在录制多细胞行为黏细菌生物膜，使用定时Microcinematography

摘要

研究黏细菌群的行为，我们设计了一个时间推移microcinematography协议，可用于不同的检测修改。它采用的是标准的显微镜适应增长的条件下，使用价格低廉，可重复使用的硅胶垫片，并产生可重复的结果。我们已经用这种方法来量化的多细胞的趋化。

摘要

δ- proteobacterium 黏细菌群包含数以百万计的细胞作为一个集体，协调运动通过一系列信号来创建复杂的，动态的模式，为应对环境线索。这些模式是自我组织和应急，他们无法通过观察单个细胞的行为的预测。使用时间推移microcinematography跟踪检测，我们确定了一个鲜明的新兴模式，在M. xanthus所谓的趋化作用，作为一个群的定向运动了对营养^源 1梯度定义。

为了有效地表征microcinematography趋化通过时间推移，我们开发了一个高度修改板复杂（图1）和建造的8显微镜（图2），每一个能够捕捉时间推移视频集群。检测是严格的，足以让一致的，可量化的数据复制，产生的视频，让我们来观察和跟踪群行为的微妙变化。一旦捕捉到的视频转移到分析/存储计算机与足够的内存来处理和存储成千上万的视频。此设置的灵活性，已证明是有益的几个成员的M. xanthus社会。

研究方案

用品需要：

• Klett米
• 移液器和提示
• 2.5毫升离心管
• 离心
• CTTYE媒体：
  • Casitone 1.0％（DIFCO实验室），0.5％的酵母提取物（DIFCO实验室），
  • 10.0毫米的Tris - HCl（pH值8.0），1.0毫米的KH ₂ PO _{4，硫酸镁} 8.0毫米
• TPM的媒体：
  • 10.0毫米的Tris - HCl（pH值8.0），1.0毫米的KH ₂ PO _{4，硫酸镁} 8.0毫米
• 琼脂糖
• 置水浴至55 ° C
• 显微镜幻灯片
• 大型盖玻片
• 2 × 2厘米，0.5毫米厚的硅橡胶垫片（格雷斯生物实验室公司）
• 封口膜（或磁带标签）
• 镊子
• 小长尾夹
• 微取样吸管（费舍尔）
• 100μL玻璃一次性提示（费舍尔）
• Kimwipes

第1部分：细胞制备

开始创造一个无菌的环境。

• 清洁工作区，唐手套，光刻录机。

1. 开始接种到含有CTTYE肉汤瓶和大力纷飞在黑暗中32℃孵育过夜培养的细胞。
2. 文化一旦达到了5 × 10 ⁸个细胞/ ml成2.5 ml离心管，吸管1毫升细胞的密度。
3. 16,000 XG（或最大速度）2分钟离心沉淀细胞。
4. 倒出并丢弃上清液。
5. 洗细胞沉淀用1 ml TPM（盐平衡，营养的自由媒体）。
   • 重新挂起和涡
6. 重新颗粒细胞为16,000 XG（或最大速度）2分钟旋转。
7. 倒出并丢弃上清液。
   
   关键的一步
   
   
8. 完全重新悬浮颗粒在100μLTPM的使用相结合的吹打和涡旋媒体。
   
   重要提示：此步骤可确保有没有留在管细胞团块。这可能需要一段时间。
9. 设置在室温下的细胞，预留而准备的跟踪检测板。

第2部分：琼脂的制备

1. 准备50毫升TPM（化验媒体）和CTTYE（营养磁盘）媒体。
2. 添加0.5克琼脂糖（琼脂糖低于琼脂衍射）。
3. 高压灭菌消毒。
4. 灭菌后，媒体保持在55 ° C在孵化器（或水浴），而建设的跟踪检测板配合。

第3部分：营养磁盘建设

1. 火焰灭菌的玻璃显微镜玻片上放置一个0.5毫米厚的无菌的硅橡胶垫片，形成一个小的好。
2. 移液器〜300μL的55 °彗星CTTYE媒体/琼脂糖到以及创建幻灯片上的垫圈和包含的营养磁盘。 CTTYE媒体/琼脂糖应土堆。
3. 将火焰消毒CTTYE媒体/琼脂糖上的幻灯片（无垫片）。
   
   重要说明：这张幻灯片必须设置的角度，以防止形成气泡。
4. 一旦幻灯片到位，钳复杂连同小长尾夹 - 每边一个。
5. 裁剪复杂放置在4 ° C和允许CTTYE媒体/琼脂糖设置。这通常需要大约5分钟。

第4部分：跟踪检测的准备 - 设置板配合物

装配组件，准备幻灯片的复合物，放置营养磁盘，倒入TPM的媒体/琼脂糖，单独和干板复合物，板细胞，并组装跟踪检测板复合物。

复杂的部件组装板

1. 对于每一个复杂的，火焰灭菌玻璃显微镜幻灯片
2. 将幻灯片上的蒸压垫片和预留（消毒端升级）。这将形成检测的底部。
3. 火焰消毒的玻璃盖滑，并将其放置在顶部用标签胶带（或封口膜）包裹的第二个玻璃显微镜幻灯片，并预留（消毒端升级）。这是作为一个支持幻灯片，以防止开裂盖玻片。这将形成检测的顶部。
4. 火焰消毒第三玻璃显微镜玻片上，并预留（消毒端升级）。这将用于扁平化琼脂糖。
   
   重要信息：确保垫片形式按用镊子与玻璃密封，否则媒体/琼脂糖干出来的。

P花边营养磁盘

重要事项：步骤5至10必须做一个幻灯片复杂一次;否则，媒体/琼脂糖开始凝固造成影片质量差。

5. 删除营养磁盘复杂的形式4℃（第5步，从第3部分）和撬除了揭露现在凝固CTTYE /琼脂糖幻灯片。
6. 删除CTTYE媒体/琼脂糖从1毫米直径的“营养磁盘”远高于使用100μL玻璃一次性尖端的微型采样吸管放置在垫片上创建的盖玻片（上述第3步） 。

倒板

关键的一步

7. 移液器〜300μL的55 °彗星TPM媒体/琼脂糖到盖玻片和包含的营养磁盘上的垫片创建。 TPM媒体/琼脂糖应土堆。
   
   关键的一步
8. 将火焰消毒幻灯片没有TPM媒体/琼脂糖上的垫片（从第3步）。
   
   重要说明：这张幻灯片必须设置的角度，以防止形成气泡。
   
   
9. 幻灯片（从第5步）一旦到位，钳复杂连同小长尾夹 - 每边一个。
10. 裁剪复杂放置在4 ° C和允许媒体/琼脂糖设置。这通常需要大约5分钟。

单独和干板

重要信息：要防止干燥媒体/琼脂糖，11到20步，只应在一个幻灯片复杂执行一次。

重要提示：为了获得最佳结果，11到13步，应在4 ° C。

11. 一旦媒体/琼脂糖设置，删除长尾夹，挤压复杂松开胶带包裹的幻灯片。
12. 取下胶带包裹的幻灯片，并进一步使用的长凳上。
    
    关键的一步
13. 使用镊子作为一个楔子，单独从支持幻灯片（无垫片）盖玻片/垫片/媒体/琼脂糖复杂和丢弃的支持幻灯片。
    
    重要事项：不要使用撬议案，独立的盖玻片/垫片复杂。这可能导致在盖玻片打破和/或媒体/琼脂糖坚持支持幻灯片。
14. 放置盖玻片上的胶带包裹的幻灯片/垫片/媒体/琼脂糖复杂（垫圈朝上），删除4 ° C。将这个复杂的刻录机，让所有可见的新暴露的媒体/琼脂糖表面水分蒸发 - 不超过1分钟。
    
    要点：不要让媒体/琼脂糖干太长，因为这可能会影响M。 xanthus群的行为。

板细胞

关键的一步

1. 一旦多余的水分蒸发，吸管集中细胞上的媒体/琼脂糖约1毫米，从营养上（第1部分中的步骤8）0.5μL。
   
   重要提示：这是极为重要，以确保细胞存入移动吸管，直降，然后是直线上升。这将确保群将是圆形的。
   
   重要事项：不要触摸枪头向媒体/琼脂糖这是极为重要的。这将使得表面上的抑郁症和改变行为的 M. xanthus群。
   
   提示：压低在接近媒体/琼脂糖的枪头。这将使细胞下降，出现在吸头的底部，并使其更易于存款细胞。
2. 一旦细胞的沉积，将复杂的燃烧器，让干细胞现场 - 不超过20秒。

组装检测

1. 一旦干细胞当场封面上的防滑垫片/垫圈/媒体/琼脂糖/细胞复合物（从第13步），配合幻灯片/垫片复杂（从第1步），并轻轻按压在一起，形成一个密封。
   
   关键的一步
2. 清洁表面的幻灯片和盖滑与Kimwipe删除左边的封口膜的残留。完成检测应该类似于图1。
3. （滑下放在保持在32℃的加热阶段完成的幻灯片复杂，盖玻片）后立即擦拭（15步），以避免水汽凝结形成形成。如果形成结露，让几秒钟之前开始的图像采集软件幻灯片上加热阶段的复杂坐。
4. 选择适当的目标（2X，4X，或10X）。

第5部分：电影的制备

T“的关键一步

1. 打开相机和显微镜，并检查灯光亮度（确保光线不是太激烈）。启动电脑，然后打开图像采集程序。
2. 点击实时图像窗口和聚焦显微镜。图像应该出现类似如图3所示的。请注意，琼脂表面均匀。
3. 开始获取图像。
   
   关键的一步
4. 定期检查的重点，在第一个小时，媒体/琼脂往往解决造成焦点漂移。
5. 干净的工作区域。
6. 一旦完成图像采集，传输收购存储图像，并打破90％的乙醇浸泡过夜幻灯片复杂。
7. 高压灭菌器垫片重用。

图1。TM板复杂的卡通插图。 （A）给出了在爆炸视图和断面的基本TM板复杂。 （b）显示了较大的垫圈使用。

图2。显微镜集群。每个显微镜节点（插图）由尼康E400显微镜，目标，激烈的阶段，透视相机，笔记本电脑。每个节点通过网络连接在一起，并链接到主控制器的计算机。两个节点的设立与EXFO光源和两个Uniblitz百叶窗组成的的荧光功能。

图3。20X的跟踪检测仪器的图像在时间= 0 。比例尺，1毫米。

图4。TM板复杂的适应性。 （一）M. 100X形象xanthus滑翔运动的CTTYE在1.0％的琼脂。 （二）P. 20X形象假单胞菌抽搐蠕动。 （三）20倍影像S.沙雷氏菌蜂拥蠕动。 （二）及（C）测定在1.0％琼脂的LB。 （四）M. 40X形象耻垢的LB滑动在0.5％的琼脂蠕动。使用替代实验配置图1B看到此图片被抓获。

视频1。一个时间推移视频跟踪检测群。

视频2。一个M.时间推移视频xanthus群，其中1％的细胞荧光标记。被抓获的交替阶段，对比和荧光图像和覆盖澄清荧光细胞群内的位置。 CTTYE在1.0％的琼脂，该视频被抓获。

视频3。M 的时间推移视频xanthus滑翔运动的。 CTTYE在1.0％的琼脂，该视频被抓获。

一个P 的时间推移视频视频4。 假单胞菌抽搐蠕动。该视频被抓获就在1.0％琼脂LB。

S 的 ​​时间推移视频视频5。 沙雷氏菌蜂拥蠕动。该视频被抓获就在1.0％琼脂LB。

M 的时间推移视频录象6。 耻垢滑动蠕动。该视频被抓获使用替代实验配置图1B看到LB在0.5％的琼脂。

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讨论

定时microcinematography（TM）已经成为一个标准的方法来研究原核蠕动^2-7。传统上，商标是由基板^8-11使用滤纸芯，薄琼脂垫，或琼脂砖。这些方法是适当和符合成本效益的，使用时为一般细菌运动插图产生的图像序列。但是，如果图像序列的结果必须产生重复性好，定量严谨的数据，这些方法都是费时又有点不可靠。例如，人为错误造成的这些技术的变化可能导致各种各样的不准确?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0% Casitone	Difco Laboratories
0.5% yeast extract	Difco Laboratories
Micro-sampling pipette	Fisher Scientific
100 μl glass disposable tip	Fisher Scientific
2 x 2 cm, 0.5-mm-thick silicone rubber gasket	Grace Bio-Lab Inc.