安培电极的制备

摘要

本协议描述了如何生成的碳纤维电极。随后，电极用于检测儿茶酚胺释放囊泡与碳纤维安培。

摘要

碳纤维电极安培测量单细胞囊泡检测儿茶酚胺释放的关键。在这里，我们描述产生低噪声（<0.5 PA）电极所需的技术。从公布的描述，该技术已被修改以前的研究（1,2）。电极是由准备碳纤维和线程到每个毛细管单独使用一个过滤器，真空吸纤维。下一步，与纤维的毛细管被拉到一个电极拉马，创建两半，每一个细尖。电极浸在热，液体环氧树脂与固化剂混合，以创建一个环氧玻璃密封。最后，电极置于烘箱中固化环氧树脂。电极小心处理，以确保它们是一致和无损伤的关键。此协议显示了如何从单细胞记录安培的电极制造和切割。

研究方案

第1部分：碳纤维的制备

1. 切割长度〜1.25 X的毛细吸管长度的碳纤维束（使用7微米直径）。
2. 煮沸删除上浆〜100毫升的容器中的丙酮，并添加纤维热，煮沸30分钟或更长的时间丙酮。
3. 删除从温暖丙酮的纤维，并转移到一个干净的烧杯50-100毫升新鲜丙酮。
4. 放置在一个开放的150毫米培养皿的捆绑和airdry通宵干纤维。

第2部分：消防抛光玻璃毛细管

1. 消防波兰每个毛细管（我们使用微，血细胞比容毛细管，1.5毫米外径，内径1.3毫米，7.5厘米长）在该中心举行的管钳和揭露结束flame.Rotate管约3倍，而在火焰。
2. 反转管，放入火焰的另一端，再旋转的3倍。
3. 放置在一个玻璃皿中的火抛光管，并转移到烤箱，直到他们准备与碳纤维填充。

第3部分：线程进入毛细管的碳纤维

1. 马查多等人的描述相似。 （2008年）和Mundroff怀特曼（2002年），吸进使用塑料管材管连接过滤器，以真空玻璃纤维。
2. 切纤维用纤维管出一个scalpel.Leave ¼英寸。

第4部分：拉动电极拖轮移液器纤维

1. 放入电极拉马（我们使用Narishige日本型号：PP - 830）毛细管，并拧紧旋钮毛细管举行的地方。
2. 操纵交换机执行两个拉，在最佳拉马设置。
3. 一旦吸管拉到一半，分开的两部分，由中心用剪刀切割裸纤。
4. 删除每个电极的一半，拉凸出的纤维，以打破玻璃seal.Trim纤维与管外的左使纤维只有1 / 8英寸的剪刀。
5. 重复步骤1-4，直到被拉到约16纤维电极。

第5部分：环氧玻璃密封

1. 热的环氧预先作出等分一个热点板块设置为55℃，在通风橱6分钟。
2. 虽然环氧树脂加热，包装成束，用胶带〜16拉电极。
3. EPON树脂加热6分钟后，加入0.7克XOF MPDA热EPON树脂（14％，W / V）混合纷飞的小瓶。
4. 浸入电极束，加上约20秒热环氧树脂固化剂solution.After的足够数量的环氧将通过毛细作用进入玻璃提示。
5. 束，放置电极槽和撤消到纸板放置在烤箱托盘设置为100 ° F。
6. 至少在48小时后，检查下解剖microscope.Discard电极与环氧不填写，有被砸提示，有一个以上的纤维，etc.After检查每个电极，放在纸板人背部和每个电极到oven.Electrodes通常加工后的1个月的良好。

第6部分：切碳纤维

1. 放置碳纤维电极仔细到载玻片铁氟龙胶带。
2. 在解剖显微镜下可视化的提示。
3. 用干净的手术刀刀片跨越碳纤维垂直放置对一个细胞的碳纤维离开平坦干净的表面。

讨论

本协议描述了如何生成和减少安培的电极。安培录音期间，碳纤维电极放在对一个分泌细胞的表面。 Exocytotic活动是观察安培的峰值，这表明的儿茶酚胺的氧化后的电子转移所造成的电化学电流。与实践和切割安培电极，可大大改善噪音水平超过许多市售电极。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Epoxy Hardener 1,3-phenylene-diamene flakes	Reagent	Sigma-Aldrich	P23954-100G04 716AJ	Aliquots are stored in a dessicator and should not be exposed to light.
Carbon Fibers	Material	Goodfellow	C005725
Micro-Hematocrit Capillary Tubes	Material	Fisher Scientific	NC9836768
Epoxy Resin	Reagent	Miller-Stephenson	Epon Resin 828
Dissecting Microscope	Instrument
Electrode Puller	Instrument	Narishige International	PP-830	1st pull = 24.8 degrees C; 2nd pull = 62.7 degrees C
Oven	Instrument			set to 100 degrees F.
Hot plate	Instrument			set to 55 degrees C