突触小泡池，利用苯乙烯染料的光转化的研究

摘要

调频染料已宝贵的帮助，在突触动力学的理解。外长荧光显微镜下通常遵循在不同的刺激条件下。然而，与电子显微镜相结合的FM染料的光转化允许不同的突触小泡池的可视化，以及其他超微结构组件，在突触boutons。

摘要

突触囊泡与质膜（胞吐）的融合是一种神经递质的释放和神经元沟通的必要步骤。囊泡，然后从质膜（内吞作用）检索与一般泳池内的神经末梢的囊泡和分组，直到他们接受一个新的外和内吞作用周期（囊泡循环）。这些过程进行了研究，利用各种技术，如电子显微镜，电录音，安培和电容测量。更重要的是，在过去二十年了荧光标记的标记出现，使光学技术囊泡回收动态跟踪。最常用的标记之一是苯乙烯或FM ^染料 1;结构，所有的FM染料含有亲水性的头部和亲油性的尾部通过芳香环和一个或多个双键（图1B）连接。一个古典调频染料实验，以标签的小泡池组成，在洗浴过程中的神经刺激的准备（图1Ai）（电动或^高 K +）与染料。这种诱导囊泡循环和随后的染料加载到最近内吞囊泡（图1A _{I - III）。}用染料，染料免费洗澡的刺激第二轮装载水泡后会触发通过胞吐FM释放（图1A _{IV - V），}可以通过监测荧光强度降低（脱色）的过程。

虽然调频染料囊泡循环领域作出了巨大贡献，它是不可能的，以确定使用传统的荧光显微镜下精确定位或个别囊泡形态。出于这个原因，我们在这里解释调频染料，还可以通过光转化为使用电子显微镜吞标记，。光转化技术，利用荧光染料的财产，以强烈的光照下产生的活性氧物种。荧光标记的准备工作都淹没在含有二氨基联苯胺（DAB）解决方案和照明。染料分子产生活性物种的氧化，形成一个稳定的，不溶性沉淀物，有一个黑暗的外观，可以很容易地在^电子显微镜2,3杰出民建联。正如民建联只在紧邻的荧光分子（如活性氧是短命）的氧化，该技术确保只荧光标记的结构是将含有电子致密沉淀。因此，该技术允许积极回收细胞器的确切位置和形态的研究。

研究方案

1）准备果蝇神经肌肉交界处（NMJ）

1. 准备标准果蝇生理盐水（氯化钙₂ 2毫米，130毫米，36毫米蔗糖氯化钠，氯化钾5毫米，2毫米氯化镁_2，5毫米HEPES，pH值7.3 ^4。
2. 解剖生理盐水（1.1）的准备工作。果蝇幼虫背侧是不眠不休在Sylgard菜;背侧纵向切片，和内部器官将被删除。然后拉伸和不眠不休的准备工作。然后可以使用几个腹侧肌肉。

2）刺激和FM染色

1. 可取的做法是在光线不足的条件下做的所有下列步骤，以保护漂白调频染料。
2. 化学刺激的神经，含钾高的缓冲区使用。准备果蝇生理盐水（见1.1），含氯化钾90毫米和10 FM1 -​​ 43染料微米。保持避光的解决方案。
3. 与先前准备的缓冲1分钟，在室温下沐浴的准备。
4. 与标准果蝇生理盐水（1.1）洗删除外，FM1 -​​ 43染料。迅速进行固定。

3）固定

1. 巴斯准备在磷酸盐缓冲液（PBS）用2.5％戊二醛在室温为45分钟。形态特征的保存好，以多聚甲醛戊二醛是首选。
2. 用PBS洗一次，然后离开NH _{4 CL} 100毫米淹没在15分钟的准备。这一步是为了解渴剩余的戊二醛固定液的自由醛基。
3. 正常PBS洗的NH _{4 CL}解决方案。

4）光转化

1. NMJ准备孵育30分钟，在4 °彗星在PBS含1.5毫克的二氨基联苯胺（DAB）ML - 1。
2. 荧光显微镜下样品的位置。查找和集中使用相对低倍率水浸泡的目的（20X 0.5 NA）的荧光信号。
3. 照明灯强度最大的样本，直到FM染料是完全漂白（图1C）。要控制，如果光转化有发生，建议在透射光下检查样品前后FM染料脱色一步。如果光转化发生，深褐色沉淀预期（图1C）。光照时间是可变的，取决于后的光照强度，并呼吁民建联渗透进入准备也。对于大多数准备工作，我们发现〜30-45分钟的光照时间是最佳的，当使用20倍的目标。较短的光照时间用于更高的放大倍率目标（60X）。
4. 用于照明，我们更愿意使用水银灯泡，一盏灯，一回镜子，收集背散射光束，因此增加总强度的住房。

5）处理EM样本

1. Osmication
   1. 准备一个体积水树量的四氧化锇每个样品（约300μL）的解决方案。使用四氧化锇必须做的引擎盖下，使用手套和赞成保护设备的工作。
   2. 孵育锇酸溶液在室温（引擎盖下）1小时的准备。
   3. 广泛洗净用PBS（4-5倍，5分钟），每个样品转移到一个干净的玻璃瓶中。
2. 脱水
   1. 准备单独的解决方案，包含30，50，70，90，95和100％的乙醇。
   2. 每个样品中加入1毫升30％乙醇5分钟。
   3. 1毫升50％的乙醇添加到每个样品5分钟。
   4. 5分钟，每个样品中加入1毫升70％的乙醇。
   5. 5分钟，每个样品中加入1毫升90％的乙醇。
   6. 5分钟1毫升95％的乙醇添加到每个样品重复3倍。
   7. 5分钟1毫升100％的乙醇添加到每个样品重复3倍。
3. 嵌入和进一步处理
   1. 1体积EPON树脂混合乙醇量。将它添加到编制下连续旋转（2-4小时）。
   2. 放置在100％EPON开放烧瓶的准备，让剩余的乙醇蒸发（4-6小时）。
   3. 在60℃放置36小时在模具的准备。
   4. 电子显微镜处理。工艺编制在50-80纳米的薄片，用标准的超薄切片程序。
4. 电子显微镜成像
   1. 影像使用传统的电磁程序的准备工作。

6）代表性的成果

图1C和2概述了预期的成果。在照明人权法的形成过程结果WN民建联的沉淀物，这将是在荧光和传输成像可见。第一次出现是在照明的FM染料染色的荧光消失。醛固色剂引起的背景荧光，相反，将在整个实验过程中可见。漂白〜10-20分钟的地方，通常后的照明开始。没有光转化产品通常可以观察到在这个时间点。

照度应继续〜10分钟后的筹备工作会变成棕色遮阳由于民建联的积累（图_1C四），目前还不清楚为什么民建联降水和FM染料褪色不同时发生，这是一个比较大的氧化民建联量需要积累前聚集和沉淀，因此，这种反应是比漂白过程慢。然而，在这个阶段，准备不准备电子显微镜处理，如民建联的降水可能是不完整的。我们宁愿等待5-10分钟的时间，在这期间准备（突触前神经终端）承担了深褐色（或黑色）的颜色，完成转换的指示。可以观察到在这个阶段的编制一般表面有轻微的转换（例如，在神经肌肉交界处的肌纤维）。它是最有可能涉及到的民建联诱导自体荧光（和/或固定液荧光）的转换，而且它不是有害的程序。

电子显微镜的准备工作，然后处理，并应检查存在暗（标记）囊泡。正如我们在^5,6证明，这些囊泡比非标记的多密集，因此很容易区别开来（图2B ）。为了增加以及区分不同类型的囊泡的机会应该是执行，没有对比增强后的部分染色（无醋酸铀或柠檬酸铅染色）;锇染色足以观察到大多数的细胞成分，而不是作为民建联沉淀黑暗。

图1：FM染料和光转化为使用 。 （a）代表一个用于装载和distaining囊泡的刺激下使用调频染料的经典实验的步骤。 （ 一 ）在FM染料孵育样品含有缓冲区。 （ 二 ）电或化学刺激（）来诱导调频染料存在囊泡融合。 （ 三 ）刺激后的序列的内吞作用将负载与FM染料仍然在细胞外的缓冲区目前一些水泡。 （ 四 ）更换外FM染料，用缓冲液冲洗。 （五）新的刺激会诱发加载囊泡胞吐作用释放后，他们的调频染料。 （二）示意图显示头部，桥梁和FM1 - 43染料的尾巴。 （三）在果蝇 NMJ的光转化实验的例子。 （ 一 ）加载后FM1 - 43清洗外部的染料分子和固定，NMJ，荧光的神经终端，可以观察到与传统epifluorescence的显微镜（63X ）。 （II - III）在连续照明的染料是完全漂白。 （ 四 ）当照明持续下去，会出现一个黑色由于二氨基联苯胺沉淀。比例尺代表10微米。

图2：EM photoconverted样品的例子（ 一 ）图像显示了神经末梢突触囊泡，但他们不photoconverted;这可能是没有足够的照明，或在组织中的差二氨基渗透造成的。 （二）与几个暗（填写）囊泡通过调频光转化突触布顿。 （三）以上的照明结果在整体暗的终端，没有水疱或细胞器是区分。比例尺代表200纳米。

讨论

应考虑几个关键步骤：

• 民建联的潜伏期后，才应彻底清洗和淬火的准备。否则非反应的戊二醛将与民建联，并导致其降水（通常在平面晶体的形式，这是不是电子致密）。这种沉淀大量发生的筹备工作是很少用于电子显微镜使用。
• 照明时间应优化，测试与几个不同的光照时间相同的筹备工作。根据我们的经验，实现最佳的转换（图2B）在5分钟左右的时间窗口（例如，35至照明开始...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
FM 1-43	Invitrogen	F10317
Epon resin	Plano GmbH	R1030
di-aminobenzidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	D5905
50% Glutaraldehyde	AppliChem	A3166	EM grade
Sylgard	Dow Corning	104186298
Axioskop 2 FS plus	Carl Zeiss, Inc.
Objective 20x 0.5 NA	Olympus Corporation		Dry objective
100W Hg Lamp	Carl Zeiss, Inc.
Lamp housing with back mirror	Carl Zeiss, Inc.	1007-980
MRm camera	Carl Zeiss, Inc.	0445-554	Image acquisition
Ex. Filter (HQ 470/40)	AHF	F49-671
Dichroic (495 DCLP)	AHF	F33-100
Em. Filter (HQ 500 LP)	AHF	F42-018
EM	Carl Zeiss, Inc.
Proscan CCD HSS	Proscan Electronic Sys.		1024 x 1024