在哺乳动物细胞的RNAi筛选使命esiRNA

摘要

这里我们使用一个参与细胞分裂的基因的高通量筛选人类esiRNA库。我们演示了如何设置和行为的​​一个esiRNA屏幕，以及如何分析和验证的结果。

摘要

RNA干扰（RNAi）是一个基本的细胞的基因表达调控机制。 RNAi是诱发又称小干扰RNAs（siRNAs）的短双链RNA的。源自较长的双链前体蛋白的RNase III家族的内切酶Dicer酶，活性的短双链RNA。产生的碎片的RNA诱导的沉默复合体（RISC）的组成部分，它的同源靶mRNA。 RISC切割靶mRNA，从而降低了编码的蛋白质^的表达1,2,3。 RNAi技术已成为一个强大而广泛用于哺乳动物细胞基因功能研究的损失，利用小分子干扰核糖核酸的实验方法。

目前两种主要方法可用于生产小分子干扰核糖核酸。一种方法涉及化学合成，而一种替代方法，采用由核糖核酸酶III 在体外 ，针对特定的长双链RNA的endonucleolytic裂解。从而，不同的寡核苷酸的siRNA池产生的，这也是已知endoribonuclease准备的siRNA或esiRNA的。化学衍生的siRNA和esiRNAs疗效比较显示，两个触发器强有力的靶基因沉默。然而，差异可以看出，当比较的特殊性。许多单一的化学合成的siRNA产生显着的脱靶效应，而esiRNAs固有的复杂混合物导致一个更具体的^击倒 10 。

在这项研究中，我们目前的基因组规模的使命esiRNA库，它体现为在参与细胞周期进程的基因识别的DNA含量的屏幕RNAi筛选的利用率的设计。我们将展示如何优化转染协议和高通量筛选的检测。我们也表现出多么大的数据集，可以评估统计学和目前的方法来验证的主要命中。最后，我们给潜在的出发点，进一步验证点击功能刻画。

研究方案

1。高品质的使命esiRNA库

1. 对于每一个感兴趣的基因的RNAi最敏感和最具体的目标区域是选择利用DEQOR算法^{（http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html）4。DEQOR}分数所有的沉默潜力可能21目标的mRNA核苷酸长的siRNA基于国家的最先进的设计约束^4。此外，每一个潜在的siRNA是执行BLAST搜索对有机体的转录研究分析可能与其他基因的交叉反应。该方案，从而提供了一个分析的潜在esiRNA（300-600 bp的长度）的整体素质和跨沉默的能力。
2. 选择区域的目标基因的cDNA使用两旁的噬菌体RNA聚合酶启动子序列的基因特异引物进行PCR扩增。
3. 每任务esiRNA生产所用的PCR产物是核实身份，经测序和纯度卡尺Labchip分析。
4. 长双链RNA是由RNA聚合酶的转录链退火，转录PCR产品。
5. esiRNAs准备长期使用RNaseIII随后通过阴离子交换色谱法，利用Q -琼脂糖凝胶离心柱纯化的双链核糖核酸酶消化有限。
6. esiRNAs沉淀和TE缓冲液悬浮。收益率是衡量紫外吸收测量和浓度是由溶解在TE缓冲液中的一个适当的音量调整。最终产品的整体质量检查卡尺Labchip分析。

2。选择一个单元格的行和优化筛选转染

1. esiRNA（使用Eg5积极和海肾荧光素酶作为阴性对照），增加金额在384孔板转染试剂滴定金额，增加细胞孵育48小时。 Eg5是一个kinesin的电机双极纺锤体组装和枯竭所需的蛋白质，导致有丝分裂逮捕。重复此过程中，不同的转染试剂和细胞株。在这里，我们使用以下的标准程序和oligofectamine转染试剂（Invitrogen）的HeLa细胞培养。
2. 选择最佳的转染条件计数转染的细胞有丝分裂逮捕（圆形）与海肾荧光素酶（RLUC）esiRNA转光镜细胞总数与Eg5 esiRNAs。选择RLUC至少毒性和最明显的表型为Eg5的条件。
   为优化转染条件的另一种方法涉及一个稳定的细胞系，表达EGFP（或其他合适的报告基因）的控制下构的积极推动者。转染后对EGFP（或其他报告基因）和RLUC（或其他合适的阴性对照esiRNA）的措施击倒如荧光辅助细胞分选（FACS）的疗效和毒性的esiRNA。请确保使用的EGFP esiRNA是完全互补的靶mRNA的。

3。设置主屏幕^5,6

1. 优化自动移液工作站（如宝瓶，特餐和WellMate，矩阵）的所有组件使用的移液精度。由于吹打参数变化的解决方案，体积和板型的类型而定，优化，分别为每一步反复。如果可能的话，移液站应放置在层流罩下，以避免污染。所有的组件在使用前应进行消毒，高压灭菌，如果适用或用75％乙醇喷洒。优化洗涤协议，使交叉污染，从好到被排除了。优化自动移液的详细信息，不能给空间约束，主要取决于所使用的移液工作站。如需进一步信息，请参阅制造协议。
2. 384格式的转染细胞Eg5和RLUC esiRNAs使用上述优化的条件。使用Eg5 RLUC esiRNA交替模式，覆盖了整个板块。
3. 孵育48小时后用冷水100％的乙醇修复细胞，补充水分的PBS 15分钟，25分钟PBS中含有1微克/毫升的DAPI和100μg/ ml的RNA酶A（QIAGEN）染色。最后用PBS和存储在4 ° C。
4. 如奥林巴斯ScanR系统的DAPI荧光显微镜测量强度。通过绘制细胞数量的DAPI强度生成直方图和评估，由G1期细胞百分比计算与DNA含量的2N的细胞周期分布; <2N> 4N S期;为G2/M-phase 4N > 4N非整倍体/多倍体。
5. 评估的结果在板的同质性。需要进一步优化，如果效果显着差异，排除位置EFFECTS。使用多孔板时常见的问题是在孵化过程中时间的边缘井增强蒸发。这导致了不同的实验条件，在不同的井，这往往转化为具体影响板位置。出于这个原因，我们建议，离开屏幕边缘井空。为了进一步减少蒸发确保孵化器在高湿度保持。我们还定期聘请障碍，如康宁透气封箱胶带，阻止水分蒸发的蒸发。其他资源位置效应也必须考虑到，如读出系统的技术变化（显微镜，酶标仪等）或液体处理的变化（渐变，不均匀性的解决方案等）。
6. 统计阳性​​和阴性对照之间的差异提供了就业的检测意义的一项措施。一个阴性对照（或背景噪声;模拟控制）之间较大的差异和样品才开始实际筛选确定。统计学意义的一个很好的措施是Z因素。 z因子下列公式计算：
   ，Z = 1 - （3 SD _[样本] + 3 SD _{[模拟]）*（|}音像_[示例] - AV _[模拟] ^|）-1;与SD：标准差; AV：平均。 z因子为1> Z> 0.5表示一个阴性对照组显着性的分离^，从7阳性对照（和噪声）。

4。主屏幕

1. 准备384孔组织培养板转染对利用上述优化条件下的esiRNAs。在这里，我们使用15ng esiRNA每口井在5μLTE缓冲液溶解。每盘至少有8个控制仓位应装有合适的正面和负面的生物研究过程的控制（在这里：Eg5和RLUC）为了避免位置效应边缘井装载与5μLTE缓冲液。
2. 添加5μLOptiMEM0.2μlOligofectamine（Invitrogen公司），其中包含每口井，混合和20分钟在室温下孵育。
3. 添加到转染混合物（在这里：在25个细胞/μL浓度的HeLa细胞悬液40μl;相当于1000个细胞，每孔）的细胞悬液，孵育72小时。
4. 测量DNA含量的自动显微镜（奥林巴斯ScanR，见上文）。评估击中选择使用的Z -得分统计：所有样品为阴性对照作为参考信号esiRNAs计算Z分数。请注意，Z - score模型是不相同的z因子。 Z分数提供了一个统计意义的样本值比较（模拟）控制措施。它是下列公式计算：
   Z =（值_[样本] -平均_[模拟]）*标准偏差_[模拟] ^-1。
   对于命中选择一个门槛已经得到应用。通常情况下，显着性标准，如：2 评价圣马洛等8）。

5。二次屏幕和命中验证

1. 一个次要的画面如下，以消除因实验错误或脱靶效应误报的主屏幕。对于选定命中的主屏幕使用相同的程序应反复更大的重复数（3-5），以便更好的统计评价。
2. 对于核实点击次要的非重叠esiRNA对在初始屏幕上确定的目标（或另一种非重叠的沉默触发）应使用。应适用相同的检测和读出主屏幕。
3. 最终选定的基因可以被验证的跨物种的^RNAi救援9。从而，一个细菌人工染色体（BAC），如该基因的小鼠同源编码是稳定转染到细胞中。 BAC -构造保存在其基因组范围内的基因，并允许一个近乎生理的表达。对人类内源性基因的RNAi将离开鼠标转基因表达的改变抢救RNAi的表型。 RNAi的救援提供核查提供最新的RNAi表型的金标准。
4. 最后，经审定的候选人更详细的研究，最终推导出机械的理解。在许多情况下，RNA干扰可以使用在这些实验中，例如在次要的，更详细的分析。

讨论

RNA干扰已成为标准的技术研究丧失功能的表型。 RNAi的调解员的大型集合来自不同供应商提供了一个容易，成本效益和快速的基因沉默方法。这打开门系统的筛选在许多生物过程中，允许在不同的物种和细胞类型的广泛的基因组规模的角度来看关键球员。

高的假阳性和假阴性率是在RNAi屏幕的共同挑战。为了解决这个问题，已经投入了相当大的努力来提高疗效，特别是沉默的特异性触发。一个重要的发现是一个不同的siRNA针对相同的成绩单池，大大增强了目标的特殊性。因为一个非常复杂的池不同的siRNA是endoribonuclease生产的，esiRNAs高的目标特异性触发，降低假阳性率在RNAi屏幕。 esiRNAs也展示了实现高效击倒，也减少了假阴性率。

由于RNAi的屏幕技术要求高，他们可能会保持具有挑战性的执行了一段时间的例行。然而，试剂和仪器获得更好的和更多的实验室分享其专业知识，运用现代生物学的RNAi屏幕被视为在未来增加。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MISSION esiRNA	Sigma-Aldrich		For additional information contact: rnai@sial.com
Wellmate	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Breathable sealing tape	Corning	Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345)
OptiMEM	Invitrogen
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof (absolute), for molecular biology
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5493	BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Sigma-Aldrich	D8417	Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC)
Ribonuclease A from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	R6513	For molecular biology, ≥70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder
Tris-EDTA buffer solution	Sigma-Aldrich	T9285	100 x, for molecular biology