脑室周围白质软化的小鼠模型

摘要

我们建立了脑室周围白质软化（PVL），早产儿脑室周围脑白质病变​​为特征的主导性脑损伤的小鼠模型。 / /没有全身性感染的缺氧缺血PVL的主要原因。单侧颈动脉结扎和缺氧暴露/无脂多糖注射创建在P6小鼠PVL的样病变。

摘要

我们描述了一个小鼠模型的建立脑室周围白质软化（PVL）的协议。 PVL的是早产儿脑损伤和脑瘫最常见的前因的主要形式。 PVL的特点是突出的少突胶质细胞损伤脑室周围脑白质损伤。有或没有全身性感染/炎症缺血缺氧/ PVL的主要原因。我们使用P6小鼠创建缺氧/缺血诱导或新生儿脑损伤，无全身性感染/炎症暴露于缺氧或不注射内毒素脂多糖（LPS）单侧颈动脉结扎模式。髓鞘碱性蛋白（MBP）O1和电镜观察免疫组化显示脑白质突出的髓磷脂损失，额外伤害，海马和丘脑。 PVL的小鼠模型的建立将大大方便了使用可用的转基因小鼠品系，在一个相对较高的吞吐量的方式，以确定治疗药物的候选药物试验的传导，以及干细胞移植的测试，使用免疫缺陷的小鼠品系的疾病的发病机制的研究。

研究方案

在P6小鼠建立新生儿脑损伤的详细程序：

1. 产后第6天（六）小鼠对有害刺激的反应迟钝，以深麻醉点冰间接冷却麻醉。
2. 中线腹切口用酒精清洁皮肤，在颈前。
3. 在解剖显微镜下，右侧颈总动脉分叉处是上前轻轻收回肩胛舌骨和胸锁乳突肌。
4. 颈动脉鞘周围筋膜被删除，从附近的迷走神经和交感神经节与一个钩子的孤立和近端内部分支。颈内动脉，然后使用烧灼提示，烧灼。
5. 烧灼，皮肤切口缝合，直到完全清醒，然后返回到大坝的动物是保持温暖。
6. 结扎后1小时，动物被放置在一个密封腔，用氮气注入至_6.0％，达到O 2的水平。该动物暴露在缺氧35分钟。
7. 缺氧暴露后，鼠标恢复为30分钟（33℃）加热垫，然后返回到大坝。动物是创造脑损伤合并缺氧/缺血和感染/炎症，然后注入0.015毫升脂多糖（LPS 1毫克/公斤）的腹腔。
8. 四天post-hypoxia/ischemia，小鼠麻醉反应迟钝点冰间接冷却有害刺激，然后用生理盐水和4％多聚甲醛灌注。大脑将被删除，并cryoprotected。

图1脑缺氧/缺血小鼠模型与H＆E染色损伤的表征。有灶性坏死，脑白质（箭头）（一）颈动脉结扎患侧较对侧脑白质（二）。在海马（C）和丘脑（四）在患侧脑白质损伤的大脑同侧坏死和联络microinfarcts观察。

代表性的成果和数据：

PVL的小鼠模型与缺氧/缺血和/或炎症感染/取得暴露于缺氧及注射LPS单方面颈内动脉结扎术。我们定义为适合PVL的模式新的小鼠模型。冠状切片染色与苏木精和曙红（H＆E）在整个前脑的神经病理检查发现大脑半球同侧颈动脉结扎（ 图 1A）在中央白质灶性坏死，神经元的相对不遗余力地覆大脑皮层相比，对侧脑白质（ 图1B）。在局灶性坏死脑白质，有显着增加巨噬细胞和反应性星形胶质细胞组成的细胞结构，局灶性人类PVL的特点。在对侧中央白质，少突胶质细胞的细胞核被安排在丛生状束，这个架构是完全由同侧灶性坏死破坏。值得注意的是，我们还观察患侧脑白质损伤的大脑同侧坏死（ 图1C）在海马和丘脑（焦点microinfarcts）（ 图1D）。人力PVL的，也不会出现在完全隔离，​​从伴随灰质病变。 PVL的标志，是相对的，虽然不是完整的，不遗余力脑皮层覆盖在受伤的白质 - 一个功能，我们认为是存在于我们的小鼠模型。

图2。评分0-5规模评估脑白质损伤，脑室周围白质软化的小鼠模型中MBP或O1。

我们的小鼠模型显示PVL的特点，同时在表型和分子水平。我们已经用髓鞘碱性蛋白（MBP）或O1 -抗原的免疫细胞化学检测，以评估损伤，已经建立了一个标准的规模从0到5，得分脑白质损伤（图2），并有特点的脑白质病理（图3）。最近，一个不带偏见的体视学测定已实施最初的半定量的方法来代替。此外，测试功能结果脑白质损伤的相关性的影响，我们已完成对运动功能的行为测试。我们已经证明，小鼠表现出惊人的运动障碍，P10 - 21以下缺氧/缺血加LPS在小六。我们建立了0-4分的评分标准来定义损伤小鼠P10对侧肢体功能障碍-21。通常情况下，正常小鼠可以炸了一个30 °倾斜（4分），并爬上45 °斜面无滑动（3分）。损伤小鼠的脑白质损伤的程度较低的相关性得分。

图3。MBP或O1的染色和电子显微镜（EM）的髓磷脂结构脑白质损伤的表征。 MBP和弧菌染色显示髓磷脂损失结扎患侧脑白质相比，对侧脑白质。 EM检查显示脑白质髓鞘的轴突结扎对侧，患侧脑白质退化的组织。

我们预计，PVL的新的小鼠模型的建立，将使我们能够研究的未成熟脑PVL的样损伤的具体机制。我们将讨论使用转基因小鼠品系的发病机制研究单个分子的利益的作用和评估的神经保护作用的目标。

讨论

发育中的大脑损伤导致破坏性的神经系统的后果。引人注目的是，围产期脑损伤的模式是高度依赖年龄。足月儿，它主要影响大脑皮层与特征的神经元损失。然而，在早产儿中，有选择性，突出发展少突胶质细胞损伤影响脑的白质，无序称为脑室周围白质软化（PVL）。在早产儿脑损伤的问题的严重性是非凡的。早产和改善新生儿重症监护，导致近90％的13万世界各地的早产儿与出生体重低于1500克，即非常低出生体重婴儿出生，每年（在美国大约56000）的生存。大约10％的幸存者随后表现出脑性麻痹，约50％的认知和行为的赤字。 PVL的是最重要的脑病理基本早产儿脑瘫。没有PVL的具体治疗目前存在的部分，因为发病机制尚未很好地理解^，1,2 。

虽然PVL的病因是多因素的孕妇宫内感染，围产期缺氧/缺血被认为是一个PVL的首要原因。一个PVL的缺氧/缺血模型大鼠在P7的先前已成立^3。这种模式是独一无二的，它类似于在早产儿PVL的。这种模式的特点是有选择性的脑白质病理，相反大多数中风模型的特点是由灰质梗死。然而，在大鼠缺氧缺血模型的局限性不容忽视。首先，PVL的病因通常是多方面的。除了缺氧/缺血，孕产妇，胎儿感染/炎症PVL的是紧密联系在一起。因此，结合缺氧/缺血和感染/炎症可能会创造更多PVL的类似机型。最PVL的病变（24-32孕周）的最大风险与人类发育时期相关的啮齿类动物的年龄是出生后，因为少突胶质细胞分化主要是在啮齿类动物的产后事件。由于它是不可能产生产后年龄产妇胎儿感染/炎症，它是合理的，以模拟在有关产后发育阶段的感染创造了PVL的啮齿动物模型。我们力求结合起来，在缺氧/缺血模型小鼠在小六LPS注射，以产生更多的临床相关PVL的病变。二，最优的概念证明型的致病作用的分子实验方法，必须使用转基因小鼠遗传操作比鼠标在大鼠更难。因此，我们必须寻求转换鼠标大鼠PVL的实验模型。

PVL的小鼠模型，将极大地促进1）利用现有的转基因小鼠品系的疾病的生物学和发病机制的研究; 2）进行药物试验，发现具有治疗潜力的候选人的代理人; 3）使用免疫缺陷的小鼠品系的干细胞的实用测试。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
LPS	Sigma-Aldrich	L4130
Hypoxia Chamber	BioSpherix	A-30274
Surgical hook	F.S.T.	10064-14