TFIIB &#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x6709;&#x663E;&#x8457;&#x7684;&#x589E;&#x52A0;&#x3002;Superstimulating &#x6D3B;&#x52A8;&#x505A;&#x7684;&#x90A3;&#x6837;&#xFF0C;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x4E0E;&#x6CA1;&#x6709;&#x5173;&#x8054; TFIIB/RNAP &#x590D;&#x6742;&#x589E;&#x52A0;&#x62DB;&#x8058;&#x56E0;&#x4E3A;&#x4E2D;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7279;&#x5B9A;&#x7684;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269; (mjTFIIB K87) &#x66FF;&#x6362;&#x589E;&#x52A0;&#x62DB;&#x52DF;&#x8D85;&#x8FC7; 5 &#x500D;&#x800C;&#x4E0D;&#x4F1A;&#x5F71;&#x54CD;&#x6D41;&#x4EA7;&#x8C08;&#x8BDD;&#x523A;&#x6FC0;&#x7684;&#x901F;&#x7387;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x6F14;&#x793A; TFIIB &#x94FE;&#x63A5;&#x5668;&#x5185;&#x7684;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x672C;&#x5730;&#x5316;&#x7684;&#x66F4;&#x6539;&#x6709;&#x6DF1;&#x523B;&#xFF0C;&#x4F46;&#x4EE4;&#x4EBA;&#x60CA;&#x8BB6;&#x7684;&#x65AD;&#x5F00;&#x8FDE;&#x63A5;&#xFF0C;RNAP &#x62DB;&#x8058;&#x3001; TFIIB/RNAP &#x590D;&#x6742;&#x7A33;&#x5B9A;&#x548C;&#x8F6C;&#x5F55;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x7684;&#x542F;&#x52A8;&#x7684;&#x901F;&#x5EA6;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;&#x786E;&#x5B9A; superstimulating TFIIB &#x7684;&#x53D8;&#x79CD;&#x63ED;&#x793A;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x6700;&#x65E9;&#x9636;&#x6BB5;&#xFF0C;&#x6839;&#x636E;&#x4EE5;&#x524D;&#x672A;&#x77E5;&#x7684;&#x901F;&#x7387;&#x9650;&#x5236;&#x7684;&#x6B65;&#x9AA4;&#x7684;&#x5B58;&#x5728;&#x3002;

&#x57FA;&#x5E95;&#x8F6C;&#x5F55;&#x56E0;&#x5B50; TFIIB &#x7684;&#x94FE;&#x63A5;&#x5668;&#x57DF;&#x63A7;&#x5236;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x5F81;&#x8058;&#x548C;&#x8F6C;&#x5F55;&#x523A;&#x6FC0;&#x529F;&#x80FD;&#x3002;

RNA polymerases (RNAPs) require basal transcription factors to assist them during transcription initiation. One of these factors, TFIIB, combines promoter recognition, recruitment of RNAP, promoter melting, start site selection and various post-initiation functions. The ability of 381 site-directed mutants in the TFIIB 'linker domain' to stimulate abortive transcription was systematically quantitated using promoter-independent dinucleotide extension assays. The results revealed two distinct clusters (mjTFIIB E78-R80 and mjTFIIB R90-G94, respectively) that were particularly sensitive to substitutions. In contrast, a short sequence (mjTFIIB A81-K89) between these two clusters tolerated radical single amino acid substitutions; short deletions in that region even caused a marked increase in the ability of TFIIB to stimulate abortive transcription ('superstimulation'). The superstimulating activity did, however, not correlate with increased recruitment of the TFIIB/RNAP complex because substitutions in a particular residue (mjTFIIB K87) increased recruitment by more than 5-fold without affecting the rate of abortive transcript stimulation. Our work demonstrates that highly localized changes within the TFIIB linker have profound, yet surprisingly disconnected, effects on RNAP recruitment, TFIIB/RNAP complex stability and the rate of transcription initiation. The identification of superstimulating TFIIB variants reveals the existence of a previously unknown rate-limiting step acting on the earliest stages of gene expression.

The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions.

ARN polym&eacute;rases (RNAPs) n&eacute;cessitent des facteurs de transcription basale afin de les aider au cours de l&#39;initiation de la transcription. Un de ces facteurs, TFIIB, combine la reconnaissance de promoteur, recrutement de RNAP, promoteur de fusion, commencer la s&eacute;lection du site et des diverses fonctions post-initiation. La capacit&eacute; de 381 mutants dirig&eacute;e dans le TFIIB &laquo; domaine de l&#39;&eacute;diteur de liens &raquo; pour stimuler la transcription avort&eacute;e a &eacute;t&eacute; dos&eacute;e syst&eacute;matiquement utilisant la prolongation dinucl&eacute;otide ind&eacute;pendant du promoteur. Les r&eacute;sultats ont r&eacute;v&eacute;l&eacute; deux groupes distincts (mjTFIIB E78-R80 et mjTFIIB R90-G94, respectivement) qui sont particuli&egrave;rement sensibles &agrave; des substitutions. En revanche, une courte s&eacute;quence (A81-K89 mjTFIIB) entre ces deux groupes tol&eacute;r&eacute;s substitution radicalaire seul acide amin&eacute; ; destructions courtes dans cette r&eacute;gion a provoqu&eacute; une augmentation marqu&eacute;e encore la capacit&eacute; de TFIIB pour stimuler la transcription avort&eacute;e (&laquo; surstimulation &raquo;). L&#39;activit&eacute; superstimulating a fait, cependant, pas en corr&eacute;lation avec l&#39;augmentation du recrutement de la TFIIB/RNAP complexe parce que substitutions dans un r&eacute;sidu particuli&egrave;re (mjTFIIB K87) augment&eacute; de recrutement de plus de 5 fois sans affecter le taux de stimulation transcription avort&eacute;e. Notre travail montre que des modifications tr&egrave;s localis&eacute;es dans l&#39;&eacute;diteur de liens TFIIB ont des effets profonds, mais &eacute;tonnamment d&eacute;connect&eacute;es, recrutement RNAP, stabilit&eacute; complexe TFIIB/RNAP et le taux d&#39;initiation de la transcription. L&#39;identification des superstimulating TFIIB variantes r&eacute;v&egrave;le l&#39;existence d&#39;une inconnu &eacute;tape cin&eacute;tiquement limitante, agissant sur les premi&egrave;res &eacute;tapes de l&#39;expression g&eacute;nique.

Le domaine de l&#39;&eacute;diteur de liens de facteur de transcription basale TFIIB contr&ocirc;le des fonctions distinctes de recrutement et de la transcription stimulation.

ARN polimerasas (RNAPs) requieren factores de transcripci&oacute;n basal para ayudarles durante la iniciaci&oacute;n de la transcripci&oacute;n. Uno de estos factores, TFIIB, combina el reconocimiento del promotor, reclutamiento de descubrimiento, promotor de fusi&oacute;n, comenzar la selecci&oacute;n del sitio y varias funciones de post-initiation. La capacidad de 381 mutantes dirigida en el TFIIB &quot;dominio de vinculador&quot; estimular la transcripci&oacute;n abortiva sistem&aacute;ticamente fue cuantificado mediante ensayos de extensi&oacute;n de dinucle&oacute;tido promotor independiente. Los resultados revelaron dos distintos grupos (mjTFIIB E78-R80 y mjTFIIB R90-G94, respectivamente) que eran particularmente sensibles a las substituciones. En cambio, una secuencia corta (mjTFIIB A81-K89) entre estas dos agrupaciones toleraba sustituciones de amino&aacute;cidos individuales radical; cortos eliminaciones en esa regi&oacute;n incluso causaron un marcado aumento en la capacidad de TFIIB para estimular la transcripci&oacute;n abortivo (&#39;superstimulation&#39;). La actividad superstimulating, sin embargo, no se correlacion&oacute; con mayor contrataci&oacute;n del complejo TFIIB/descubrimiento porque sustituciones en un residuo determinado (mjTFIIB K87) creciente reclutamiento por m&aacute;s de 5 veces sin afectar la tasa de estimulaci&oacute;n de la transcripci&oacute;n abortiva. Nuestro trabajo demuestra que los cambios muy localizados dentro de la m&aacute;quina para hacer chorizos TFIIB tienen efectos profundos, pero sorprendentemente desconectados, en reclutamiento ARNP, estabilidad compleja TFIIB/descubrimiento y la tasa de iniciaci&oacute;n de la transcripci&oacute;n. La identificaci&oacute;n de superstimulating TFIIB variantes revela la existencia de un paso de limitaci&oacute;n de velocidad previamente desconocido actuando en las primeras etapas de la expresi&oacute;n g&eacute;nica.

El dominio de vinculador de factor de transcripci&oacute;n basal TFIIB controla distintas funciones de estimulaci&oacute;n de reclutamiento y transcripci&oacute;n.

RNA-Polymerasen (RNAPs) erfordern basalen Transkriptionsfaktoren, ihnen zu helfen, w&auml;hrend Initiation der Transkription. Einer dieser Faktoren, TFIIB, kombiniert Projekttr&auml;ger Anerkennung, Rekrutierung von Name, Projekttr&auml;ger, die schmelzen, Standortwahl und verschiedenen post-initiation Funktionen zu starten. Die F&auml;higkeit von 381 Site-verwiesene Mutanten in der TFIIB &#39;Linker Dom&auml;ne&#39; F&ouml;rderung der erfolglosen Transkription wurde systematisch quantifiziert mit Projekttr&auml;ger-unabh&auml;ngige-dinucleotid Erweiterung Proben. Die Ergebnisse zeigten zwei verschiedene Cluster (MjTFIIB E78-R80 und MjTFIIB R90-G94, beziehungsweise), die besonders empfindlich auf Auswechslungen waren. Im Gegensatz dazu toleriert eine kurze Sequenz (MjTFIIB A81-K89) zwischen diesen zwei Clustern radikale einzelne Aminos&auml;ure Ersetzungen; kurze Deletionen in dieser Region verursacht sogar eine deutliche Zunahme in der F&auml;higkeit der TFIIB, abortive Transkription (&#39;Superstimulation&#39;) zu f&ouml;rdern. Die superstimulating Aktivit&auml;t, jedoch nicht mit verst&auml;rkte Rekrutierung von komplexen TFIIB/Name korrelieren, weil Ersetzungen in einer bestimmten R&uuml;ckstand (MjTFIIB K87) Rekrutierung von mehr als 5-fach erh&ouml;ht ohne Auswirkungen auf die Rate der erfolglosen Abschrift Stimulation. Unsere Arbeit zeigt, dass hoch lokalisierte &Auml;nderungen innerhalb der TFIIB-Linker tiefgreifende, dennoch &uuml;berraschend getrennt, auf Name Rekrutierung, TFIIB/Name Komplexstabilit&auml;t und die Rate der Initiation der Transkription auswirken. Die Identifizierung von superstimulating TFIIB Varianten zeigt die Existenz einer bisher unbekannten geschwindigkeitsbestimmende Schritt auf den fr&uuml;hesten Stadien der Genexpression.

Linker Bereich der basalen &Uuml;bertragungfaktor TFIIB steuert unterschiedliche Rekrutierung und Transkription Stimulierung-Funktionen.

Polimerasi del RNA (RNAPs) necessitano di fattori di trascrizione basali ad assisterli durante l&#39;iniziazione della trascrizione. Uno di questi fattori, TFIIB, unisce il riconoscimento del promotore, reclutamento di RNAP, promotore di fusione, inizio selezione del sito e varie funzioni di post-initiation. La capacit&agrave; di 381 mutanti sito-diretto nel TFIIB &#39;dominio linker&#39; per stimolare la trascrizione abortiva sistematicamente era quantificati utilizzando dosaggi estensione dinucleotide promotore indipendente. I risultati hanno rivelato due ammassi distinti (mjTFIIB E78-R80 e mjTFIIB G94-R90, rispettivamente) che sono stati particolarmente sensibili alle sostituzioni. Al contrario, una breve sequenza (mjTFIIB A81-K89) tra questi due ammassi tollerato radicale singolo aminoacidiche; breve delezioni in quella regione anche causato un marcato aumento nella capacit&agrave; di TFIIB per stimolare la trascrizione abortiva (&#39;superstimulation&#39;). L&#39;attivit&agrave; superstimulating, tuttavia, non correlare con aumentata assunzione del TFIIB/RNAP complesso perch&eacute; le sostituzioni in un particolare residuo (mjTFIIB K87) aumentato reclutamento di pi&ugrave; di 5-fold senza alterare la frequenza di stimolazione di trascrizione abortiva. Il nostro lavoro dimostra che modifiche altamente localizzate all&#39;interno del linker TFIIB hanno effetti profondi, eppure sorprendentemente disconnessi, sul reclutamento RNAP, TFIIB/RNAP complesso stabilit&agrave; e la velocit&agrave; di iniziazione della trascrizione. L&#39;identificazione del superstimulating TFIIB varianti rivela l&#39;esistenza di un passo di limitazione della velocit&agrave; precedentemente sconosciuto agendo sulle prime fasi dell&#39;espressione genica.

Il dominio linker del fattore di trascrizione basale TFIIB controlla funzioni distinte di stimolazione reclutamento e trascrizione.

RNA &#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; (RNAPs) &#x57FA;&#x5E95;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30D7;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x8981;&#x56E0;&#x8EE2;&#x5199;&#x958B;&#x59CB;&#x6642;&#x306B;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x3092;&#x652F;&#x63F4;&#x3059;&#x308B;&#x5FC5;&#x8981;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x3068;&#x69D8;&#x3005; &#x306A;&#x521D;&#x671F;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x958B;&#x59CB;&#x3001;TFIIB&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x8981;&#x56E0;&#x306E; 1 &#x3064;&#x52DF;&#x96C6; RNAP &#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x878D;&#x89E3;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x8A8D;&#x8B58;&#x3092;&#x517C;&#x306D;&#x5099;&#x3048;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;381 &#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x6307;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x7CFB;&#x7D71; TFIIB &#39;&#x30EA;&#x30F3;&#x30AB;&#x30FC; &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#39; &#x306E;&#x80FD;&#x529B;&#x306B;&#x5931;&#x6557;&#x306B;&#x7D42;&#x308F;&#x3063;&#x305F;&#x8EE2;&#x5199;&#x3092;&#x4FC3;&#x9032;&#x3059;&#x308B;&#x4F53;&#x7CFB;&#x7684;&#x306B;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x72EC;&#x7ACB;&#x88DC;&#x9175;&#x7D20;&#x5EF6;&#x9577;&#x306E;&#x8A66;&#x91D1;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x7D50;&#x679C;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x305F; 2 &#x3064;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30BF;&#x30FC; (mjTFIIB e78 &#x3067;&#x793A;&#x3055; R80 &#x3068; mjTFIIB R90 G94 &#x305D;&#x308C;&#x305E;&#x308C;) &#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7F6E;&#x63DB;&#x306B;&#x7279;&#x306B;&#x654F;&#x611F;&#x306A;&#x3002;&#x5BFE;&#x7167;&#x7684;&#x306B;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089; 2 &#x3064;&#x306E;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30BF;&#x30FC;&#x9593;&#x306E;&#x77ED;&#x3044;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9; (mjTFIIB A81 K89) &#x30E9;&#x30B8;&#x30AB;&#x30EB;&#x306E;&#x5358;&#x4E00;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x7F6E;&#x63DB;&#x5BB9;&#x8A8D;;&#x305D;&#x306E;&#x5730;&#x57DF;&#x3067;&#x77ED;&#x3044;&#x524A;&#x9664;&#x3082;&#x8457;&#x3057;&#x3044;&#x5897;&#x52A0; TFIIB &#x306E;&#x80FD;&#x529B;&#x3067;&#x5931;&#x6557;&#x306B;&#x7D42;&#x308F;&#x3063;&#x305F;&#x8EE2;&#x5199; (&#39;superstimulation&#39;&#xFF09; &#x3092;&#x523A;&#x6FC0;&#x3059;&#x308B;&#x539F;&#x56E0;&#x3002;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x6B8B;&#x6E23; (mjTFIIB K87) &#x306E;&#x7F6E;&#x63DB;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x52DF;&#x96C6;&#x3088;&#x308A;&#x3082; 5 &#x500D;&#x9813;&#x632B;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3; &#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30D7;&#x30C8;&#x523A;&#x6FC0;&#x306E;&#x7387;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x305A;&#x5897;&#x52A0;&#x305F;&#x3081; superstimulating &#x306E;&#x6D3B;&#x52D5;&#x304C; TFIIB/RNAP &#x8907;&#x96D1;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x306E;&#x63A1;&#x7528;&#x3092;&#x305F;&#x3060;&#x3057;&#x3001;&#x76F8;&#x95A2;&#x3057;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x306E;&#x4ED5;&#x4E8B;&#x306F;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30E9;&#x30A4;&#x30BA;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5909;&#x66F4; TFIIB &#x30EA;&#x30F3;&#x30AB;&#x30FC;&#x5185; RNAP &#x52DF;&#x96C6;&#x3001;TFIIB/RNAP &#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x5B89;&#x5B9A;&#x6027;&#x3068;&#x8EE2;&#x5199;&#x958B;&#x59CB;&#x7387;&#x306E;&#x6DF1;&#x9060;&#x306A;&#x307E;&#x3060;&#x9A5A;&#x304F;&#x307B;&#x3069;&#x5207;&#x65AD;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5F71;&#x97FF;&#x304C;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x8B58;&#x5225; superstimulating TFIIB &#x306E;&#x4E9C;&#x7A2E;&#x306F;&#x3001;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x306E;&#x521D;&#x671F;&#x6BB5;&#x968E;&#x306B;&#x4F5C;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x672A;&#x77E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x5236;&#x9650;&#x306E;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30EA;&#x30F3;&#x30AB;&#x30FC; &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3; TFIIB &#x306E;&#x57FA;&#x5E95;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30D7;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x8981;&#x56E0;&#x306E;&#x52DF;&#x96C6;&#x3068;&#x8EE2;&#x5199;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x523A;&#x6FC0;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x5236;&#x5FA1;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

RNA &#xD3F4; (RNAPs) &#xAE30;&#xC800; &#xC804;&#xC0AC; &#xC778;&#xC790; &#xC804;&#xC0AC; &#xAC1C;&#xC2DC; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC744; &#xC9C0;&#xC6D0; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xD544;&#xC694; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xB97C; &#xC120;&#xD0DD; &#xD558; &#xACE0; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; post-initiation &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xC2DC;&#xC791;, &#xD558;&#xB098; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC694;&#xC18C;, TFIIB, &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778; &#xC778;&#xC2DD;, RNAP, &#xC6A9;&#xC735; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778; &#xBAA8;&#xC9D1;&#xC744; &#xACB0;&#xD569; &#xD55C;&#xB2E4;. TFIIB &#39;&#xB9C1;&#xCEE4; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#39;&#xC5D0; 381 &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xAC10;&#xB3C5; &#xBBA4;&#xD134;&#xD2B8;&#xC758; &#xB2A5;&#xB825; &#xC870;&#xC0B0;&#xC758; &#xC804;&#xC0AC;&#xB97C; &#xC790;&#xADF9; &#xD558;&#xB294; &#xCCB4;&#xACC4;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; quantitated &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778; &#xB3C5;&#xB9BD;&#xC801;&#xC778; &#xB514;&#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; &#xD655;&#xC7A5; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;. &#xACB0;&#xACFC; &#xBC1C;&#xD45C; &#xB450; &#xAC00;&#xC9C0; &#xD074;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xD130; (mjTFIIB E78 R80 &#xBC0F; mjTFIIB R90 G94 &#xAC01;&#xAC01;) &#xB300;&#xCCB4;&#xC5D0; &#xD2B9;&#xD788; &#xBBFC;&#xAC10; &#xD588;&#xB2E4;. &#xBC18;&#xBA74;, &#xC9E7;&#xC740; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; (mjTFIIB A81 K89) &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB450; &#xD074;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xD130; &#xAC04;&#xC758; &#xC6A9;&#xB0A9; &#xAE09;&#xC9C4;&#xC801;&#xC778; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xB97C; &#xD568;&#xC720;&#xD55C; &#xC0B0; &#xC131; &#xB300;&#xCCB4;; &#xADF8; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC9E7;&#xC740; &#xC0AD;&#xC81C;&#xB3C4; &#xC870;&#xC0B0; &#xC804;&#xC0AC; (&#39;superstimulation&#39;)&#xC744; &#xC790;&#xADF9; &#xD558;&#xB294; TFIIB&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0; &#xD604;&#xC800;&#xD55C; &#xC99D;&#xAC00; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098; superstimulating &#xD65C;&#xB3D9;, &#xAD00;&#xB828; &#xB418;&#xC9C0; &#xC99D;&#xAC00; &#xBAA8;&#xC9D1; TFIIB/RNAP &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xD2B9;&#xC815; &#xC794;&#xC5EC;&#xBB3C; (mjTFIIB K87)&#xC5D0;&#xC11C; &#xB300;&#xCCB4; &#xC778;&#xC0C1; &#xC870;&#xC0B0; &#xC131;&#xC801; &#xC790;&#xADF9;&#xC758; &#xC18D;&#xB3C4; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC8FC;&#xC9C0; &#xC54A;&#xACE0; &#xC774;&#xC0C1; 5-fold&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xCC44;&#xC6A9; &#xB41C;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC791;&#xC5C5; TFIIB &#xB9C1;&#xCEE4; &#xB0B4;&#xC758; &#xB192;&#xC740; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654; &#xB41C; &#xBCC0;&#xACBD; RNAP &#xBAA8;&#xC9D1;, TFIIB/RNAP &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xC548;&#xC815;&#xC131; &#xBC0F; &#xC804;&#xC0AC; &#xAC1C;&#xC2DC;&#xC758; &#xC18D;&#xB3C4; &#xAE4A;&#xACE0;, &#xC544;&#xC9C1;&#xC740; &#xB180;&#xB77C;&#xC6B8; &#xC815;&#xB3C4;&#xB85C; &#xC5F0;&#xACB0;&#xC774; &#xB04A;&#xAE34; &#xD6A8;&#xACFC; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. Id superstimulating TFIIB&#xC758; &#xBCC0;&#xC885; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604;&#xC758; &#xCD08;&#xAE30; &#xB2E8;&#xACC4;&#xC5D0; &#xD589;&#xB3D9; &#xC774;&#xC804;&#xC5D0; &#xC54C; &#xC218; &#xC5C6;&#xB294; &#xC18D;&#xB3C4; &#xC81C;&#xD55C; &#xB2E8;&#xACC4; &#xC874;&#xC7AC;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC900;&#xB2E4;.

&#xAE30;&#xC800; &#xC804;&#xC0AC; &#xC778;&#xC790; TFIIB&#xC758; &#xB9C1;&#xCEE4; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xBCC4;&#xAC1C; &#xBAA8;&#xC9D1; &#xBC0F; &#xC804;&#xC0AC; &#xC790;&#xADF9; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xC81C;&#xC5B4; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

The TFIIB linker domain stimulates the catalytic activity of archaeal RNAP. By characterising a range of super-stimulating mutants we identified a novel rate-limiting step in transcription initiation. Our results help to interpret structural findings and pave the way towards higher-resolution structures of the RNAP-TFIIB linker interface.

Revealing the functions of TFIIB.

Le domaine de l&#39;&eacute;diteur de liens TFIIB stimule l&#39;activit&eacute; catalytique d&#39;archaeal RNAP. En caract&eacute;risant une s&eacute;rie de mutants super-stimulating, nous avons identifi&eacute; une nouvelle &eacute;tape limitante dans l&#39;initiation de la transcription. Nos r&eacute;sultats aident &agrave; interpr&eacute;ter les conclusions structurales et ouvrir la voie &agrave; une r&eacute;solution sup&eacute;rieure des structures de l&#39;interface de l&#39;&eacute;diteur de liens RNAP-TFIIB.

R&eacute;v&eacute;lant les fonctions de TFIIB.

Die TFIIB-Linker-Dom&auml;ne stimuliert die katalytische Aktivit&auml;t der reitenden Name. Durch die Charakterisierung verschiedener super-stimulating Mutanten haben wir einen neuartigen geschwindigkeitsbestimmende Schritt in Transkription Einleitung identifiziert. Unsere Ergebnisse helfen, strukturelle Befunde zu interpretieren und ebnen den Weg in Richtung h&ouml;herer Aufl&ouml;sung Strukturen der Name-TFIIB Linker Schnittstelle.

Die Funktionen der TFIIB aufschlussreich.

Il dominio linker TFIIB stimola l&#39;attivit&agrave; catalitica di archaeal RNAP. Da che caratterizzano una gamma di mutanti super-stimulating abbiamo individuato un romanzo passo di limitazione della velocit&agrave; nell&#39;iniziazione della trascrizione. I nostri risultati aiutano a interpretare i risultati strutturali e spianare la strada verso strutture ad alta risoluzione dell&#39;interfaccia del linker RNAP-TFIIB.

Rivelando le funzioni di TFIIB.

TFIIB &#x30EA;&#x30F3;&#x30AB;&#x30FC; &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3; &#x30A2;&#x30FC;&#x30AD;&#x30A2; RNAP &#x306E;&#x89E6;&#x5A92;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x523A;&#x6FC0;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;Super-stimulating &#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306E;&#x7BC4;&#x56F2;&#x3065;&#x3051;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x5C0F;&#x8AAC;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x5236;&#x9650;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7;&#x8EE2;&#x5199;&#x958B;&#x59CB;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x69CB;&#x9020;&#x8ABF;&#x67FB;&#x7D50;&#x679C;&#x306E;&#x89E3;&#x91C8;&#x3057;&#x3001;RNAP TFIIB &#x30EA;&#x30F3;&#x30AB;&#x30FC; &#x30A4;&#x30F3;&#x30BF;&#x30FC;&#x30D5;&#x30A7;&#x30A4;&#x30B9;&#x306E;&#x3088;&#x308A;&#x9AD8;&#x3044;&#x89E3;&#x50CF;&#x5EA6;&#x69CB;&#x9020;&#x306B;&#x5411;&#x3051;&#x3066;&#x306E;&#x9053;&#x3092;&#x958B;&#x304F;&#x306B;&#x5F79;&#x7ACB;&#x3061;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

TFIIB &#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

TFIIB &#xB9C1;&#xCEE4; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; archaeal RNAP&#xC758; &#xCD09;&#xB9E4; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xC790;&#xADF9;. Super-stimulating &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC758; &#xBC94;&#xC704; characterising &#xC5EC; &#xC804;&#xC0AC; &#xAC1C;&#xC2DC;&#xC758; &#xC18C;&#xC124; &#xC18D;&#xB3C4; &#xC81C;&#xD55C; &#xB2E8;&#xACC4; &#xD30C;&#xC545;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; &#xAD6C;&#xC870; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xACB0;&#xACFC; &#xD574;&#xC11D; &#xBC0F; RNAP-TFIIB &#xB9C1;&#xCEE4; &#xC778;&#xD130;&#xD398;&#xC774;&#xC2A4;&#xC758; &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; &#xB354; &#xB192;&#xC740; &#xAD6C;&#xC870;&#xB97C; &#xD5A5;&#xD574; &#xAE38;&#xC744; &#xD3EC;&#xC7A5; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xB3C4;&#xC6C0;&#xC774;.

TFIIB&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xACF5;&#xAC1C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

El dominio de vinculador TFIIB estimula la actividad catal&iacute;tica de archaeal RNAP. Por la caracterizaci&oacute;n de una serie de mutantes Super-estimular identificamos un novela paso de limitaci&oacute;n de velocidad en la iniciaci&oacute;n de la transcripci&oacute;n. Nuestros resultados ayudan a interpretar los hallazgos estructurales y allanar el camino hacia estructuras de mayor resoluci&oacute;n de la interfaz de vinculador ARNP-TFIIB.

Revelando las funciones de TFIIB.

TFIIB &#x94FE;&#x63A5;&#x5668;&#x57DF;&#x523A;&#x6FC0;&#x53E4; RNAP &#x7684;&#x50AC;&#x5316;&#x6D3B;&#x6027;&#x3002;&#x901A;&#x8FC7;&#x5B9A;&#x6027;&#x7684; super-stimulating &#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x7684;&#x8303;&#x56F4;&#x6211;&#x4EEC;&#x786E;&#x5B9A;&#x8F6C;&#x5F55;&#x8D77;&#x59CB;&#x7684;&#x4E00;&#x79CD;&#x65B0;&#x578B;&#x901F;&#x7387;&#x9650;&#x5236;&#x6B65;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x6709;&#x52A9;&#x4E8E;&#x89E3;&#x91CA;&#x7ED3;&#x6784;&#x8C03;&#x67E5;&#x7ED3;&#x679C;&#x4E0E;&#x9AD8;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x7ED3;&#x6784;&#x7684; RNAP TFIIB &#x94FE;&#x63A5;&#x5668;&#x63A5;&#x53E3;&#x94FA;&#x5E73;&#x3002;

Simone C. Wiesler

Department of Life Sciences

Imperial College London

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Simone C. Wiesler

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}Department of Life Sciences

Imperial College London

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Department of Life Sciences