当磷酸分子（H₃PO₄）与另外两个分子的两个羟基（-OH）连接，形成两个酯键并除去两个水分子时，就形成了磷酸二酯键。磷酸二酯键通常存在于核酸（DNA和RNA）中，在其结构和功能中起着至关重要的作用

磷酸二酯键将核苷酸连接在一起

DNA和RNA是多核苷酸，或是连接在一起的长链核苷酸。核苷酸由氮基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或尿嘧啶）、戊糖和磷酸分子组成 (PO43-)在多核苷酸链中，核苷酸通过磷酸二酯键连接在一起。当磷酸盐形成两个酯键时，就会形成一个磷酸二酯键。第一个酯键已经存在于磷酸基团和核苷酸的糖之间。第二酯键是通过与第二分子中的羟基(-OH) 反应形成的。酯键的每一次形成都会除去一个水分子。

在细胞内，一个多核苷酸是由游离核苷酸构成的，这些核苷酸有三个磷酸基团附着在糖的 5o碳上。这些核苷酸因此被称为核苷酸三磷酸。在形成磷酸二酯键的过程中，两个磷酸酯丢失，留下一个磷酸基的核苷酸通过酯键连接到5o碳上。核苷酸的5o磷酸分子与另一核苷酸中糖的3o羟基之间形成第二酯键。一类称为聚合酶的酶催化或加速形成磷酸二酯键。

多核苷酸链中的磷酸二酯键形成糖和磷酸盐残基的交替模式，称为糖-磷酸盐骨架。磷酸二酯键赋予多核苷酸链方向性。多核苷酸链的一端有一个游离的5o磷酸基，另一端有一个游离的3o羟基。这些末端分别被称为5o末端和3o末端。核酸的方向性对于DNA复制和RNA合成是必不可少的。