Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

University of Pittsburgh School of Medicine

We describe a scheme for tagging an alanine-based peptide with a Cu(II) and a nitroxide to measure unfolding transitions. The enhancement in longitudinal relaxation rate of the nitroxide due to the presence of Cu(II) was measured at physiological temperatures by pulsed electron spin resonance (ESR). The change in relaxation rate provided the average interspin distance between the Cu(II) and the nitroxide. Control experiments on a proline-based peptide verify the robustness of the method. The change in interspin distances with temperature for the alanine-based peptide is in accord with the change in helicity measured by circular dichroism. The data provide an opportunity to examine the unfolding process in polyalanine peptides. The distance in the folded state is in concordance with molecular dynamics. However, the ESR experiment measures an average distance of 17 A in the unfolded state, whereas molecular dynamics indicates a distance of 42 A if the unfolded geometry was a polyproline type II helix. Therefore, ESR demonstrates that the unfolded state of this alanine-based peptide is not an ideal extended polyproline type II helix.

Unfolding of alanine-based peptides using electron spin resonance distance measurements.

Les auteurs d&eacute;crivent un syst&egrave;me de marquage d&#39;un peptide ax&eacute;e sur l&#39;alanine avec un Cu (II) et un nitroxyde pour mesurer des transitions qui se d&eacute;roule. L&#39;am&eacute;lioration des taux de relaxation longitudinale de la nitroxyde due &agrave; la pr&eacute;sence de Cu (II) a &eacute;t&eacute; mesur&eacute;e &agrave; une temp&eacute;rature physiologique par r&eacute;sonance de spin des &eacute;lectrons &agrave; impulsion (ESR). La distance moyenne qu&#39;entre le Cu (II) et le nitroxyde a fourni le changement dans le taux de relaxation. Des exp&eacute;riences de contr&ocirc;le sur un peptide proline-bas&eacute; v&eacute;rifier la robustesse de la m&eacute;thode. Le changement de distances qu&#39;avec la temp&eacute;rature pour le peptide ax&eacute;e sur l&#39;alanine est en accord avec le changement de l&#39;h&eacute;licit&eacute; mesur&eacute;e par dichro&iuml;sme circulaire. Les donn&eacute;es fournissent l&#39;occasion d&#39;examiner le processus qui se d&eacute;roule en peptides de polyalanine. La distance dans l&#39;&eacute;tat repli&eacute; est en concordance avec la dynamique mol&eacute;culaire. Toutefois, l&#39;exp&eacute;rience de l&#39;ESR mesure une distance moyenne de 17 A &agrave; l&#39;&Eacute;tat, alors que la dynamique mol&eacute;culaire indique une distance de 42 A, si la g&eacute;om&eacute;trie d&eacute;pli&eacute;e &eacute;tait h&eacute;lice polyproline type II. Par cons&eacute;quent, ESR montre que l&#39;&eacute;tat d&eacute;pli&eacute; de ce peptide ax&eacute;e sur l&#39;alanine n&#39;est pas une h&eacute;lice II de type id&eacute;al polyproline prolong&eacute;e.

D&eacute;pliage des peptides ax&eacute;e sur l&#39;alanine &agrave; l&#39;aide de mesures distance de r&eacute;sonance de spin &eacute;lectronique.

Descriviamo un regime per la codifica di un peptide di alanina-based con una cu e un nitrossido per misurare le transizioni dispiegarsi. Il miglioramento nel tasso di rilassamento longitudinale del nitrossido a causa della presenza di cu &egrave; stato misurato a temperature fisiologiche di risonanza di spin di elettroni pulsato (ESR). Il cambiamento nel tasso di relax fornito la distanza media di interspin tra il cu e il nitrossido. Esperimenti di controllo su un peptide prolina-based verificare la robustezza del metodo. Il cambiamento nelle distanze interspin con la temperatura per il peptide alanina-based &egrave; in accordo con il cambiamento di elicit&agrave; misurata di Dicroismo circolare. I dati forniscono l&#39;opportunit&agrave; di esaminare il processo di unfolding in polyalanine peptidi. La distanza nello stato piegato &egrave; in concordanza con dinamica molecolare. Tuttavia, l&#39;esperimento di ESR misura una distanza media di 17 A nello stato dispiegato, considerando che la dinamica molecolare indica una distanza di 42 A se la geometria spiegata era un&#39;elica di polyproline tipo II. Pertanto, ESR dimostra che lo stato spiegato di questo peptide alanina-based non &egrave; un&#39;elica di polyproline estesa ideale tipo II.

Svolgimento dei peptidi alanina-based utilizzando misurazioni delle distanze di electron spin resonance.

The aggregated state of amyloid-beta peptide in vitro depends on Cu2+ ion concentration.

L&#39;&eacute;tat agr&eacute;g&eacute; du peptide b&ecirc;ta-amylo&iuml;de in vitro d&eacute;pend de la concentration en ions Cu2 +.

Lo stato aggregato del peptide beta-amiloide in vitro dipende dalla concentrazione di ioni Cu2 +.

The overall morphology and Cu(II) ion coordination for the aggregated amyloid-beta(1-40) [Abeta(1-40)] in N-ethylmorpholine (NEM) buffer are affected by Cu(II) ion concentration. This effect is investigated by transmission electron microscopy (TEM), atomic force microscopy (AFM), and electron spin echo envelope modulation (ESEEM) spectroscopy. At lower than equimolar concentrations of Cu(II) ions, fibrillar aggregates of Abeta(1-40) are observed. At these concentrations of Cu(II), the monomeric and fibrillar Abeta(1-40) ESEEM data indicate that the Cu(II) ion is coordinated by histidine residues. For aggregated Abeta(1-40) at a Cu(II):Abeta molar ratio of 2:1, TEM and AFM images show both linear fibrils and granular amorphous aggregates. The ESEEM spectra show that the multi-histidine coordination for Cu(II) ion partially breaks up and becomes exposed to water or exchangeable protons of the peptide at a higher Cu(II) concentration. Since the continuous-wave electron spin resonance results also suggest two copper-binding sites in Abeta(1-40), the proton ESEEM peak may arise from the second copper-binding site, which may be significantly involved in the formation of granular amorphous aggregates. Thioflavin T fluorescence and circular dichroism experiments also show that Cu(II) inhibits the formation of fibrils and induces a nonfibrillar beta-sheet conformation. Therefore, we propose that Abeta(1-40) has a second copper-binding site in a proton-rich environment and the second binding Cu(II) ion interferes with a conformational transition into amyloid fibrils, inducing the formation of granular amorphous aggregates.

The second Cu(II)-binding site in a proton-rich environment interferes with the aggregation of amyloid-beta(1-40) into amyloid fibrils.

La morphologie globale et la coordination d&#39;ion Cu (II) pour les agr&eacute;g&eacute;s amyloid-beta(1-40) [Abeta(1-40)] dans le tampon de la N-ethylmorpholine (NEM) sont affect&eacute;s par la concentration des ions Cu (II). Cet effet est &eacute;tudi&eacute; par microscopie &eacute;lectronique &agrave; transmission (TEM), microscopie &agrave; force atomique (AFM) et spectroscopie spin &eacute;cho enveloppe de modulation (ESEEM). &Agrave; plus faible que la concentration &eacute;quimolaire d&#39;ions Cu (II), agr&eacute;gats fibrillaires de Abeta(1-40) sont observ&eacute;s. Ces concentrations de Cu (II), les donn&eacute;es de Abeta(1-40) ESEEM monom&egrave;res et fibrillaires indiquent que l&#39;ion Cu (II) est coordonn&eacute;e par des r&eacute;sidus d&#39;histidine. Pour Abeta(1-40) agr&eacute;g&eacute;es &agrave; un Cu (II): Abeta rapport molaire de 2:1, TEM et AFM images montrent les fibrilles lin&eacute;aires et agr&eacute;gats amorphes granulaires. Le spectre ESEEM montre que la coordination multi-histidine pour ion Cu (II) rompt partiellement et qu&#39;il devient expos&eacute;e &agrave; l&#39;eau ou des protons &eacute;changeables du peptide &agrave; une concentration plus &eacute;lev&eacute;e de Cu (II). &Eacute;tant donn&eacute; que les r&eacute;sultats de r&eacute;sonance de spin &eacute;lectronique onde continue sugg&egrave;rent &eacute;galement deux sites de liaison cuivre dans Abeta(1-40), le pic ESEEM proton peut-&ecirc;tre d&eacute;couler le second site de liaison de cuivre, qui pourrait &ecirc;tre grandement impliqu&eacute; dans la formation d&#39;agr&eacute;gats amorphes granulaires. Fluorescence thioflavine T et des exp&eacute;riences de dichro&iuml;sme circulaire montrent &eacute;galement que le Cu (II) inhibe la formation de fibrilles et induit une conformation de b&ecirc;ta-feuille de nonfibrillar. Par cons&eacute;quent, nous proposons que Abeta(1-40) a un site de deuxi&egrave;me liaison cuivre dans un environnement riche en protons et la deuxi&egrave;me liaison ionique de Cu (II) interf&egrave;re avec une transition conformationnelle en fibrilles amylo&iuml;des, induisant la formation d&#39;agr&eacute;gats amorphes granulaires.

Le deuxi&egrave;me site de liaison Cu II dans un environnement riche en protons interf&egrave;re avec l&#39;agr&eacute;gation de amyloid-beta(1-40) en fibrilles amylo&iuml;des.

La morfologia generale e il coordinamento dello ione cu per l&#39;aggregato amyloid-beta(1-40) [Abeta(1-40)] nel buffer di N-ethylmorpholine (NEM) sono interessati dalla concentrazione di ioni cu. Questo effetto &egrave; indagato da microscopia elettronica della trasmissione (TEM), microscopia a forza atomica (AFM) e spettroscopia dell&#39;elettrone spin echo busta modulazione (ESEEM). A inferiore a concentrazioni equimolari di ioni cu, si osservano aggregati fibrillare di Abeta(1-40). A queste concentrazioni di cu, i dati di Abeta(1-40) ESEEM monomerici e fibrillare indicano che lo ione cu &egrave; coordinato da residui di istidina. Per Abeta(1-40) aggregati a un Cu (II): Abeta rapporto molare di 2:1, TEM e AFM immagini mostrano sia fibrille lineari e aggregati granulari amorfi. Gli spettri ESEEM mostrano che il coordinamento multi-histidine per ioni cu parzialmente rompe e diventa esposti all&#39;acqua o protoni scambiabili del peptide a una maggiore concentrazione di cu. Poich&eacute; i risultati di risonanza spin di un elettrone suggeriscono anche due siti di legame di rame in Abeta(1-40), il picco ESEEM protone possa sorgere dal secondo sito rame-associazione, che possa essere significativamente coinvolti nella formazione di aggregati granulari amorfi. Fluorescenza Thioflavin T e Dicroismo circolare esperimenti mostrano anche che cu inibisce la formazione di fibrille e induce una conformazione beta-foglio nonfibrillar. Pertanto, noi proponiamo che Abeta(1-40) &egrave; un sito di legame secondo rame in un ambiente ricco di protone e la seconda associazione ioni cu interferisce con una transizione conformazionale in fibrille amiloidi, che inducono la formazione di aggregati granulari amorfi.

Il secondo sito di legame Cu II in un ambiente ricco di protoni interferisce con l&#39;aggregazione di amyloid-beta(1-40) in fibrille amiloidi.

Tomografia Cryo-elettrone (cryoET) permette la visualizzazione 3D di strutture cellulari con risoluzione molecolare in uno stato vicino al codice nativo e quindi ha il potenziale per contribuire a delucidare eventi precoce dell&#39;infezione da HIV-1 in cellule ospiti. Tuttavia, dettagli strutturali dell&#39;infezione HIV-1 non sono state osservate, a causa di sfide tecnologiche nella lavorazione con rare e dinamici particelle di HIV-1 nelle cellule umane. Riportiamo l&#39;analisi strutturale delle interazioni dell&#39;HIV-1 e cellula ospite mediante un correlativo ad alta velocit&agrave; 3D live-cella-imaging e cryoET Metodo. Utilizzando questo metodo, vi abbiamo mostrato in condizioni quasi nativa che hyperstable intatta mutante nuclei di HIV-1 sono rilasciati nel citoplasma delle cellule ospiti. Abbiamo ottenuto ulteriori prove dirette a suggerire che un hyperstable mutante capside, E45A, ha mostrato lo smontaggio del capside ritardato rispetto al capside del selvaggio-tipo. Insieme, questi risultati dimostrano i vantaggi del nostro vivere-cella correlativo e cryoET approccio per processi dinamici, quali infezioni virali di imaging.

Visualizzazione diretta di HIV-1 con correlativa Tomografia di microscopia e cryo-elettrone live-cella.

&#x4F4E;&#x6E29;&#x7535;&#x5B50;&#x65AD;&#x5C42;&#x626B;&#x63CF; (cryoET) &#x5728;&#x5173;&#x95ED;&#x5230;&#x672C;&#x673A;&#x72B6;&#x6001;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x5141;&#x8BB8;&#x7684;&#x8702;&#x7A9D;&#x7ED3;&#x6784;&#x7684; 3D &#x53EF;&#x89C6;&#x5316;&#xFF0C;&#x56E0;&#x6B64;&#x5177;&#x6709;&#x7684;&#x6F5C;&#x529B;&#xFF0C;&#x5E2E;&#x52A9;&#x6F84;&#x6E05;&#x5728;&#x5BBF;&#x4E3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x7684; hiv-1 &#x611F;&#x67D3;&#x7684;&#x65E9;&#x671F;&#x4E8B;&#x4EF6;&#x3002;&#x4F46;&#x662F;&#xFF0C;&#x611F;&#x67D3;&#x827E;&#x6ECB;&#x75C5;&#x6BD2; 1 &#x7ED3;&#x6784;&#x7EC6;&#x8282;&#x5E76;&#x672A;&#x5F97;&#x5230;&#x9075;&#x5B88;&#xFF0C;&#x7531;&#x4E8E;&#x73CD;&#x7A00;&#x52A8;&#x6001;&#x827E;&#x6ECB;&#x75C5;&#x6BD2; 1 &#x7C92;&#x5B50;&#x5728;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x4E0E;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x4E2D;&#x7684;&#x6280;&#x672F;&#x96BE;&#x9898;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x901A;&#x8FC7;&#x4F7F;&#x7528;&#x76F8;&#x5173;&#x7684;&#x9AD8;&#x901F; 3D &#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6210;&#x50CF;&#x548C; cryoET &#x65B9;&#x6CD5;&#x62A5;&#x544A;&#x827E;&#x6ECB;&#x75C5;&#x6BD2; 1 &#x4E0E;&#x5BBF;&#x4E3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x5206;&#x6790;&#x3002;&#x4F7F;&#x7528;&#x8FD9;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x663E;&#x793A;&#x672C;&#x673A;&#x9644;&#x8FD1;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#xFF0C;&#x4E0D;&#x53D8;&#x7684;&#x8D85;&#x7A33;&#x5B9A;&#x7A81;&#x53D8;&#x827E;&#x6ECB;&#x75C5;&#x6BD2; 1 &#x82AF;&#x88AB;&#x91CA;&#x653E;&#x5230;&#x5BBF;&#x4E3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x4E2D;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x83B7;&#x5F97;&#x76F4;&#x63A5;&#x7684;&#x8BC1;&#x636E;&#x8868;&#x660E;&#xFF0C;&#x8D85;&#x7A33;&#x5B9A;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x8863;&#x58F3;&#xFF0C;E45A&#xFF0C;&#x663E;&#x793A;&#x5EF6;&#x8FDF;&#x7684;&#x8863;&#x58F3;&#x53CD;&#x6C47;&#x7F16;&#x76F8;&#x6BD4;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;&#x8863;&#x58F3;&#x3002;&#x5171;&#x540C;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x76F8;&#x5173;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x548C;&#x6210;&#x50CF;&#x52A8;&#x6001;&#x8FDB;&#x7A0B;&#xFF0C;&#x5982;&#x75C5;&#x6BD2;&#x6027;&#x611F;&#x67D3; cryoET &#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x4F18;&#x70B9;&#x3002;

&#x76F4;&#x63A5;&#x53EF;&#x89C6;&#x5316;&#x7684;&#x827E;&#x6ECB;&#x75C5;&#x6BD2; 1 &#x76F8;&#x5173;&#x7684;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x548C;&#x4F4E;&#x6E29;&#x7535;&#x5B50;&#x65AD;&#x5C42;&#x626B;&#x63CF;&#x3002;

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-native state and therefore has the potential to help elucidate early events of HIV-1 infection in host cells. However, structural details of infecting HIV-1 have not been observed, due to technological challenges in working with rare and dynamic HIV-1 particles in human cells. Here, we report structural analysis of HIV-1 and host-cell interactions by means of a correlative high-speed 3D live-cell-imaging and cryoET method. Using this method, we showed under near-native conditions that intact hyperstable mutant HIV-1 cores are released into the cytoplasm of host cells. We further obtained direct evidence to suggest that a hyperstable mutant capsid, E45A, showed delayed capsid disassembly compared to the wild-type capsid. Together, these results demonstrate the advantages of our correlative live-cell and cryoET approach for imaging dynamic processes, such as viral infection.

Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography.

Cryo-tomographie &#xE9;lectronique (cryoET) permet la visualisation 3D des structures cellulaires &#xE0; la r&#xE9;solution mol&#xE9;culaire dans un &#xE9;tat proche de l&#x26;#39;origine et a donc le potentiel pour aider &#xE0; &#xE9;lucider les &#xE9;v&#xE9;nements pr&#xE9;coces de l&#x26;#39;infection VIH-1 dans les cellules h&#xF4;tes. Cependant, les d&#xE9;tails structurels de l&#x26;#39;infection VIH-1 n&#x26;#39;ont pas &#xE9;t&#xE9; observ&#xE9;es, en raison de probl&#xE8;mes technologiques dans le travail avec de rares et dynamique du VIH-1 particules dans les cellules humaines. Ici, nous rapportons l&#x26;#39;analyse structurale du VIH-1 et la cellule h&#xF4;te interactions au moyen d&#x26;#39;un corr&#xE9;lative &#xE0; haute vitesse 3D des cellules vivantes d&#x26;#39;imagerie et de la m&#xE9;thode cryoET. En utilisant cette m&#xE9;thode, nous avons montr&#xE9; dans des conditions proches des conditions qui indig&#xE8;nes intactes hyperstable mutantes du VIH-1 sont des noyaux lib&#xE9;r&#xE9; dans le cytoplasme des cellules h&#xF4;tes. Nous avons en outre obtenu des preuves directes permettant de penser qu&#x26;#39;une capside hyperstable mutant, E45A, a montr&#xE9; le d&#xE9;montage retard&#xE9; capside par rapport &#xE0; la capside de type sauvage. Ensemble, ces r&#xE9;sultats d&#xE9;montrent les avantages de notre approche des cellules vivantes et cryoET corr&#xE9;lative des processus dynamiques d&#x26;#39;imagerie, telles que l&#x26;#39;infection virale.

Visualisation directe du VIH-1 avec corr&#xE9;lative des cellules vivantes en microscopie et microscopie cryo-&#xE9;lectronique

Cryo-Elektron Tomographie (CryoET) erm&ouml;glicht die 3D Visualisierung von Zellstrukturen Molekulare Aufl&ouml;sung in einem Ende-zu-nativ-Zustand und hat somit das Potenzial, zur fr&uuml;hen Ereignisse von HIV-1 Infektion in Wirtszellen zu erhellen. Jedoch wurden strukturelle Details f&uuml;r die HIV-1 Infektion nicht, aufgrund der technologischen Herausforderungen im Umgang mit seltenen und dynamische HIV-1-Partikel in den menschlichen Zellen beobachtet. Hier berichten wir Strukturanalyse von HIV-1 und Host-Zell-Interaktionen durch eine Korrelative Hochgeschwindigkeits-3D live-Cell-Imaging und CryoET Methode. Mit dieser Methode, unter fast Native Bedingungen zeigten wir, dass intakte Hyperstable werden mutant HIV-1-Kerne in das Zytoplasma der Wirtszellen abgegeben. Wir erhielten weitere direkte Hinweise darauf, dass ein Hyperstable mutant Kapsid, E45A, zeigte im Vergleich zu Wildtyp-Kapsid verz&ouml;gerte Kapsid-Demontage. Diese Ergebnisse werden gemeinsam die Vorteile unserer Korrelative Leben-Zelle und CryoET Ansatz f&uuml;r imaging-dynamische Prozesse, wie virale Infektion.

Direkte Visualisierung der HIV-1 mit Korrelative Mikroskopie und Cryo-Elektron Tomographie von Leben-Zelle.

&#x4F4E;&#x6E29;&#x96FB;&#x5B50;&#x65AD;&#x5C64;&#x64AE;&#x5F71;&#x6CD5;&#xFF08;cryoET&#xFF09;&#x304C;&#x8FD1;&#x3044;&#x304B;&#x3089;&#x30CD;&#x30A4;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x72B6;&#x614B;&#x306E;&#x5206;&#x5B50;&#x5206;&#x89E3;&#x80FD;&#x3067;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;3&#x6B21;&#x5143;&#x53EF;&#x8996;&#x5316;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x3001;&#x5BBF;&#x4E3B;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x3067;HIV-1&#x611F;&#x67D3;&#x306E;&#x521D;&#x671F;&#x30A4;&#x30D9;&#x30F3;&#x30C8;&#x3092;&#x89E3;&#x660E;&#x3059;&#x308B;&#x306E;&#x306B;&#x5F79;&#x7ACB;&#x3064;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x3092;&#x79D8;&#x3081;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;HIV-1&#x611F;&#x67D3;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x8A73;&#x7D30;&#x306F;&#x3001;&#x30D2;&#x30C8;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x306F;&#x7A00;&#x306A;&#x3001;&#x52D5;&#x7684;&#x306A;HIV-1&#x7C92;&#x5B50;&#x3092;&#x6271;&#x3046;&#x969B;&#x306B;&#x6280;&#x8853;&#x7684;&#x306A;&#x8AB2;&#x984C;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x76F8;&#x95A2;&#x306E;&#x9AD8;&#x901F;3D&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30BB;&#x30EB;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x3068;cryoET&#x6CD5;&#x306B;&#x3088;&#x308A;HIV-1&#x3068;&#x5BBF;&#x4E3B;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x89E3;&#x6790;&#x3092;&#x5831;&#x544A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x305D;&#x306E;&#x307E;&#x307E;hyperstable&#x5909;&#x7570;HIV-1&#x30B3;&#x30A2;&#x304C;&#x5BBF;&#x4E3B;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x8CEA;&#x306B;&#x653E;&#x51FA;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x3001;&#x30CD;&#x30A4;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x306B;&#x8FD1;&#x3044;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x3067;&#x8A8D;&#x3081;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3055;&#x3089;&#x306B;hyperstable&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x30AB;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x3001;E45A&#x306F;&#x3001;&#x9045;&#x5EF6;&#x306F;&#x3001;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;&#x30AB;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x306B;&#x6BD4;&#x3079;&#x3066;&#x5206;&#x89E3;&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3059;&#x308B;&#x76F4;&#x63A5;&#x7684;&#x306A;&#x8A3C;&#x62E0;&#x3092;&#x5F97;&#x305F;&#x3002;&#x4E00;&#x7DD2;&#x306B;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x611F;&#x67D3;&#x306A;&#x3069;&#x306E;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30DF;&#x30C3;&#x30AF;&#x306A;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x3001;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x306E;&#x76F8;&#x95A2;&#x751F;&#x7D30;&#x80DE;&#x3068;cryoET&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306E;&#x5229;&#x70B9;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x9593;&#x306E;&#x76F8;&#x95A2;&#x304C;&#x751F;&#x7D30;&#x80DE;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x3068;&#x30AF;&#x30E9;&#x30A4;&#x30AA;&#x96FB;&#x5B50;&#x7DDA;&#x30C8;&#x30E2;&#x30B0;&#x30E9;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#x306B;&#x3088;&#x308B;HIV-1&#x306E;&#x76F4;&#x63A5;&#x53EF;&#x8996;&#x5316;

&#xACF3;&#xC744; &#xC54C;&#xC544;&#xB0B4;&#xB294;-&#xC804;&#xC790; &#xB2E8;&#xCE35; (cryoET) &#xAC00;&#xAE4C;&#xC6B4; &#xAE30;&#xBCF8; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBD84;&#xC790; &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; &#xC138;&#xD3EC; &#xAD6C;&#xC870;&#xC758; 3D &#xC2DC;&#xAC01;&#xD654;&#xB97C; &#xD5C8;&#xC6A9; &#xD558; &#xACE0; &#xB530;&#xB77C;&#xC11C; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xC5D0;&#xC774;&#xC988;-1 &#xAC10;&#xC5FC;&#xC758; &#xCD08;&#xAE30; &#xC774;&#xBCA4;&#xD2B8;&#xB97C; &#xBA85;&#xB8CC; &#xD558; &#xAC8C; &#xB3C4;&#xC6C0;&#xC744; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC774; &#xC788;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xC5D0;&#xC774;&#xC988;-1 &#xAC10;&#xC5FC;&#xC758; &#xC138;&#xBD80; &#xAD6C;&#xC870; &#xD558;&#xC9C0; &#xAD00;&#xCC30; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;, &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xC5D0;&#xC774;&#xC988;-1 &#xC785;&#xC790; &#xD76C;&#xADC0; &#xD558; &#xACE0; &#xB3D9;&#xC801; &#xC791;&#xC5C5;&#xC758; &#xAE30;&#xC220; &#xACFC;&#xC81C; &#xB54C;&#xBB38;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC0C1;&#xD638; &#xACE0;&#xC18D; 3D &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; &#xBC0F; cryoET &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xAD6C;&#xC870; &#xD574;&#xC11D; &#xBC0F; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xC138;&#xD3EC; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xBCF4;&#xACE0;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xADF8;&#xB300;&#xB85C; hyperstable &#xADFC;&#xCC98;-&#xB124;&#xC774;&#xD2F0;&#xBE0C; &#xC870;&#xAC74;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0B4;&#xD3B4;&#xBCF8; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; HIV 1 &#xCF54;&#xC5B4; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xC138;&#xD3EC;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xD574;&#xC81C; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xB354; &#xC9C1;&#xC811;&#xC801;&#xC778; &#xC99D;&#xAC70;&#xB97C; &#xC81C;&#xC548; &#xD558;&#xB294; hyperstable &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; capsid, E45A, &#xC57C;&#xC0DD;-&#xD0C0;&#xC785; capsid&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xC9C0;&#xC5F0;&#xB41C; capsid &#xB514;&#xC2A4;&#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC5BB;&#xC744;. &#xD568;&#xAED8;, &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C; &#xC140; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xAC10;&#xC5FC; &#xB4F1;&#xC758; &#xB3D9;&#xC801; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;&#xB97C; &#xC704;&#xD55C; cryoET &#xBC29;&#xBC95;&#xC758; &#xC7A5;&#xC810;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC0C1;&#xD638; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C; &#xC140; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xAC80;&#xC0AC; &#xBC95; &#xBC0F; &#xACF3;&#xC744; &#xC54C;&#xC544;&#xB0B4;&#xB294;-&#xC804;&#xC790; &#xB2E8;&#xCE35; &#xCD2C;&#xC601;&#xACFC; V 1&#xC758; &#xC9C1;&#xC811; &#xC2DC;&#xAC01;&#xD654;.

Cryo-tomograf&#xED;a electr&#xF3;nica (cryoET) permite la visualizaci&#xF3;n en 3D de las estructuras celulares con resoluci&#xF3;n molecular en un estado cercano al nativo y por lo tanto, tiene el potencial para ayudar a esclarecer los acontecimientos iniciales de la infecci&#xF3;n VIH-1 en las c&#xE9;lulas hu&#xE9;sped. Sin embargo, los detalles estructurales de infectar el VIH-1 no se han observado, debido a problemas tecnol&#xF3;gicos en el trabajo con raras y din&#xE1;mica del VIH-1 part&#xED;culas en las c&#xE9;lulas humanas. Aqu&#xED;, se presenta el an&#xE1;lisis estructural del VIH-1 y las interacciones c&#xE9;lula hu&#xE9;sped por medio de un correlativo de alta velocidad 3D en vivo de c&#xE9;lulas de im&#xE1;genes y m&#xE9;todo cryoET. El uso de este m&#xE9;todo, se mostr&#xF3; en condiciones pr&#xF3;ximas a las condiciones que nativos intactos hiperestable mutantes del VIH-1 n&#xFA;cleos son liberados en el citoplasma de las c&#xE9;lulas hu&#xE9;sped. Hemos obtenido m&#xE1;s evidencia directa que sugiera que un hiperestable c&#xE1;pside mutante, E45A, mostr&#xF3; retrasa el desmontaje c&#xE1;pside en comparaci&#xF3;n con la c&#xE1;pside de tipo salvaje. En conjunto, estos resultados ponen de manifiesto las ventajas de nuestro enfoque correlato en vivo de las c&#xE9;lulas y cryoET de im&#xE1;genes de procesos din&#xE1;micos, como la infecci&#xF3;n viral.

Sangmi Jun

Department of Structural Biology

University of Pittsburgh School of Medicine

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Sangmi Jun

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}Department of Structural Biology

University of Pittsburgh School of Medicine

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Department of Structural Biology