Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Royal Institute of Technology

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&#x5355;&#x6B65;&#x6267;&#x884C;&#x6062;&#x590D;&#x548C;&#x4F7F;&#x7528;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x5206;&#x79BB;&#x7EAF;&#x5316;&#x6807;&#x8BB0;&#x7684;&#x5305;&#x6DB5;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D;&#x56FA;&#x76F8;&#x590D;&#x6027;&#x3002;

A strategy for purification of inclusion body-forming proteins is described, in which the positively charged domain Z(basic) is used as a fusion partner for capture of denatured proteins on a cation exchange column. It is shown that the purification tag is selective under denaturing conditions. Furthermore, the new strategy for purification of proteins from inclusion bodies is compared with the commonly used method for purification of His(6)-tagged inclusion body proteins. Finally, the simple and effective means of target protein capture provided by the Z(basic) tag is further successfully explored for solid-phase refolding. This procedure has the inherited advantage of combining purification and refolding in one step and offers the advantage of eluting the concentrated product in a suitable buffer.

Single-step recovery and solid-phase refolding of inclusion body proteins using a polycationic purification tag.

Une strat&#xE9;gie pour la purification d&#x26;#39;inclusion corps formant prot&#xE9;ines est d&#xE9;crite, dans lequel le domaine &#xE0; charge positive Z (base) est utilis&#xE9; en tant que partenaire de fusion pour la capture de prot&#xE9;ines d&#xE9;natur&#xE9;es sur une colonne &#xE9;changeuse de cations. Il est montr&#xE9; que l&#x26;#39;&#xE9;tiquette de purification est s&#xE9;lective dans des conditions d&#xE9;naturantes. En outre, la nouvelle strat&#xE9;gie pour la purification de prot&#xE9;ines &#xE0; partir de corps d&#x26;#39;inclusion est compar&#xE9;e &#xE0; la m&#xE9;thode couramment utilis&#xE9;e pour la purification de ses (6)-prot&#xE9;ines marqu&#xE9;es corps d&#x26;#39;inclusion. Enfin, les moyens simples et efficaces de prot&#xE9;ine cible capturer fournie par le Z (de base) tag est encore explor&#xE9; avec succ&#xE8;s en phase solide pour le repliement. Cette proc&#xE9;dure pr&#xE9;sente l&#x26;#39;avantage de combiner h&#xE9;rit&#xE9; de purification et de repliement en une seule &#xE9;tape et offre l&#x26;#39;avantage d&#x26;#39;&#xE9;lution du produit concentr&#xE9; dans un tampon appropri&#xE9;.

Une seule &#xE9;tape et en phase solide repliement de prot&#xE9;ines de l&#x26;#39;organisme d&#x26;#39;inclusion en utilisant une &#xE9;tiquette de purification polycationique

Eine Strategie f&uuml;r die Reinigung der Einschlussk&ouml;rper-bildende Proteine wird beschrieben, in dem die positiv geladene Dom&auml;ne Z(basic) als Fusion Partner f&uuml;r die Erfassung der denaturierten Proteine auf ein Kat-Spalte verwendet wird. Es wird gezeigt, dass das Reinigung-Tag unter Denaturierung Bedingungen selektiv. Dar&uuml;ber hinaus ist die neue Strategie f&uuml;r die Aufreinigung von Proteinen aus Einschlussk&ouml;rperchen gegen&uuml;ber der h&auml;ufig verwendete Methode zur Reinigung von seinem (6)-Einschlussk&ouml;rper Proteine markiert. Schlie&szlig;lich ist die einfache und effektive Mittel Ziel Protein Capture bereitgestellt durch das Z(basic)-Tag weiter erfolgreich f&uuml;r Festphasen-R&uuml;ckfaltung untersucht. Dieses Verfahren hat den geerbten Vorteil der Kombination von Reinigung und R&uuml;ckfaltung in einem Schritt und bietet den Vorteil der eluting Konzentrat in einem geeigneten Puffer.

Recovery in einem Schritt und Festphasen-R&uuml;ckfaltung Einschlussk&ouml;rper Proteine mit einen Polycationic-Reinigung-Tag.

Una strategia per la purificazione delle proteine che formano l&#39;inclusione corpo &egrave; descritto, in cui il dominio caricato positivamente Z(basic) &egrave; usato come partner di fusione per la cattura di proteine denaturate su una colonna a scambio cationico. Si &egrave; dimostrato che l&#39;etichetta di purificazione selettiva sotto condizioni di denaturazione. Inoltre, la nuova strategia per la purificazione delle proteine dai corpi di inclusione viene confrontata con il metodo comunemente usato per purificazione del suo (6)-tagged inclusione corpo proteine. Infine, semplici ed efficaci mezzi di cattura della proteina target fornito dal tag Z(basic) ulteriormente sono esplorato con successo per la fase solida ripiegamento. Questa procedura ha il vantaggio ereditato di combinazione di purificazione e di ripiegamento in un unico passaggio e offre il vantaggio di eluizione del prodotto concentrato in un buffer adatto.

Single-step recupero e fase solida ripiegamento di proteine inclusione corpo utilizzando un tag di purificazione polycationic.

Una estrategia para la purificaci&#xF3;n de inclusi&#xF3;n que forman el cuerpo prote&#xED;nas se describe, en el que la carga positiva de dominio Z (b&#xE1;sico) se utiliza como una pareja de fusi&#xF3;n para la captura de las prote&#xED;nas desnaturalizadas en una columna de intercambio cati&#xF3;nico. Se muestra que la etiqueta de purificaci&#xF3;n es selectiva en condiciones desnaturalizantes. Adem&#xE1;s, la nueva estrategia para la purificaci&#xF3;n de prote&#xED;nas a partir de cuerpos de inclusi&#xF3;n se compara con el m&#xE9;todo com&#xFA;nmente utilizado para la purificaci&#xF3;n de His (6) de etiquetado prote&#xED;nas cuerpos de inclusi&#xF3;n. Por &#xFA;ltimo, el medio sencillo y eficaz de prote&#xED;na diana de captura proporcionada por la Z (b&#xE1;sico) etiqueta es m&#xE1;s explorado con &#xE9;xito para la fase s&#xF3;lida replegado. Este procedimiento tiene la ventaja de combinar heredado purificaci&#xF3;n y replegamiento en un paso y ofrece la ventaja de eluyendo el producto concentrado en un tamp&#xF3;n adecuado.

Un solo paso de recuperaci&#xF3;n y en fase s&#xF3;lida el repliegue de las prote&#xED;nas del cuerpo de inclusi&#xF3;n usando una etiqueta de Purificaci&#xF3;n policati&#xF3;nico

&#x5236;&#x5B9A;&#x4E86;&#x4E00;&#x79CD;&#x4F7F;&#x7528; Z(basic) &#x6807;&#x8BB0;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x7684;&#x9AD8;&#x901A;&#x91CF;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7EAF;&#x5316;&#x6218;&#x7565;&#x3002;&#x4E3A;&#x4E86;&#x4F7F;&#x6709;&#x7528;&#x7684;&#x6218;&#x7565;&#x65E2;&#x4E3A;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x548C;&#x4E0D;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x3001; denaturating &#x5242;&#x3001; &#x5C3F;&#x7D20;&#x3001; &#x4E2D;&#x4F7F;&#x7528;&#x4E86;&#x6240;&#x6709;&#x7684;&#x7EAF;&#x5316;&#x6B65;&#x9AA4;&#x3002;&#x7B2C;&#x4E00;&#xFF0C;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x57FA;&#x56E0;&#x7535;&#x7194;&#x4E8E;&#x7EAF;&#x5316;&#x6807;&#x7B7E;&#xFF0C;Z(basic) &#x7684;&#x56DB;&#x4E2A;&#x76EE;&#x6807;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x6784;&#x9020;&#xFF0C;&#x51C0;&#x5316;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x4EA4;&#x6362;&#x8272;&#x8C31;&#x6CD5;&#x548C;&#x6D17;&#x8131;&#x7528;&#x76D0;&#x7684;&#x6E10;&#x53D8;&#x3002;&#x53D6;&#x5F97;&#x7684;&#x6570;&#x636E;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x7EAF;&#x5316;&#x6218;&#x7565;&#x8BA1;&#x5212;&#x5305;&#x62EC;&#x9636;&#x6BB5;&#x6D17;&#x8131;&#xFF0C;&#x4F7F;&#x5E73;&#x884C;&#x86CB;&#x767D;&#x7EAF;&#x5316;&#x4F7F;&#x7528;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#x673A;&#x5668;&#x4EBA;&#x3002;&#x4E00;&#x79CD;&#x534F;&#x8BAE;&#xFF0C;&#x4E00;&#x5207;&#x90FD;&#x4E0D;&#x9700;&#x8981;&#x4EFB;&#x4F55;&#x4F53;&#x529B;&#x5904;&#x7406;&#x64CD;&#x4F5C;&#x7684;&#x6B65;&#x9AA4;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC;&#x6240;&#x6709;&#x6B65;&#x9AA4;&#x3001; &#x8272;&#x8C31;&#x6CD5;&#x6811;&#x8102;&#x7684;&#x5747;&#x8861;&#x3001; &#x793A;&#x4F8B;&#x3001; &#x6D17;&#x51C0;&#xFF0C;&#x548C;&#x6D17;&#x8131;&#xFF0C;&#x8D1F;&#x8F7D;&#x662F;&#x7531;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#x673A;&#x5668;&#x4EBA;&#x5904;&#x7406;&#x3002;&#x8BE5;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x5141;&#x8BB8;&#x81EA;&#x52A8;&#x7684;&#x51C0;&#x5316;&#x7ED9;&#x6BEB;&#x514B;&#x5230; 60 &#x7EC6;&#x80DE;&#x88C2;&#x89E3;&#xFF0C;&#x7EAF;&#x91CD;&#x7EC4;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x91CF;&#x3002;&#x5728;&#x6B64;&#x7814;&#x7A76; 22 &#x4E0D;&#x540C;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#x673A;&#x5668;&#x4EBA;&#x6210;&#x529F;&#x7EAF;&#x5316;&#x6784;&#x9020;&#xFF0C;pI &#x548C;&#x6EB6;&#x89E3;&#x5EA6;&#xFF0C;&#x5173;&#x4E8E;&#x4E0D;&#x540C;&#x7279;&#x8272;&#x3002;&#x6570;&#x636E;&#x663E;&#x793A; Z(basic) &#x53EF;&#x4EE5;&#x7528;&#x4F5C;&#x4E00;&#x822C;&#x7EAF;&#x6807;&#x7B7E; denaturating &#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x4E5F;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x8BE5;&#x6218;&#x7565;&#x4F7F;&#x4E0D;&#x540C; pI &#x548C;&#x6EB6;&#x89E3;&#x5EA6;&#x4F7F;&#x7528;&#x79BB;&#x5B50;&#x4EA4;&#x6362;&#x8272;&#x8C31;&#x6CD5; (IEXC) &#x4E0E;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x5206;&#x79BB;&#x7EAF;&#x5316;&#x3002;&#x8BE5;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x662F;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x53EF;&#x91CD;&#x73B0;&#x548C;&#x5141;&#x8BB8;&#x9AD8;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x4EA7;&#x91CF;&#x548C;&#x7EAF;&#x5EA6;&#xFF0C;&#x56E0;&#x6B64;&#x826F;&#x597D;&#x8865;&#x5145;&#x5230;&#x5E38;&#x7528;&#x4ED6; 6 &#x6807;&#x8BB0;&#x3002;

&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x4EA4;&#x6362;&#x8272;&#x8C31;&#x7684;&#x4F7F;&#x7528; denaturating &#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x7684;&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#x86CB;&#x767D;&#x7EAF;&#x5316;&#x3002;

A high-throughput protein purification strategy using the polycationic Z(basic) tag has been developed. In order for the strategy to be useful both for soluble and less soluble proteins, a denaturating agent, urea, was used in all purification steps. First, four target proteins were genetically fused to the purification tag, Z(basic). These protein constructs were purified by cation exchange chromatography and eluted using a salt gradient. From the data achieved, a purification strategy was planned including stepwise elution to enable parallel protein purification using a laboratory robot. A protocol that includes all steps, equilibration of the chromatography resin, load of sample, wash, and elution, all without any manual handling steps, was handled by the laboratory robot. The program allows automated purification giving milligram amounts of pure recombinant protein of up to 60 cell lysates. In this study 22 different protein constructs, with different characteristics regarding pI and solubility, were successfully purified by the laboratory robot. The data show that Z(basic) can be used as a general purification tag also under denaturating conditions. Moreover, the strategy enables purification of proteins with different pI and solubility using ion exchange chromatography (IEXC). The procedure is highly reproducible and allows for high protein yield and purity and is therefore a good complement to the commonly used His(6)-tag.

High-throughput protein purification under denaturating conditions by the use of cation exchange chromatography.

Une strat&#xE9;gie &#xE0; haut d&#xE9;bit utilisant la purification des prot&#xE9;ines recombinantes polycationique Z (de base) tag a &#xE9;t&#xE9; d&#xE9;velopp&#xE9;. Pour que la strat&#xE9;gie visant &#xE0; &#xEA;tre utile &#xE0; la fois pour les prot&#xE9;ines solubles et moins soluble, un agent d&#xE9;naturant, l&#x26;#39;ur&#xE9;e, a &#xE9;t&#xE9; utilis&#xE9; dans toutes les &#xE9;tapes de purification. Tout d&#x26;#39;abord, quatre prot&#xE9;ines cibles ont &#xE9;t&#xE9; g&#xE9;n&#xE9;tiquement fusionn&#xE9; &#xE0; la balise de purification, Z (de base). Ces constructions de prot&#xE9;ines ont &#xE9;t&#xE9; purifi&#xE9;es par chromatographie d&#x26;#39;&#xE9;change cationique et &#xE9;lu&#xE9;e en utilisant un gradient de sel. A partir des donn&#xE9;es obtenues, une strat&#xE9;gie de purification a &#xE9;t&#xE9; planifi&#xE9;, y compris &#xE9;lution par &#xE9;tapes pour permettre la purification des prot&#xE9;ines parall&#xE8;le en utilisant un robot de laboratoire. Un protocole qui comprend toutes les &#xE9;tapes, &#xE9;quilibration de la r&#xE9;sine de chromatographie, la charge de l&#x26;#39;&#xE9;chantillon, les laver et d&#x26;#39;&#xE9;lution, le tout sans aucune mesure de manutention manuelle, a &#xE9;t&#xE9; trait&#xE9;e par le robot de laboratoire. Le programme permet la purification automatis&#xE9; donnant milligrammes de prot&#xE9;ine recombinante pure de jusqu&#x26;#39;&#xE0; 60 lysats cellulaires. Dans cette &#xE9;tude 22 constructions de prot&#xE9;ines diff&#xE9;rentes, avec des caract&#xE9;ristiques diff&#xE9;rentes concernant les pI et la solubilit&#xE9;, ont &#xE9;t&#xE9; avec succ&#xE8;s purifi&#xE9; par le robot de laboratoire. Les donn&#xE9;es montrent que Z (de base) peut &#xEA;tre utilis&#xE9; comme une &#xE9;tiquette de purification g&#xE9;n&#xE9;rale a &#xE9;galement dans des conditions d&#xE9;naturantes. En outre, la strat&#xE9;gie permet la purification des prot&#xE9;ines de pI diff&#xE9;rent et la solubilit&#xE9; en utilisant chromatographie &#xE9;changeuse d&#x26;#39;ions (Iexc). La proc&#xE9;dure est tr&#xE8;s reproductible et permet pour le rendement &#xE0; haute valeur prot&#xE9;ique et de la puret&#xE9; et est donc un bon compl&#xE9;ment &#xE0; l&#x26;#39;couramment utilis&#xE9;s Son (6)-tag.

Purification des prot&#xE9;ines &#xE0; haut d&#xE9;bit dans des conditions d&#xE9;naturantes par l&#x26;#39;utilisation de chromatographie par &#xE9;change cationique

Eine Hochdurchsatz-Protein-Reinigung-Strategie mit der Polycationic Z(basic) Tag wurde entwickelt. Damit die Strategie, n&uuml;tzlich zu sein sowohl f&uuml;r l&ouml;sliche und weniger l&ouml;slichen Proteine, Denaturating Agent, Harnstoff, wurde verwendet bei allen Schritten der Reinigung. Erstens, vier Ziel-Proteine genetisch dem Reinigung-Tag, Z(basic) verschmolzen wurden. Diese Protein-Konstrukte wurden durch Kat-Chromatographie gereinigt und mit einem Salzen Farbverlauf eluiert. Aus den Daten erreicht war eine Reinigung-Strategie geplant, einschlie&szlig;lich schrittweise Elution um parallele Proteinreinigung mit einen Labor-Roboter zu aktivieren. Ein Protokoll, das umfasst alle Schritte, Auswuchten der Chromatographie-Harz, Belastung der Probe, Waschen und Elution, alles ohne jede Anleitung Umgang mit Schritten, wurde vom Labor Roboter behandelt. Das Programm erlaubt die automatisierte Reinigung Milligramm-Mengen von reinen rekombinantes Protein von bis zu 60 Zelllysate geben. In dieser Studie 22 verschiedenen Protein waren Konstrukte, mit unterschiedlichen Eigenschaften bez&uuml;glich pI und L&ouml;slichkeit, erfolgreich vom Labor Roboter gereinigt. Die Daten zeigen, dass Z(basic) als allgemeine Reinigung Tag auch unter Denaturating Bedingungen verwendet werden k&ouml;nnen. Dar&uuml;ber hinaus erm&ouml;glicht die Strategie Aufreinigung von Proteinen mit verschiedenen pI und L&ouml;slichkeit mit Ionenaustauschchromatographie (IEXC). Das Verfahren ist sehr reproduzierbar und erm&ouml;glicht hohen Protein-Ausbeute und Reinheit und ist daher eine gute Erg&auml;nzung zu den h&auml;ufig verwendeten seine 6-Tag.

Hochdurchsatz Proteinreinigung unter Denaturating Bedingungen durch den Einsatz von Kat-Chromatographie.

Ha sviluppata una strategia di purificazione proteina ad alta velocit&agrave; utilizzando il polycationic tag Z(basic). In ordine per la strategia di essere utile sia per le proteine solubili e meno solubili, un agente denaturating, urea, che &egrave; stato utilizzato in tutte le fasi di purificazione. Prima destinazione quattro proteine geneticamente sono stati fusi per l&#39;etichetta di purificazione, Z(basic). Questi costrutti della proteina sono stati purificati mediante cromatografia a scambio cationico ed eluita mediante un gradiente di salato. Dai dati ottenuti, &egrave; stata progettata una strategia di purificazione compreso eluizione graduale per abilitare la purificazione della proteina parallela utilizzando un robot di laboratorio. Un protocollo che comprende tutti i passaggi, equilibrazione della resina cromatografia, carico di eluizione, campione e lavare tutto senza qualsiasi manuale di gestione di passaggi, &egrave; stato gestito dai robot laboratorio. Il programma permette di purificazione automatizzata d&agrave; quantit&agrave; milligrammi di pura proteina ricombinante di fino a 60 lisati cellulari. In questo studio 22 differenti della proteina costrutti, con caratteristiche diverse per quanto riguarda pI e solubilit&agrave;, con successo furono purificati dal robot laboratorio. I dati mostrano che il Z(basic) pu&ograve; essere utilizzato come un tag di purificazione generale anche in condizioni di denaturating. Inoltre, la strategia permette la purificazione delle proteine con differenti pI e solubilit&agrave; mediante cromatografia a scambio ionico (IEXC). La procedura &egrave; altamente riproducibile e permette di proteine ad alto rendimento e purezza e quindi &egrave; un buon complemento per il comunemente usato suo (6)-etichetta.

Purificazione della proteina ad alta velocit&agrave; in condizioni di denaturating tramite l&#39;uso della cromatografia a scambio cationico.

&#x30DD;&#x30EA;&#x30AB;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;Z&#xFF08;&#x57FA;&#x672C;&#xFF09;&#x30BF;&#x30B0;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;&#x306A;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x7CBE;&#x88FD;&#x6226;&#x7565;&#x304C;&#x958B;&#x767A;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x53CA;&#x3073;&#x96E3;&#x6EB6;&#x6027;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3001;&#x5909;&#x6027;&#x5264;&#x3001;&#x5C3F;&#x7D20;&#x306B;&#x6709;&#x7528;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x6226;&#x7565;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x7CBE;&#x88FD;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x3067;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x307E;&#x305A;&#x3001;4&#x3064;&#x306E;&#x6A19;&#x7684;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;&#x3001;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;Z&#x306F;&#x3001;&#xFF08;&#x57FA;&#x672C;&#xFF09;&#x3001;&#x7CBE;&#x88FD;&#x30BF;&#x30B0;&#x3092;&#x878D;&#x5408;&#x3055;&#x305B;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x306F;&#x3001;&#x967D;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x4EA4;&#x63DB;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C8;&#x30B0;&#x30E9;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3057;&#x3001;&#x5869;&#x52FE;&#x914D;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x6EB6;&#x51FA;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x9054;&#x6210;&#x3057;&#x305F;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x304B;&#x3089;&#x3001;&#x7CBE;&#x88FD;&#x6226;&#x7565;&#x306F;&#x3001;&#x5B9F;&#x9A13;&#x30ED;&#x30DC;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x4E26;&#x5217;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x6BB5;&#x968E;&#x7684;&#x306B;&#x6EB6;&#x51FA;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x8A08;&#x753B;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7;&#x304C;&#x3001;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C8;&#x30B0;&#x30E9;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#x6A39;&#x8102;&#x306E;&#x5E73;&#x8861;&#x5316;&#x3001;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x306E;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C9;&#x3001;&#x6D17;&#x6D44;&#x3001;&#x6EB6;&#x51FA;&#x3001;&#x624B;&#x52D5;&#x306E;&#x51E6;&#x7406;&#x306E;&#x624B;&#x9806;&#x3092;&#x5B9F;&#x884C;&#x305B;&#x305A;&#x306B;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;&#x5B9F;&#x9A13;&#x5BA4;&#x306E;&#x30ED;&#x30DC;&#x30C3;&#x30C8;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x51E6;&#x7406;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30D7;&#x30ED;&#x30B0;&#x30E9;&#x30E0;&#x306F;&#x3001;60&#x7D30;&#x80DE;&#x30E9;&#x30A4;&#x30BB;&#x30FC;&#x30C8;&#x307E;&#x3067;&#x306E;&#x7D14;&#x7C8B;&#x306A;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x30DF;&#x30EA;&#x30B0;&#x30E9;&#x30E0;&#x91CF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x308B;&#x81EA;&#x52D5;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;pI&#x3068;&#x6EB6;&#x89E3;&#x6027;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x306F;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x7279;&#x6027;&#x3092;&#x6301;&#x3064;22&#x7A2E;&#x985E;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x69CB;&#x9020;&#x306F;&#x3001;&#x6210;&#x529F;&#x3057;&#x305F;&#x5B9F;&#x9A13;&#x5BA4;&#x306E;&#x30ED;&#x30DC;&#x30C3;&#x30C8;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F;&#x3001;Z&#xFF08;&#x57FA;&#x672C;&#xFF09;&#x306F;&#x5909;&#x6027;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x3067;&#x3082;&#x3001;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306A;&#x7CBE;&#x88FD;&#x30BF;&#x30B0;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x4F7F;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x6226;&#x7565;&#x306F;&#x7570;&#x306A;&#x3063;&#x305F;pI&#x3068;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x4EA4;&#x63DB;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C8;&#x30B0;&#x30E9;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#xFF08;IEXC&#xFF09;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x6EB6;&#x89E3;&#x6027;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x624B;&#x9806;&#x306F;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x518D;&#x73FE;&#x6027;&#x3068;&#x9AD8;&#x3044;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x53CE;&#x91CF;&#x3068;&#x7D14;&#x5EA6;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3057;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x3086;&#x3048;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x5F7C;&#x306E;&#xFF08;6&#xFF09; - &#x30BF;&#x30B0;&#x306B;&#x826F;&#x3044;&#x88DC;&#x5B8C;&#x3059;&#x308B;&#x3082;&#x306E;&#x3067;&#x3059;&#x3002;

&#x967D;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x4EA4;&#x63DB;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C8;&#x30B0;&#x30E9;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#x306E;&#x5229;&#x7528;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x5909;&#x6027;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x3067;&#x306E;&#x30CF;&#x30A4;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x7CBE;&#x88FD;

&#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC815;&#xD654; &#xC804;&#xB7B5; polycationic Z(basic) &#xD0DC;&#xADF8;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC720;&#xC6A9;&#xD55C; &#xC804;&#xB7B5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6A9; &#xD574; &#xD558; &#xACE0; &#xB35C; &#xC218;&#xC6A9; &#xC131; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;, denaturating &#xC5D0;&#xC774;&#xC804;&#xD2B8;, &#xC6B0; &#xB808; &#xC544;, &#xB458; &#xB2E4; &#xBAA8;&#xB4E0; &#xC815;&#xD654; &#xB2E8;&#xACC4;&#xC5D0; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xCCAB;&#xC9F8;, 4 &#xAC1C;&#xC758; &#xB300;&#xC0C1; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC815;&#xD654; &#xD0DC;&#xADF8; Z(basic) &#xC735;&#xD569; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC870;&#xC791; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAD6C;&#xC870; &#xC591;&#xC774;&#xC628; &#xAD50;&#xD658; &#xD06C;&#xB85C;&#xB9C8;&#xD1A0;&#xADF8;&#xB798;&#xD53C;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC815;&#xD654; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4; &#xACE0; eluted &#xC18C;&#xAE08; &#xADF8;&#xB77C;&#xB370;&#xC774;&#xC158;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;. &#xB2EC;&#xC131; &#xD558;&#xB294; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC815;&#xD654; &#xC804;&#xB7B5; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC18C; &#xB85C;&#xBD07;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xBCD1;&#xB82C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC815;&#xD654; &#xC218; &#xC788;&#xB3C4;&#xB85D; stepwise &#xCC28;&#xC785;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558; &#xC5EC; &#xACC4;&#xD68D; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C; &#xCC98;&#xB9AC; &#xB2E8;&#xACC4;, &#xC5B4;&#xB5A4; &#xB9E4;&#xB274;&#xC5BC; &#xC5C6;&#xC774; &#xBAA8;&#xB4E0; &#xB2E8;&#xACC4;, &#xD06C;&#xB85C;&#xB9C8;&#xD1A0;&#xADF8;&#xB798;&#xD53C; &#xC218; &#xC9C0;&#xC758; &#xD3C9;&#xD615;, &#xC0D8;&#xD50C;, &#xC138;&#xCC99;, &#xCC28;&#xC785;&#xC758; &#xBD80;&#xD558;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC2E4; &#xB85C;&#xBD07;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xCC98;&#xB9AC; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8; &#xC790;&#xB3D9;&#xB41C; &#xC815;&#xD654;&#xB97C; 60 &#xC140; lysates &#xCD5C;&#xB300;&#xC758; &#xC21C;&#xC218;&#xD55C; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC591;&#xC744; &#xBC00;&#xB9AC; &#xADF8;&#xB7A8;&#xC744; &#xC8FC;&#xB294; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5F0;&#xAD6C; 22 &#xB2E4;&#xB978; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC774; &#xAD6C;&#xBB38; pI &#xBC0F; &#xC6A9; &#xD574;&#xB3C4;, &#xB2E4;&#xB978; &#xD2B9;&#xC131;&#xC744; &#xAC00;&#xC9C4; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC2E4; &#xB85C;&#xBD07;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC815;&#xD654; &#xC131;&#xACF5;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xD45C;&#xC2DC; Z(basic) denaturating &#xC870;&#xAC74; &#xB610;&#xD55C; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC778; &#xC815;&#xD654; &#xD0DC;&#xADF8;&#xB85C; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xC804;&#xB7B5; &#xB2E4;&#xB978; Pi&#xC640; &#xC774;&#xC628; &#xAD50;&#xD658; &#xD06C;&#xB85C;&#xB9C8;&#xD1A0;&#xADF8;&#xB798;&#xD53C; (IEXC)&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC6A9; &#xD574;&#xB3C4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC815;&#xD654; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC808;&#xCC28;&#xB294; &#xB192;&#xC740; &#xC7AC;&#xD604;&#xC131; &#xBC0F; &#xB192;&#xC740; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC218;&#xC728; &#xBC0F; &#xC21C;&#xB3C4; &#xB300; &#xD55C; &#xC218; &#xACE0;&#xB294; &#xADF8;&#xB7EC;&#xBBC0;&#xB85C; &#xADF8;&#xC758; (6)-&#xD0DC;&#xADF8;&#xB97C; &#xC790;&#xC8FC; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xC88B;&#xC740; &#xBCF4;&#xC644;.

&#xC591;&#xC774;&#xC628; &#xAD50;&#xD658; &#xD06C;&#xB85C;&#xB9C8;&#xD1A0;&#xADF8;&#xB798;&#xD53C;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; denaturating &#xC870;&#xAC74; &#xD558;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC815;&#xD654;.

Una estrategia de prote&#xED;nas de alto rendimiento de la purificaci&#xF3;n mediante el policati&#xF3;nico Z (b&#xE1;sico) la etiqueta se ha desarrollado. A fin de que la estrategia para ser &#xFA;til tanto para las prote&#xED;nas solubles y menos solubles, un agente desnaturalizante, la urea, se utiliz&#xF3; en todas las etapas de purificaci&#xF3;n. En primer lugar, cuatro prote&#xED;nas diana fueron fusionados gen&#xE9;ticamente a la etiqueta de la purificaci&#xF3;n, Z (b&#xE1;sico). Estas construcciones de prote&#xED;na se purific&#xF3; por cromatograf&#xED;a de intercambio cati&#xF3;nico y se eluy&#xF3; utilizando un gradiente de sal. De los datos obtenidos, una estrategia de purificaci&#xF3;n fue planeado incluyendo eluci&#xF3;n escalonada para permitir la purificaci&#xF3;n de prote&#xED;nas paralelo utilizando un robot de laboratorio. Un protocolo que incluye todas las medidas, el equilibrio de la resina de cromatograf&#xED;a, la carga de la muestra, lavado y eluci&#xF3;n, todo ello sin ninguna medida de manipulaci&#xF3;n manual, fue realizada por el robot de laboratorio. El programa permite la purificaci&#xF3;n automatizada dando cantidades de miligramos de prote&#xED;na recombinante pura de hasta 60 lisados &#x200B;&#x200B;celulares. En este estudio 22 construcciones diferentes de prote&#xED;nas, con caracter&#xED;sticas diferentes con respecto a pI y solubilidad, se purificaron con &#xE9;xito por el robot de laboratorio. Los datos muestran que Z (base) se puede utilizar como una etiqueta de purificaci&#xF3;n general tambi&#xE9;n bajo condiciones desnaturalizantes. Adem&#xE1;s, la estrategia permite la purificaci&#xF3;n de prote&#xED;nas con pI diferente y solubilidad utilizando cromatograf&#xED;a de intercambio i&#xF3;nico (IEXC). El procedimiento es altamente reproducible y permite la producci&#xF3;n de prote&#xED;na de alta pureza y por lo tanto, es un buen complemento para su uso general de la (6)-etiqueta.

La prote&#xED;na de alto rendimiento bajo condiciones desnaturalizantes Purificaci&#xF3;n por el uso de cromatograf&#xED;a de intercambio cati&#xF3;nico

&#x901A;&#x8FC7;&#x968F;&#x673A;&#x62BD;&#x53D6;&#x548C;&#x9009;&#x62E9;&#x5DF2;&#x521B;&#x5EFA;&#x4E86;&#x53CC;&#x91CD;&#x4EB2;&#x548C;&#x4E0E;&#x65B0;&#x578B;&#x86CB;&#x767D;&#x57DF;&#x3002;&#x5C0F;&#x78B1;&#x7A33;&#x5B9A;&#x767D;&#x86CB;&#x767D;&#x7ED3;&#x5408;&#x57DF; (ABD *)&#xFF0C;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x652F;&#x67B6;&#x7528;&#x4E8E;&#x6784;&#x9020;&#x5E93;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6709;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x7684;&#x4EBA;&#x8840;&#x6E05;&#x767D;&#x86CB;&#x767D; (HSA) &#x548C; 46 11 &#x88AB;&#x968F;&#x673A;&#x5176;&#x4E2D;&#x7684;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x7684;&#x7EC4;&#x6210;&#x3002;&#x4E3A;&#x4E86;&#x5B9E;&#x73B0;&#x53CC;&#x6D3B;&#x9875;&#x5939;&#xFF0C;&#x56FA;&#x6709;&#x7684; HSA &#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x7684;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7AD9;&#x70B9;&#x6CA1;&#x6709;&#x52A8;&#x548C;&#x968F;&#x673A;&#x9009;&#x62E9;&#x4E86;&#x53E6;&#x4E00;&#x4FA7;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x3002;&#x5C3D;&#x7BA1;&#x5B83;&#x7684;&#x4F53;&#x79EF;&#x5C0F;&#x548C;&#x51E0;&#x4E4E;&#x56DB;&#x5206;&#x4E4B;&#x4E00;&#x7684;&#x5176;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x53CC;&#x5B98;&#x80FD;&#x56E2;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#xFF0C;&#x968F;&#x673A;&#x5316; ABDz1&#xFF0C;&#x5C06;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x78C1;&#x5934;&#x548C; Z2 &#x57DF;&#x86CB;&#x767D; A &#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x4E0E;&#x6210;&#x529F;&#x5165;&#x9009;&#x4F7F;&#x7528;&#x566C;&#x83CC;&#x4F53;&#x5C55;&#x793A;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x65B0;&#x9009;&#x5B9A;&#x7684;&#x5907;&#x9009;&#x6848;&#x6587;&#x8868;&#x660E;&#x6539;&#x8FDB;&#x4EB2;&#x548C;&#x8D2E;&#x6C22;&#x5408;&#x91D1;&#x7535;&#x6781;&#x76F8;&#x6BD4;&#x7236;&#x6BCD;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x3002;&#x5173;&#x4E8E;&#x5411;&#x4E24;&#x4E2A;&#x4E0D;&#x540C;&#x914D;&#x4F53;&#x7684;&#x4EB2;&#x548C;&#x4E8C;&#x7EA7;&#x7ED3;&#x6784;&#x7684;&#x7279;&#x70B9;&#x662F;&#x8FD9;&#x79CD;&#x65B0;&#x578B;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x57DF;&#x3002;&#x5728;&#x4E24;&#x4E2A;&#x4E0D;&#x540C;&#x77E9;&#x9635;&#x4E0A;&#x4EB2;&#x548C;&#x7EAF;&#x5316;&#x7684;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x5DF2;&#x4F7F;&#x7528;&#x4E24;&#x4E2A;&#x914D;&#x4F53;&#x3001; HSA &#x77E9;&#x9635;&#x548C;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x8FDB;&#x884C;&#x8C03;&#x67E5;&#x57FA;&#x4E8E; A &#x77E9;&#x9635; MabSelect &#x5F53;&#x7136;&#xFF0C;&#x57DF;&#x548C;&#x65B0;&#x86CB;&#x767D;&#x7EAF;&#x51C0;&#x7684;&#x540C;&#x8D28;&#x6027;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x65B0;&#x7684;&#x57DF;&#x548C;&#x5177;&#x6709;&#x4E0D;&#x540C;&#x7279;&#x70B9;&#x7684;&#x4E09;&#x4E2A;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x76EE;&#x6807;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x878D;&#x5408;&#x4E86;&#x3002;&#x4E3A;&#x4E86;&#x5145;&#x5206;&#x5229;&#x7528;&#x8FD9;&#x4E24;&#x79CD;&#x4EB2;&#x7F18;&#x5173;&#x7CFB;&#xFF0C;&#x521B;&#x5EFA;&#x4E86;&#x79F0;&#x4E3A;&#x4F7F;&#x7528;&#x4E24;&#x4E2A;&#x4E0D;&#x540C;&#x77E9;&#x9635;&#x7684;&#x6B63;&#x4EA4;&#x4EB2;&#x548C;&#x7EAF;&#x5316;&#x5206;&#x79BB;&#x7EAF;&#x5316;&#x6218;&#x7565;&#x3002;&#x6240;&#x6709;&#x4E09;&#x4E2A;&#x7248;&#x672C;&#x7684;&#x6210;&#x529F;&#x5206;&#x79BB;&#x7EAF;&#x5316;&#x9AD8;&#x6548;&#x5730;&#x8FDB;&#x884C;&#x4F7F;&#x7528;&#x6B64;&#x7B56;&#x7565;&#x3002;

&#x9009;&#x5B9A;&#x7684;&#x6B63;&#x4EA4;&#x4EB2;&#x548C;&#x7EAF;&#x5316;&#x7684;&#x5C0F;&#x53CC;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x3002;

A novel protein domain with dual affinity has been created by randomization and selection. The small alkali-stabilized albumin-binding domain (ABD*), used as scaffold to construct the library, has affinity to human serum albumin (HSA) and is constituted of 46 amino acids of which 11 were randomized. To achieve a dual binder, the binding site of the inherent HSA affinity was untouched and the randomization was made on the opposite side of the molecule. Despite its small size and randomization of almost a quarter of its amino acids, a bifunctional molecule, ABDz1, with ability to bind to both HSA and the Z2 domain/protein A was successfully selected using phage display. Moreover, the newly selected variant showed improved affinity for HSA compared to the parental molecule. This novel protein domain has been characterized regarding secondary structure and affinity to the two different ligands. The possibility for affinity purification on two different matrices has been investigated using the two ligands, the HSA matrix and the protein A-based, MabSelect SuRe matrix, and the new protein domain was purified to homogeneity. Furthermore, gene fusions between the new domain and three different target proteins with different characteristics were made. To take advantage of both affinities, a purification strategy referred to as orthogonal affinity purification using two different matrices was created. Successful purification of all three versions was efficiently carried out using this strategy.

A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification.

Une nouvelle prot&#xE9;ine de domaine avec une affinit&#xE9; double a &#xE9;t&#xE9; cr&#xE9;&#xE9; par la randomisation et la s&#xE9;lection. Le petit alcali-albumine stabilis&#xE9; domaine de liaison (ABD *), utilis&#xE9; comme &#xE9;chafaudage pour construire la biblioth&#xE8;que, poss&#xE8;de une affinit&#xE9; pour l&#x26;#39;albumine s&#xE9;rique humaine (HSA) et est constitu&#xE9; de 46 acides amin&#xE9;s dont 11 ont &#xE9;t&#xE9; randomis&#xE9;s. Pour atteindre un liant double, le site de liaison de l&#x26;#39;affinit&#xE9; inh&#xE9;rente SAH a &#xE9;t&#xE9; touch&#xE9; et le randomisation est faite sur le c&#xF4;t&#xE9; oppos&#xE9; de la mol&#xE9;cule. Malgr&#xE9; sa petite taille et la randomisation de pr&#xE8;s d&#x26;#39;un quart de ses acides amin&#xE9;s, une mol&#xE9;cule bifonctionnelle, ABDz1, avec la capacit&#xE9; de se lier &#xE0; la fois HSA et le domaine Z2 / prot&#xE9;ine A a &#xE9;t&#xE9; s&#xE9;lectionn&#xE9; &#xE0; l&#x26;#39;aide avec succ&#xE8;s phage display. En outre, le variant nouvellement s&#xE9;lectionn&#xE9; montr&#xE9; affinit&#xE9; am&#xE9;lior&#xE9;e de la SAH par rapport &#xE0; la mol&#xE9;cule parentale. Ce domaine nouvelle prot&#xE9;ine a &#xE9;t&#xE9; caract&#xE9;ris&#xE9;e en ce qui concerne la structure secondaire et de l&#x26;#39;affinit&#xE9; pour les deux ligands diff&#xE9;rents. La possibilit&#xE9; pour la purification d&#x26;#39;affinit&#xE9; sur deux matrices diff&#xE9;rentes a &#xE9;t&#xE9; &#xE9;tudi&#xE9;e en utilisant les deux ligands, la matrice HSA et la prot&#xE9;ine A-base, la matrice MabSelect s&#xFB;r, et le domaine de la prot&#xE9;ine nouvelle a &#xE9;t&#xE9; purifi&#xE9;e jusqu&#x26;#39;&#xE0; homog&#xE9;n&#xE9;it&#xE9;. En outre, des fusions de g&#xE8;nes entre le nouveau domaine et trois prot&#xE9;ines cibles diff&#xE9;rentes avec des caract&#xE9;ristiques diff&#xE9;rentes ont &#xE9;t&#xE9; faites. Pour profiter de ces deux affinit&#xE9;s, une strat&#xE9;gie de purification appel&#xE9; la purification par affinit&#xE9; orthogonale en utilisant deux matrices diff&#xE9;rentes a &#xE9;t&#xE9; cr&#xE9;&#xE9;. Purification r&#xE9;ussie de tous les trois versions a &#xE9;t&#xE9; efficacement r&#xE9;alis&#xE9;e en utilisant cette strat&#xE9;gie.

Une petite prot&#xE9;ine bisp&#xE9;cifique S&#xE9;lectionn&#xE9; pour Purification par affinit&#xE9; orthogonale

Eine neuartige Protein-Dom&auml;ne mit dual Affinit&auml;t wurde durch Randomisierung und Auswahl erstellt. Die kleine Alkali stabilisierten Albumin-bindende Dom&auml;ne (ABD *), als Ger&uuml;st verwendet, um die Bibliothek zu konstruieren hat Affinit&auml;t zum menschlichen Serum-Albumin (HSA) und konstituiert sich aus 46 Aminos&auml;uren, von denen 11 randomisiert wurden. Um eine duale-Sammelmappe zu erreichen, wurde die Bindungsstelle der inh&auml;renten HSA-Affinit&auml;t unber&uuml;hrt und die Randomisierung wurde auf der gegen&uuml;berliegenden Seite des Molek&uuml;ls. Trotz seiner geringen Gr&ouml;&szlig;e und Randomisierung von fast ein Viertel seiner Aminos&auml;uren, ein Bifunktionelles Molek&uuml;l, ABDz1, mit M&ouml;glichkeit zum Binden an HSA und Z2 Dom&auml;ne/Protein A erfolgreich w&auml;hlte Phagen-Display verwenden. Dar&uuml;ber hinaus zeigte die neu ausgew&auml;hlte Variante verbesserte Affinit&auml;t f&uuml;r HSA im Vergleich zu den elterlichen Molek&uuml;l. Diese neuartige Protein-Dom&auml;ne war bez&uuml;glich Sekund&auml;rstruktur und Affinit&auml;t zu zwei unterschiedlichen Liganden charakterisiert. Die M&ouml;glichkeit der Affinit&auml;tsreinigung auf zwei verschiedenen Matrizen wurde untersucht mit zwei Liganden, der HSA-Matrix und das Protein A-basierte, MabSelect SuRe Matrix und die neue Proteindom&auml;ne zur Homogenit&auml;t gereinigt wurde. Dar&uuml;ber hinaus erfolgten gen Fusionen zwischen der neuen Dom&auml;ne und drei unterschiedliche Ziel-Proteine mit unterschiedlichen Eigenschaften. Um beide Affinit&auml;ten zu nutzen, entstand eine Reinigung-Strategie als orthogonale Affinit&auml;tsreinigung mit zwei verschiedene Matrizen bezeichnet. Erfolgreiche Reinigung aller drei Versionen wurde effizient durchgef&uuml;hrt, mit dieser Strategie.

Eine kleine Bispezifischer-Protein f&uuml;r orthogonale Affinit&auml;tsreinigung ausgew&auml;hlt.

Un dominio della proteina romanzo con doppia affinit&agrave; &egrave; stato creato da selezione e randomizzazione. Il piccolo stabilizzato alcali albumina-associazione dominio (ABD *), utilizzato come impalcatura per costruire la libreria, ha affinit&agrave; di albumina di siero umano (HSA) ed &egrave; costituito da 46 amminoacidi di cui 11 sono stati randomizzati. Per ottenere un legante dual, il sito di legame dell&#39;intrinseca affinit&agrave; HSA era intatto e la randomizzazione &egrave; stata effettuata sul lato opposto della molecola. Nonostante la sua piccola dimensione e la randomizzazione di quasi un quarto dei suoi amminoacidi, una molecola bifunzionale, ABDz1, con capacit&agrave; di legarsi sia HSA e il dominio di Z2/proteina A &egrave; stato selezionato utilizzando phage display. Inoltre, la variante appena selezionata ha mostrato una migliore affinit&agrave; per HSA rispetto alla molecola parentale. Questo dominio romanzo della proteina &egrave; stato caratterizzato per quanto riguarda la struttura secondaria e affinit&agrave; per i ligandi diversi due. La possibilit&agrave; per la purificazione di affinit&agrave; su due matrici diverse &egrave; stata studiata utilizzando i due ligandi, la matrice di HSA e la proteina A-based, MabSelect certo matrix e il nuovo dominio proteico &egrave; stato purificato di omogeneit&agrave;. Inoltre, sono state fatte fusioni del gene fra il nuovo dominio e tre proteine bersaglio differenti con caratteristiche diverse. Per sfruttare i vantaggi di entrambi affinit&agrave;, &egrave; stata creata una strategia di purificazione come purificazione di affinit&agrave; ortogonale utilizzando due diverse matrici. Successo purificazione di tutte le tre versioni &egrave; stato effettuato in modo efficiente usando questa strategia.

Una proteina piccola bispecific selezionata per la purificazione di affinit&agrave; ortogonale.

&#x30C7;&#x30E5;&#x30A2;&#x30EB;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x65B0;&#x898F;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C0;&#x30E0;&#x5316;&#x3068;&#x9078;&#x629E;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x4F5C;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x30FC;&#x3092;&#x69CB;&#x7BC9;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x8DB3;&#x5834;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x5C0F;&#x578B;&#x306E;&#x30A2;&#x30EB;&#x30AB;&#x30EA;&#x5B89;&#x5B9A;&#x5316;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D6;&#x30DF;&#x30F3;&#x7D50;&#x5408;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#xFF08;ABD *&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#xFF08;HSA&#xFF09;&#x30D2;&#x30C8;&#x8840;&#x6E05;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D6;&#x30DF;&#x30F3;&#x3068;&#x306E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x3092;&#x6301;&#x3063;&#x3066;&#x304A;&#x308A;&#x3001;11&#x306F;&#x7121;&#x4F5C;&#x70BA;&#x306B;&#x5272;&#x308A;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x3046;&#x3061;46&#x500B;&#x306E;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x3067;&#x69CB;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x30C7;&#x30E5;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C0;&#x30FC;&#x3092;&#x9054;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x56FA;&#x6709;&#x306E;HSA&#x306E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x90E8;&#x4F4D;&#x306F;&#x305D;&#x306E;&#x307E;&#x307E;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C0;&#x30E0;&#x5316;&#x306F;&#x3001;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x53CD;&#x5BFE;&#x5074;&#x306B;&#x884C;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x305D;&#x306E;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x306E;&#x307B;&#x307C;4&#x5206;&#x306E;1&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30BA;&#x304C;&#x5C0F;&#x3055;&#x3044;&#x3068;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C0;&#x30E0;&#x5316;&#x3001;&#x4E8C;&#x5B98;&#x80FD;&#x6027;&#x5206;&#x5B50;&#x3001;ABDz1&#x3082;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x3089;&#x305A;&#x3001;HSA&#x3068;Z2&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;/&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x80FD;&#x529B;&#x3067;&#x6B63;&#x5E38;&#x306B;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30C7;&#x30A3;&#x30B9;&#x30D7;&#x30EC;&#x30A4;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x9078;&#x629E;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x65B0;&#x3057;&#x304F;&#x9078;&#x629E;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306F;&#x3001;&#x89AA;&#x5206;&#x5B50;&#x306B;&#x6BD4;&#x3079;&#x3066;HSA&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6539;&#x826F;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x65B0;&#x898F;&#x306A;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x4E8C;&#x6B21;&#x69CB;&#x9020;&#x3001;2&#x3064;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x30EA;&#x30AC;&#x30F3;&#x30C9;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x306E;&#x7279;&#x5FB4;&#x3068;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4E8C;&#x3064;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x30DE;&#x30C8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x4E0A;&#x306E;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x30FC;&#x7CBE;&#x88FD;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;MabSelect&#x78BA;&#x304B;&#x306B;&#x884C;&#x5217;&#x306F;&#x3001;2&#x3064;&#x306E;&#x30EA;&#x30AC;&#x30F3;&#x30C9;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;HSA&#x30DE;&#x30C8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x3068;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x3092;&#x8ABF;&#x67FB;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x304A;&#x308A;&#x3001;&#x65B0;&#x305F;&#x306A;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x304C;&#x5747;&#x4E00;&#x306B;&#x306A;&#x308B;&#x307E;&#x3067;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x7279;&#x6027;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3068;3&#x3064;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x6A19;&#x7684;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3068;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x878D;&#x5408;&#x304C;&#x884C;&#x308F;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x4E21;&#x65B9;&#x3068;&#x3082;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x3092;&#x6D3B;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x7CBE;&#x88FD;&#x6226;&#x7565;&#x306F;&#x3001;2&#x3064;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x884C;&#x5217;&#x304C;&#x4F5C;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x76F4;&#x4EA4;&#x3059;&#x308B;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x30FC;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3068;&#x3082;&#x547C;&#x3070;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002; 3&#x3064;&#x306E;&#x30D0;&#x30FC;&#x30B8;&#x30E7;&#x30F3;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x6210;&#x529F;&#x3057;&#x305F;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3092;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306B;&#x3053;&#x306E;&#x6226;&#x7565;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x884C;&#x3063;&#x305F;&#x3002;

&#x76F4;&#x4EA4;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x30FC;&#x7CBE;&#x88FD;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x9078;&#x629E;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5C0F;&#x578B;&#x4E8C;&#x91CD;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;

&#xC774;&#xC911; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xC18C;&#xC124; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xB79C;&#xB364; &#xBC0F; &#xC120;&#xD0DD;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC0DD;&#xC131; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC791;&#xC740; &#xC54C;&#xCE7C;&#xB9AC; &#xC548;&#xC815;&#xD654; &#xC54C; &#xBD80; &#xBBFC; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; (ABD *) &#xBE44; &#xACC4;&#xB85C; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB7EC;&#xB9AC;&#xB97C; &#xB9CC;&#xB4DC;&#xB294; &#xB370; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xC778;&#xAC04; &#xD608; &#xCCAD; &#xC54C; &#xBD80; &#xBBFC; (HSA)&#xB97C; &#xC788;&#xC73C;&#xBA70; 11 &#xBB34;&#xC791;&#xC704;&#xB85C; &#xD588;&#xB2E4;&#xB294; 46 &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0;&#xC758; &#xAD6C;&#xC131;. &#xB4C0;&#xC5BC; &#xBC14;&#xC778;&#xB354;&#xB97C; &#xB2EC;&#xC131; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xACE0;&#xC720;&#xC758; HSA &#xC120;&#xD638;&#xB3C4;&#xC758; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xAC10;&#xB3D9; &#xD588;&#xB2E4;&#xC640; &#xB79C;&#xB364; &#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xBC18;&#xB300;&#xD3B8;&#xC5D0; &#xB9CC;&#xB4E4;&#xC5B4;&#xC84C;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xAC83;&#xC758; &#xC791;&#xC740; &#xD06C;&#xAE30;&#xC640; &#xB79C;&#xB364; bifunctional &#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0;&#xC758; &#xAC70;&#xC758; 4 &#xBD84;&#xC758;&#xC5D0; &#xBD88;&#xAD6C; &#xD558; &#xACE0; ABDz1, HSA&#xC640; Z2 &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;/&#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; A &#xBAA8;&#xB450;&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xAC8C; &#xB41C;&#xB294; &#xC131;&#xACF5;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC120;&#xD0DD; &#xC0B4; &#xADE0; &#xC18C; &#xB514;&#xC2A4;&#xD50C;&#xB808;&#xC774; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;. &#xB610;&#xD55C;, &#xC0C8;&#xB85C; &#xC120;&#xD0DD;&#xD55C; &#xBCC0;&#xD615; &#xBD80;&#xBAA8;&#xC758; &#xBD84;&#xC790;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; HSA&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xBCF4;&#xC600;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBE44; &#xBC1C;&#xD55C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; 2 &#xCC28; &#xAD6C;&#xC870;&#xC640; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xC11C;&#xB85C; &#xB2E4;&#xB978; ligands &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xAD00;&#xD55C; &#xD2B9;&#xC9D5; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; ligands, HSA &#xB9E4;&#xD2B8;&#xB9AD;&#xC2A4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xB2E4;&#xB978; &#xB9E4;&#xD2B8;&#xB9AD;&#xC2A4;&#xC5D0; &#xCE5C; &#xD654;&#xB825; &#xC815;&#xD654;&#xB97C; &#xC704;&#xD55C; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131; &#xC870;&#xC0AC; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; A &#xAE30;&#xBC18; MabSelect &#xBB3C;&#xB860; &#xD589;&#xB82C;&#xACFC; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xB3D9;&#xC9C8;&#xC131;&#xC744; &#xC815;&#xD654; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xC0C8; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xBC0F; &#xB2E4;&#xB978; &#xD2B9;&#xC131;&#xC744; &#xAC00;&#xC9C4; 3 &#xAC1C;&#xC758; &#xB2E4;&#xB978; &#xB300;&#xC0C1; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xC720;&#xC804;&#xC790; fusions &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xB450; &#xB3D9;&#xC9C8;&#xC131;&#xC744; &#xD65C;&#xC6A9; &#xD558;&#xB824;&#xBA74; &#xB450; &#xB2E4;&#xB978; &#xB9E4;&#xD2B8;&#xB9AD;&#xC2A4;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC9C1;&#xAC01; &#xCE5C; &#xD654;&#xB825; &#xC815;&#xD654; &#xB77C;&#xACE0; &#xC815;&#xD654; &#xC804;&#xB7B5;&#xC744; &#xB9CC;&#xB4E4;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBAA8;&#xB4E0; &#xC138; &#xAC00;&#xC9C0; &#xBC84;&#xC804;&#xC758; &#xC131;&#xACF5;&#xC801;&#xC778; &#xC815;&#xD654;&#xAC00;&#xC774; &#xC804;&#xB7B5;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC218;&#xD589; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;.

&#xC9C1;&#xAD50; &#xCE5C; &#xD654;&#xB825; &#xC815;&#xD654;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC120;&#xC815; &#xC791;&#xC740; bispecific &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;.

Un dominio de nueva prote&#xED;na, con una afinidad dual ha sido creado por la asignaci&#xF3;n al azar y la selecci&#xF3;n. El peque&#xF1;o alcalino-estabilizada de alb&#xFA;mina dominio de uni&#xF3;n (ABD *), utilizado como andamio para construir la biblioteca, tiene una afinidad para la alb&#xFA;mina s&#xE9;rica humana (HSA) y est&#xE1; constituido por 46 amino&#xE1;cidos de los cuales 11 fueron asignados al azar. Para lograr un aglutinante dual, el sitio de uni&#xF3;n de la afinidad inherente HSA estaba intacta y la aleatorizaci&#xF3;n se hizo en el lado opuesto de la mol&#xE9;cula. A pesar de su peque&#xF1;o tama&#xF1;o y la aleatorizaci&#xF3;n de casi un cuarto de sus amino&#xE1;cidos, una mol&#xE9;cula bifuncional, ABDz1, con capacidad para unirse a ambos HSA y el dominio Z2 / prote&#xED;na A se seleccion&#xF3; utilizando con &#xE9;xito de fagos. Adem&#xE1;s, la variante reci&#xE9;n seleccionada mostr&#xF3; afinidad mejorada para HSA en comparaci&#xF3;n con la mol&#xE9;cula parental. Este dominio nueva prote&#xED;na se ha caracterizado con respecto a la estructura secundaria y la afinidad de los dos ligandos diferentes. La posibilidad para la purificaci&#xF3;n de afinidad en dos matrices diferentes ha sido investigada utilizando los dos ligandos, la matriz de HSA y la prote&#xED;na A-basado, matriz MabSelect Claro, y el dominio nueva prote&#xED;na se purific&#xF3; hasta la homogeneidad. Por otra parte, las fusiones de genes entre el nuevo dominio y tres prote&#xED;nas diana diferentes con caracter&#xED;sticas diferentes se hicieron. Para aprovechar las ventajas de ambos afinidades, una estrategia de purificaci&#xF3;n conocido como purificaci&#xF3;n por afinidad ortogonal con dos diferentes matrices se ha creado. La purificaci&#xF3;n exitosa de las tres versiones se llev&#xF3; a cabo de manera eficiente utilizando esta estrategia.

Una peque&#xF1;a prote&#xED;na biespec&#xED;fico seleccionados para purificaci&#xF3;n por afinidad ortogonal

&#x53CC;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x6297;&#x4F53;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x975E;&#x514D;&#x75AB;&#x7403;&#x86CB;&#x767D;&#x57FA;&#x4E8E;&#x53CC;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x4EB2;&#x548C;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x88AB;&#x8BA4;&#x4E3A;&#x5177;&#x6709;&#x5F88;&#x9AD8;&#x7684;&#x6F5C;&#x5728;&#x672A;&#x6765;&#x4E2D;&#x5E94;&#x7528;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x9879;&#x7814;&#x7A76;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#x4E00;&#x79CD;&#x65B0;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6781;&#x5C0F;&#x53CC;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x7EC4;&#x6210;&#x7684;&#x4EC5;&#x6709;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7ED3;&#x6784;&#x57DF;&#x7684;&#x4E00;&#x4EE3;&#x3002;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x80BF;&#x7624;&#x574F;&#x6B7B;&#x56E0;&#x5B50;-&alpha; (TNF-&alpha;) &#x5230;&#x767D;&#x86CB;&#x767D;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x57DF;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x540C;&#x65F6;&#x4ECD;&#x4FDD;&#x7559;&#x539F;&#x59CB;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x4E3A;&#x767D;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x5BFC;&#x81F4;&#x53CC;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x7EC4;&#x6210;&#x7684;&#x53EA;&#x662F; 46 &#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x3002;&#x975E;&#x767D;&#x86CB;&#x767D;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x4E00;&#x4FA7;&#x7684;&#x4E09;&#x87BA;&#x65CB;&#x675F;&#x57DF;&#x540D;&#xFF0C;&#xFF0C;&#x7136;&#x540E;&#x663E;&#x793A;&#x7ED3;&#x679C;&#x5E93;&#x5BF9;&#x566C;&#x83CC;&#x4F53;&#x9897;&#x7C92;&#xFF0C;&#x591A;&#x6837;&#x5316;&#x7684;&#x53CC;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x5355;&#x7ED3;&#x6784;&#x57DF;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x662F;&#x5B64;&#x7ACB;&#x4F7F;&#x7528;&#x4E0E;&#x80BF;&#x7624;&#x574F;&#x6B7B;&#x56E0;&#x5B50;-&alpha; &#x7684;&#x9009;&#x62E9;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x76EE;&#x6807;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x57FA;&#x4E8E;&#x4ECE;&#x566C;&#x83CC;&#x4F53;&#x9009;&#x62E9;&#x83B7;&#x5F97;&#x5E8F;&#x5217;&#xFF0C;&#x7B2C;&#x4E8C;&#x4EE3;&#x5E93;&#x65E8;&#x5728;&#x4E3A;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x589E;&#x52A0;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x7684;&#x53CC;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x5019;&#x9009;&#x4EBA;&#x3002;&#x91D1;&#x9EC4;&#x8272;&#x8461;&#x8404;&#x7403;&#x83CC;&#x8868;&#x9762;&#x663E;&#x793A;&#x88AB;&#x96C7;&#x7528;&#x7684;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x6210;&#x719F;&#xFF0C;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x5728;&#x540C;&#x4E00;&#x9009;&#x62E9;&#x76EE;&#x6807;&#x5468;&#x671F;&#x4F7F;&#x6539;&#x8FDB;&#x8054;&#x7F16;&#x7A0B;&#x5E8F;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x57FA;&#x4E8E;&#x591A;&#x53C2;&#x6570;&#x7684;&#x6392;&#x5E8F;&#x60C5;&#x51B5;&#x4E0E;&#x80BF;&#x7624;&#x574F;&#x6B7B;&#x56E0;&#x5B50;-&alpha; &#x548C;&#x767D;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x9AD8;&#x6548;&#x5206;&#x79BB;&#x3002;&#x5B64;&#x7ACB;&#x7684;&#x53D8;&#x79CD;&#x88AB;&#x6D4B;&#x5E8F;&#x548C;&#x5206;&#x6790;&#x7684;&#x767D;&#x86CB;&#x767D;&#x548C;&#x80BF;&#x7624;&#x574F;&#x6B7B;&#x56E0;&#x5B50;-&alpha; &#x7684;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x4E86;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x5206;&#x6790;&#x63ED;&#x793A;&#x80BF;&#x7624;&#x574F;&#x6B7B;&#x56E0;&#x5B50;-&alpha; &#x7684;&#x4EB2;&#x548C;&#x6027;&#xFF0C;&#x4F4E;&#x4E8E; 5 nM &#x7684;&#x6700;&#x5F3A;&#x7684;&#x7C98;&#x5408;&#x5242;&#x3002;&#x4ECE;&#x591A;&#x53C2;&#x6570;&#x8FDB;&#x884C;&#x6392;&#x5E8F;&#x540C;&#x65F6;&#x6709;&#x9488;&#x5BF9;&#x6027;&#x7684;&#x80BF;&#x7624;&#x574F;&#x6B7B;&#x56E0;&#x5B50;-&alpha; &#x548C;&#x767D;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x51E0;&#x53CC;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x5019;&#x9009;&#x4EBA;&#x5B64;&#x7ACB;&#x8FD9;&#x4E24;&#x4E2A;&#x6297;&#x539F;&#x7684;&#x9AD8;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#xFF0C;&#x8868;&#x660E;&#x8BE5;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x663E;&#x793A;&#x8367;&#x5149;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5206;&#x9009;&#x7684;&#x7ED3;&#x5408;&#x662F;&#x53CC;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x9002;&#x7528;&#x6280;&#x672F;&#x3002;&#x5C31;&#x6211;&#x4EEC;&#x6240;&#x77E5;&#xFF0C;&#x65B0;&#x8054;&#x7F16;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x4EE3;&#x8868;&#x62A5;&#x544A;&#x5230;&#x76EE;&#x524D;&#x4E3A;&#x6B62;&#x7684;&#x6700;&#x5C0F;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x53CC;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x3002;&#x8BA8;&#x8BBA;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x548C;&#x6311;&#x6218;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x8FD9;&#x79CD;&#x65B0;&#x578B;&#x6218;&#x7565;&#x7684;&#x6F5C;&#x5728;&#x672A;&#x6765;&#x7684;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x3002;

&#x5DE5;&#x7A0B;&#x53CC;&#x5230;&#x5355;&#x4E2A;&#x57DF;&#x4E2D;&#x767D;&#x86CB;&#x767D;&#x7ED3;&#x5408;&#x3002;

Bispecific antibodies as well as non-immunoglobulin based bispecific affinity proteins are considered to have a very high potential in future biotherapeutic applications. In this study, we report on a novel approach for generation of extremely small bispecific proteins comprised of only a single structural domain. Binding to tumor necrosis factor-Î± (TNF-Î±) was engineered into an albumin-binding domain while still retaining the original affinity for albumin, resulting in a bispecific protein composed of merely 46 amino acids. By diversification of the non albumin-binding side of the three-helix bundle domain, followed by display of the resulting library on phage particles, bispecific single-domain proteins were isolated using selections with TNF-Î± as target. Moreover, based on the obtained sequences from the phage selection, a second-generation library was designed in order to further increase the affinity of the bispecific candidates. Staphylococcal surface display was employed for the affinity maturation, enabling efficient isolation of improved binders as well as multiparameter-based sortings with both TNF-Î± and albumin as targets in the same selection cycle. Isolated variants were sequenced and the binding to albumin and TNF-Î± was analyzed. This analysis revealed an affinity for TNF-Î± below 5 nM for the strongest binders. From the multiparameter sorting that simultaneously targeted TNF-Î± and albumin, several bispecific candidates were isolated with high affinity to both antigens, suggesting that cell display in combination with fluorescence activated cell sorting is a suitable technology for engineering of bispecificity. To our knowledge, the new binders represent the smallest engineered bispecific proteins reported so far. Possibilities and challenges as well as potential future applications of this novel strategy are discussed.

Engineering bispecificity into a single albumin-binding domain.

Des anticorps bisp&#xE9;cifiques ainsi que non-immunoglobulines &#xE0; base de prot&#xE9;ines d&#x26;#39;affinit&#xE9; bisp&#xE9;cifiques sont consid&#xE9;r&#xE9;s comme ayant un tr&#xE8;s fort potentiel dans les futures applications bioth&#xE9;rapeutiques. Dans cette &#xE9;tude, nous pr&#xE9;sentons une nouvelle approche pour la g&#xE9;n&#xE9;ration de tr&#xE8;s petites prot&#xE9;ines bisp&#xE9;cifiques comprenant un seul domaine structurel. La liaison &#xE0; facteur de n&#xE9;crose tumorale &#x3B1;-(TNF-&#x3B1;) a &#xE9;t&#xE9; con&#xE7;u dans un domaine liant l&#x26;#39;albumine, tout en conservant l&#x26;#39;affinit&#xE9; pour l&#x26;#39;albumine d&#x26;#39;origine, r&#xE9;sultant en une prot&#xE9;ine compos&#xE9;e de seulement bisp&#xE9;cifique 46 acides amin&#xE9;s. Par la diversification de la non liant l&#x26;#39;albumine c&#xF4;t&#xE9; du domaine faisceau de trois h&#xE9;lices, suivie par l&#x26;#39;affichage de la biblioth&#xE8;que en r&#xE9;sulte sur les particules de phage, bisp&#xE9;cifiques &#xE0; domaine unique prot&#xE9;ines ont &#xE9;t&#xE9; isol&#xE9;es &#xE0; l&#x26;#39;aide des s&#xE9;lections avec le TNF-&#x3B1; comme cible. En outre, sur la base des s&#xE9;quences obtenues &#xE0; partir de la s&#xE9;lection du phage, une biblioth&#xE8;que de deuxi&#xE8;me g&#xE9;n&#xE9;ration a &#xE9;t&#xE9; con&#xE7;u en outre pour augmenter l&#x26;#39;affinit&#xE9; des candidats bisp&#xE9;cifiques. La surface d&#x26;#39;affichage staphylococcique a &#xE9;t&#xE9; employ&#xE9; pour la maturation d&#x26;#39;affinit&#xE9;, permettant d&#x26;#39;isoler efficacement liants am&#xE9;lior&#xE9;s ainsi que multiparam&#xE9;trique &#xE0; base de tris &#xE0; la fois avec le TNF-&#x3B1; et de l&#x26;#39;albumine comme cibles dans le cycle de s&#xE9;lection m&#xEA;me. Variantes isol&#xE9;es ont &#xE9;t&#xE9; s&#xE9;quenc&#xE9;s et la liaison &#xE0; l&#x26;#39;albumine et de TNF-&#x3B1; a &#xE9;t&#xE9; analys&#xE9;e. Cette analyse a r&#xE9;v&#xE9;l&#xE9; une affinit&#xE9; pour le TNF-&#x3B1; en dessous de 5 nM pour les plus forts liants. De la multiparam&#xE9;trique de tri qui, simultan&#xE9;ment, le TNF-&#x3B1; cibl&#xE9; et de l&#x26;#39;albumine, plusieurs candidats ont &#xE9;t&#xE9; isol&#xE9;s bisp&#xE9;cifiques avec une forte affinit&#xE9; pour les deux antig&#xE8;nes, ce qui sugg&#xE8;re que la cellule d&#x26;#39;affichage en combinaison avec le tri des cellules activ&#xE9; par fluorescence est une technologie appropri&#xE9;e pour l&#x26;#39;ing&#xE9;nierie des bispecificity. &#xC0; notre connaissance, les nouveaux liants repr&#xE9;sentent les plus petites d&#x26;#39;ing&#xE9;nierie des prot&#xE9;ines bisp&#xE9;cifiques signal&#xE9;s jusqu&#x26;#39;&#xE0; pr&#xE9;sent. Les possibilit&#xE9;s et les d&#xE9;fis ainsi que les applications futures potentielles de cette nouvelle strat&#xE9;gie sont discut&#xE9;s.

Bispecificity g&#xE9;nie dans un unique liant l&#x26;#39;albumine de domaine

Bispezifischer Antik&ouml;rper als auch nicht-Immunglobulin basierend Bispezifischer Affinit&auml;t Proteine werden als eine sehr hohe k&uuml;nftig biotherapeutische Anwendungsm&ouml;glichkeiten haben. In dieser Studie berichten wir &uuml;ber einen neuen Ansatz zur Generierung von extrem kleinen Bispezifischer Proteine bestehen aus nur einer einzigen strukturellen Dom&auml;ne. Bindung an Tumor-Nekrose-Faktor-&alpha; (TNF-&alpha;) wurde in eine Dom&auml;ne im Eiwei&szlig;-Bindung entwickelt, w&auml;hrend noch die Beibehaltung der urspr&uuml;nglichen Affinit&auml;t f&uuml;r Albumin, wodurch ein Bispezifischer Protein setzt sich aus lediglich 46 Aminos&auml;uren. Durch Diversifikation der unverbindlichen Albumin-Seite des drei-Helix-B&uuml;ndel Dom&auml;ne, gefolgt vom Display der resultierende Bibliothek auf Bakteriophagenpartikel wurden Bispezifischer einzelnen Dom&auml;ne Proteine isoliert mit Auswahlen mit TNF-&alpha; als Ziel. Dar&uuml;ber hinaus wurde auf der Grundlage der erhaltenen Sequenzen aus der Phage-Auswahl, eine zweite Generation Bibliothek entworfen um die Affinit&auml;t der Bispezifischer Kandidaten zu steigern. Staphylokokken Oberfl&auml;che Display war f&uuml;r die Affinit&auml;t-Reifung, erm&ouml;glicht effiziente Isolierung verbesserte Bindemittel sowie Multiparameter-basierte Sortings mit TNF-&alpha; und Albumin als Ziele in der gleichen Auswahl Zyklus besch&auml;ftigt. Isolierte Varianten wurden sequenziert und die Bindung an Albumin und TNF-&alpha; wurde analysiert. Diese Analyse ergab eine Affinit&auml;t f&uuml;r TNF-&alpha; unter 5 nM f&uuml;r die st&auml;rkste Bindemittel. Aus der Multiparameter sortieren, dass mehrere Bispezifischer Kandidaten gleichzeitig gezielte TNF-&alpha; und Albumin, isoliert mit hoher Affinit&auml;t zu beide Antigene waren, was darauf hindeutet, dass Zelle ist Display in Kombination mit Fluoreszenz aktivierten Zellsortierung eine geeignete Technologie f&uuml;r Engineering von Bispecificity. Unseres Wissens darstellen der neuen Bindemittel die kleinste ver&auml;nderter Bispezifischer Proteine wurden bisher beschrieben. M&ouml;glichkeiten und Herausforderungen sowie m&ouml;gliche zuk&uuml;nftige Anwendungen dieser neuartige Strategie werden diskutiert.

Ingenieur-Bispecificity in eine einzige Dom&auml;ne Albumin-Bindung.

Anticorpi Bispecific cos&igrave; come proteine affinit&agrave; non-immunoglobulina bispecific base sono considerate avere una molto alta in futuro bioterapeutici potenziali applicazioni. In questo studio, riportiamo su un approccio innovativo per la generazione di proteine estremamente piccolo bispecific composto da un singolo dominio strutturale. Associazione al fattore di necrosi tumorale-&alpha; (TNF-&alpha;) &egrave; stato progettato in un dominio di albumina-Associazione pur mantenendo l&#39;originale affinit&agrave; per l&#39;albumina, proteina risultante in un bispecific composto soltanto 46 amminoacidi. Dalla diversificazione del lato albumina vincolante del dominio tre-helix bundle, seguito dalla visualizzazione della libreria risultante su particelle dei fagi, proteine di dominio singolo bispecific sono state isolate mediante selezioni con TNF-&alpha; come destinazione. Inoltre, basato sulle sequenze ottenute dalla selezione dei fagi, una libreria di seconda generazione &egrave; stata progettata al fine di aumentare ulteriormente l&#39;affinit&agrave; dei candidati bispecific. Visualizzazione superficie stafilococcica &egrave; stata impiegata per la maturazione di affinit&agrave;, abilitazione efficiente isolamento dei leganti migliorati cos&igrave; come basata su multiparametro cernite con TNF-&alpha; e albumina come obiettivi della selezione stessa del ciclo. Varianti isolate sono stati sequenziati e l&#39;associazione di albumina e TNF-&alpha; &egrave; stato analizzato. Questa analisi ha rivelato un&#39;affinit&agrave; per il TNF-&alpha; di sotto di 5 nM per i leganti pi&ugrave; forti. Da multiparametro ordinamento che contemporaneamente mirate TNF-&alpha; e albumina, diversi bispecific candidati sono stati isolati con alta affinit&agrave; per entrambi gli antigeni, suggerendo che la cella display in combinazione con fluorescenza attivata ordinamento delle cellule &egrave; una tecnologia adatta per l&#39;ingegneria delle bispecificity. A nostra conoscenza, i nuovi leganti rappresentano le proteine pi&ugrave; piccolo ingegnerizzati bispecific riferite finora. Possibilit&agrave; e sfide cos&igrave; come potenziali applicazioni future di questa romanzo strategia sono discussi.

Ingegneria bispecificity in un singolo dominio di albumina-associazione.

&#x4E8C;&#x91CD;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x6297;&#x4F53;&#x3068;&#x540C;&#x69D8;&#x306B;&#x975E;&#x514D;&#x75AB;&#x30B0;&#x30ED;&#x30D6;&#x30EA;&#x30F3;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x4E8C;&#x91CD;&#x7279;&#x7570;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;&#x3001;&#x5C06;&#x6765;&#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA;&#x533B;&#x85AC;&#x54C1;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3067;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x9AD8;&#x3044;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x3092;&#x79D8;&#x3081;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3068;&#x8003;&#x3048;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x305D;&#x3053;&#x3067;&#x3001;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3067;&#x69CB;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x5C0F;&#x3055;&#x3044;&#x4E8C;&#x91CD;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x5831;&#x544A;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x307E;&#x3060;&#x5358;&#x306B;46&#x500B;&#x306E;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x304B;&#x3089;&#x306A;&#x308B;&#x4E8C;&#x91CD;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3001;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D6;&#x30DF;&#x30F3;&#x306E;&#x5143;&#x306E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x3092;&#x4FDD;&#x6301;&#x3057;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x3001;&#x816B;&#x760D;&#x58CA;&#x6B7B;&#x56E0;&#x5B50;-&#x3B1;&#xFF08;TNF-&#x3B1;&#xFF09;&#x3068;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x306F;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D6;&#x30DF;&#x30F3;&#x7D50;&#x5408;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002; 3&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x30D0;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EB;&#x306E;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x4EE5;&#x5916;&#x306E;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D6;&#x30DF;&#x30F3;&#x7D50;&#x5408;&#x5074;&#x306E;&#x591A;&#x69D8;&#x5316;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;&#x7C92;&#x5B50;&#x4E0A;&#x306B;&#x5F97;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x30FC;&#x306E;&#x8868;&#x793A;&#x306B;&#x7D9A;&#x3044;&#x3066;&#x3001;&#x4E8C;&#x91CD;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x5358;&#x4E00;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3092;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3068;&#x3057;&#x3066;TNF-&#x3B1;&#x3068;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x5358;&#x96E2;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x304B;&#x3089;&#x5F97;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x914D;&#x5217;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x3044;&#x3066;&#x3001;&#x7B2C;&#x4E8C;&#x4E16;&#x4EE3;&#x306E;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x306F;&#x3001;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x4E8C;&#x91CD;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x306E;&#x5019;&#x88DC;&#x8005;&#x306E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x3092;&#x9AD8;&#x3081;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30D6;&#x30C9;&#x30A6;&#x7403;&#x83CC;&#x306E;&#x8868;&#x9762;&#x8868;&#x793A;&#x306F;&#x3001;TNF-&#x3B1;&#x3068;&#x540C;&#x3058;&#x9078;&#x629E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x306E;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D6;&#x30DF;&#x30F3;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x3067;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306B;&#x6539;&#x826F;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C0;&#x30FC;&#x306E;&#x5206;&#x96E2;&#x3060;&#x3051;&#x3067;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30D1;&#x30E9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30BF;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x4E26;&#x3079;&#x66FF;&#x3048;&#x304C;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3057;&#x3001;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x6210;&#x719F;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x63A1;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x9694;&#x96E2;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30D0;&#x30EA;&#x30A2;&#x30F3;&#x30C8;&#x304C;&#x914D;&#x5217;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3068;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D6;&#x30DF;&#x30F3;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3057;&#x3001;TNF-&#x3B1;&#x3092;&#x5206;&#x6790;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x5206;&#x6790;&#x306F;&#x3001;&#x6700;&#x5F37;&#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C0;&#x30FC;&#x306F;5 nm&#x4EE5;&#x4E0B;&#x306E;TNF-&#x3B1;&#x3068;&#x306E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x540C;&#x6642;&#x306B;TNF-&#x3B1;&#x3092;&#x6A19;&#x7684;&#x3068;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D6;&#x30DF;&#x30F3;&#x3068;&#x3044;&#x3046;&#x9078;&#x5225;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30D1;&#x30E9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30BF;&#x304B;&#x3089;&#x3001;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x4E8C;&#x91CD;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x5019;&#x88DC;&#x304C;bispecificity&#x306E;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B8;&#x30CB;&#x30A2;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x306B;&#x9069;&#x3057;&#x305F;&#x6280;&#x8853;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x30BB;&#x30EB;&#x30BD;&#x30FC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x3068;&#x306E;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x3067;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x30BB;&#x30EB;&#x306E;&#x8868;&#x793A;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x6297;&#x539F;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x9AD8;&#x3044;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x3067;&#x5358;&#x96E2;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x77E5;&#x8B58;&#x306B;&#x3001;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C0;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x307E;&#x3067;&#x306B;&#x5831;&#x544A;&#x6700;&#x5C0F;&#x4EBA;&#x5DE5;&#x4E8C;&#x91CD;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3092;&#x8868;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x3068;&#x8AB2;&#x984C;&#x3060;&#x3051;&#x3067;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x65B0;&#x305F;&#x306A;&#x6226;&#x7565;&#x306E;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x5C06;&#x6765;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x304C;&#x8AAC;&#x660E;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x30EB;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D6;&#x30DF;&#x30F3;&#x7D50;&#x5408;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B8;&#x30CB;&#x30A2;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;Bispecificity

Bispecific &#xD56D; &#xCCB4;&#xB85C; &#xBA74;&#xC5ED; &#xAE00;&#xB85C;&#xBD88;&#xB9B0; &#xBE44; &#xAE30;&#xBC18;&#xB41C; bispecific &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xB192;&#xC740; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xBBF8;&#xB798;&#xC5D0; biotherapeutic &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8; &#xAC83;&#xC73C;&#xB85C; &#xAC04;&#xC8FC; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xAD6C;&#xC870; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xB9CC; &#xC774;&#xB8E8;&#xC5B4;&#xC9C4; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xC791;&#xC740; bispecific &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC0DD;&#xC131;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC811;&#xADFC; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC744; &#xBCF4;&#xACE0;. &#xC885;&#xC591; &#xAD34; &#xC0AC; &#xC778;&#xC790;-&alpha; (TNF-&alpha;)&#xB97C; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC54C; &#xBD80; &#xBBFC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC6D0;&#xB798; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xC720;&#xC9C0; &#xD558;&#xBA74;&#xC11C; &#xC54C; &#xBD80; &#xBBFC; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC73C;&#xB85C; &#xC124;&#xACC4; &#xB41C;, &#xACB0;&#xACFC; bispecific&#xC5D0; &#xB2E8;&#xC9C0; 46 &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAD6C;&#xC131; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0;. &#xC0B4; &#xADE0; &#xC18C; &#xC785;&#xC790;&#xC5D0; &#xACB0;&#xACFC; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB7EC;&#xB9AC;&#xC758; &#xD45C;&#xC2DC; &#xC774;&#xC5B4;&#xC11C; 3 &#xB098;&#xC120; &#xBC88;&#xB4E4; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC758; &#xAD6C;&#xC18D;&#xB825;&#xC774; &#xC54C; &#xBD80; &#xBBFC; &#xCABD;&#xC758; &#xB2E4;&#xC591;&#xD654;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; bispecific &#xB2E8;&#xC77C; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; TNF-&alpha;&#xC640; &#xD568;&#xAED8; &#xC120;&#xD0DD; &#xC601;&#xC5ED;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xACE0;&#xB9BD; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xC0B4; &#xADE0; &#xC18C; &#xC120;&#xD0DD;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC5BB;&#xC740; &#xC21C;&#xC11C;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; 2 &#xC138;&#xB300; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB7EC;&#xB9AC; bispecific &#xD6C4;&#xBCF4;&#xC790;&#xC758; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xB354;&#xC6B1; &#xB192;&#xC774;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC124;&#xACC4; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD3EC;&#xB3C4; &#xD45C;&#xBA74; &#xB514;&#xC2A4;&#xD50C;&#xB808;&#xC774; &#xAC19;&#xC740; &#xC120;&#xD0DD;&#xC758; &#xB300;&#xC0C1; &#xC0AC;&#xC774;&#xD074; TNF-&alpha;&#xC640; &#xC54C; &#xBD80; &#xBBFC; sortings multiparameter&#xC744; &#xAE30;&#xBC18;&#xC73C;&#xB85C; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xBC14;&#xC778;&#xB354;&#xC758; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xBD84;&#xB9AC; &#xAC00;&#xB2A5; &#xD558; &#xAC8C; &#xD558;&#xB294; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xC131;&#xC219;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xACE0;&#xC6A9; &#xD588;&#xB2E4;. &#xACA9;&#xB9AC; &#xB41C; &#xBCC0;&#xD615; &#xB41C; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2F1; &#xD558; &#xACE0; &#xC54C; &#xBD80; &#xBBFC; &#xBC0F; TNF-&alpha;&#xB97C; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xBD84;&#xC11D; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBD84;&#xC11D; 5 TNF-&alpha;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xBC1D;&#xD600; &#xAC15;&#xD55C; &#xBC14;&#xC778;&#xB354;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB274; &#xBA55;&#xC2DC;&#xCF54;. &#xB3D9;&#xC2DC;&#xC5D0; &#xD0C0;&#xAC9F;&#xB41C; TNF-&alpha; &#xBC0F; &#xC54C; &#xBD80; &#xBBFC;, &#xC5EC;&#xB7EC; bispecific &#xD6C4;&#xBCF4; &#xB450; &#xD56D; &#xC6D0;&#xC5D0; &#xB192;&#xC740; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4;&#xC640; &#xACE0;&#xB9BD; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4; &#xC815;&#xB82C;, &#xADF8; &#xC140;&#xC744; &#xC81C;&#xC548; &#xD558;&#xB294; multiparameter&#xC5D0;&#xC11C; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xD615;&#xAD11; &#xC138;&#xD3EC; &#xBD84;&#xB958;&#xC640; &#xD568;&#xAED8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB514;&#xC2A4;&#xD50C;&#xB808;&#xC774; bispecificity&#xC758; &#xC5D4;&#xC9C0;&#xB2C8;&#xC5B4;&#xB9C1;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC801;&#xD569; &#xD55C; &#xAE30;&#xC220;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC9C0;&#xC2DD;, &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xBC14;&#xC778;&#xB354; &#xC9C0;&#xAE08;&#xAE4C;&#xC9C0; &#xBCF4;&#xACE0; &#xB41C; &#xAC00;&#xC7A5; &#xC791;&#xC740; &#xC870;&#xC791;&#xB41C; bispecific &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xACFC; &#xB3C4;&#xC804; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C;&#xC774; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC804;&#xB7B5;&#xC758; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xBBF8;&#xB798;&#xC758; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC744; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB2E8;&#xC77C; &#xC54C; &#xBD80; &#xBBFC; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC73C;&#xB85C; &#xACF5;&#xD559; bispecificity.

Los anticuerpos biespec&#xED;ficos, as&#xED; como no son de inmunoglobulina a base de prote&#xED;nas de afinidad biespec&#xED;ficos se considera que tienen un potencial muy alto en las futuras aplicaciones de bioterap&#xE9;uticos. En este estudio, se presenta un enfoque novedoso para la generaci&#xF3;n de prote&#xED;nas biespec&#xED;ficas muy peque&#xF1;as compuestas por s&#xF3;lo un &#xFA;nico dominio estructural. La uni&#xF3;n a factor de necrosis tumoral &#x3B1; (TNF-&#x3B1;) se ha dise&#xF1;ado en un dominio de uni&#xF3;n a la alb&#xFA;mina al tiempo que conserva la afinidad original para la alb&#xFA;mina, que resulta en una prote&#xED;na biespec&#xED;fico compuesto de solo 46 amino&#xE1;cidos. Por la diversificaci&#xF3;n de la alb&#xFA;mina no vinculante lado del dominio paquete tres-h&#xE9;lice, seguido por visualizaci&#xF3;n de la biblioteca resultante en part&#xED;culas de fago, biespec&#xED;ficos un solo dominio de las prote&#xED;nas se aislaron utilizando selecciones con TNF-&#x3B1; como objetivo. Adem&#xE1;s, bas&#xE1;ndose en las secuencias obtenidas a partir de la selecci&#xF3;n de fagos, una biblioteca de segunda generaci&#xF3;n se dise&#xF1;&#xF3; con el fin de aumentar a&#xFA;n m&#xE1;s la afinidad de los candidatos biespec&#xED;ficos. La superficie de la pantalla por estafilococos fue empleado para la maduraci&#xF3;n de la afinidad, lo que permite un aislamiento eficaz de las carpetas mejoradas, as&#xED; como clasificaciones basadas en m&#xFA;ltiples par&#xE1;metros, con el TNF-&#x3B1; tanto y la alb&#xFA;mina como objetivos en el ciclo de la misma selecci&#xF3;n. Variantes aislados fueron secuenciados y la uni&#xF3;n a la alb&#xFA;mina y el TNF-&#x3B1;-se analiz&#xF3;. Este an&#xE1;lisis revel&#xF3; una afinidad por el TNF-&#x3B1; por debajo de 5 nM para los m&#xE1;s fuertes aglutinantes. Desde el multipar&#xE1;metros clasificaci&#xF3;n que, simult&#xE1;neamente, dirigido TNF-&#x3B1; y la alb&#xFA;mina, varios candidatos biespec&#xED;ficos se aislaron con alta afinidad a ambos ant&#xED;genos, lo que sugiere que la pantalla de c&#xE9;lulas en combinaci&#xF3;n con la clasificaci&#xF3;n celular activado por fluorescencia es una tecnolog&#xED;a adecuada para la ingenier&#xED;a de bispecificity. A nuestro entender, los nuevos ligantes representan m&#xE1;s peque&#xF1;as que las prote&#xED;nas de ingenier&#xED;a biespec&#xED;ficos reportados hasta el momento. Posibilidades y desaf&#xED;os, as&#xED; como posibles aplicaciones futuras de esta nueva estrategia se discuten.

Tove Alm

School of Biotechnology,
Department of Proteomics,
School of Biotechnology, Department of Proteomics

Royal Institute of Technology

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Tove Alm

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Royal Institute of Technology

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

School of Biotechnology,
Department of Proteomics,
School of Biotechnology, Department of Proteomics