纯净小鼠的B细胞的诱导和评估类开关重组

摘要

抗原暴露后，激活的B细胞亚群接受类开关重组（CSR）的一个过程，产生不同的效应功能的抗体亚型。在本报告所述的协议解释CSR如何可诱发和分析在体外为研究B细胞功能的目的。

摘要

体液免疫是维持B细胞通过分泌的抗体介导的免疫系统的分支。 B细胞活化后，免疫球蛋白轨迹经历了一系列基因修饰，改变的结合能力和分泌的抗体效应功能。这个过程是由一个基因重组事件被称为类开关重组（CSR），其中默认IgM抗体亚型的IgG，IgA或IgE的替代突出。每个亚型具有不同的效应功能，从而使企业社会责任的关键，以维护免疫力的。

酶的活化诱导胞苷脱氨酶（AID）是介导的免疫球蛋白基因座多样化。详细地描述这个过程，是一个原理的视频可在网上（http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html）。援助活动和企业社会责任的途径通常在B细胞功能和小鼠的体液免疫的评估研究。在本报告所述的协议提出了一种从小鼠脾脏和随后的刺激与细菌脂多糖（LPS）诱导级交换IgG3（其他抗体亚型见表1）的B细胞的分离方法。此外，荧光细胞染色染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）是用来监视刺激的细胞，细胞分裂的过程中的关键同型^开关1，2 。

监管援助和企业社会责任的发生机制，目前仍不清楚， 从而在体外类开关检测提供了一种可靠的方法，测试在不同的小鼠模型，这些进程。这些检测先前已在基因缺乏使用基因敲除小鼠³的情况下使用。此外，B细胞在体外开关之前，病毒转导来调节基因表达的RNA敲除或转基因表达的^4-6。这些类型的实验数据，影响我们理解的援助活动，分辨率CSR的反应，并在小鼠的抗体介导的免疫力。

研究方案

第一步：通过磁富集脾B细胞分离

1. 实验小鼠须年满8-12周，以确保充分成熟的免疫系统。
2. 颈椎脱位安乐死鼠标和70％的乙醇浸泡。通过左季肋部，腹部皮肤和肌肉的切口手术去除脾切成磷酸三大块缓冲液（PBS）。确保所有的工具和试剂是无菌的。
3. 使用1 mL注射器柱塞橡胶年底，轻轻捣烂脾细胞过滤器通过70微米到PBS。请务必使用一个推的议案，而不是磨议案的研磨可能会导致较大的（即增殖）细胞破裂。
4. 离心5分钟不超过350克的细胞，并在PBS悬浮颗粒。使用血球计数悬浮细胞。
5. 准备用5％的5毫升无菌聚苯乙烯管的正常大鼠血清与第（2毫升每管最大音量）暂停1 × ^{10 8个}细胞/毫升的PBS 。
6. 加入50μLEasySep负鼠标选择B细胞每毫升细胞富集的鸡尾酒。移液器的混合物，帽管，并在15分钟的冰箱。
7. 每毫升细胞，加入100μLEasySep生物素选择鸡尾酒。移液器的混合物，帽管，并在15分钟的冰箱。
8. 每毫升细胞，加入100μLEasySep磁性纳米粒子（确保纳米粒子充分混合的解决方案是同质）。移液器的混合物，帽管，并在5分钟的冰箱。
9. 顶部的解决方案，并在5分钟EasySep磁铁用PBS地方，以2.5毫升。反转的磁铁和管，并迅速倒入一个新的聚苯乙烯管。不要动摇管负选定的单元格将磁约束管壁。
10. 为了进一步提高纯度的细胞悬液，管重新插入到一个额外的5分钟的磁铁，并灌入新管。这可能会降低整体细胞恢复。
11. 流动的B细胞表面标志的流式细胞仪分析，B细胞纯度可评估。浓缩之后，我们不断地看到纯度> 95％B220阳性细胞。

第二步：CFSE细胞染色

1. 在温暖的PBS重悬的分离出的细胞，在终浓度为1 × ¹⁰ 6细胞每毫升0.1％牛血清白蛋白补充。
2. 准备一个5mm的原液CFSE（稀释后在无菌二甲基亚砜），并为每毫升细胞在试管中添加2μL。 10μm的最终浓度是初级B细胞染色的最佳选择。
3. 在黑暗中10分钟在37 ° C（注：CFSE对光敏感，应保持在黑暗中的可能时）。
4. 淬火牛小牛血清等体积加入你的细胞，并在冰上孵育5分钟的污点。
5. 洗细胞培养基补足管（见配方步骤三）在350离心G.请注意，至少5倍的量相当于媒体必须加入抵制牛小牛血清的粘度和细胞产生沉淀。
6. 清洗细胞两次培养基。现正准备为刺激细胞。

第三步：LPS刺激细胞

1. 准备在体外 B细胞培养液中，通过补充10％胎牛血清和50μMβ-巯基乙醇/的RPMI 1640 。
2. 准备加入LPS的终浓度为50μg/mL刺激中等。分装125μL刺激介质以及每一个平底96孔组织培养板。
3. 准备您的CFSE染色的B细胞培养液中无LPS终浓度在3.2 × ¹⁰ 6细胞/ mL 。加入125μL的细胞悬液含有刺激培养基轻轻吹打混合井。
4. 现在每口井包含在最后的LPS的浓度为25微克/毫升的4 ^× 10 5细胞。这提供了细胞增殖和类别转换的最佳水平，虽然根据需要更改这些值可能。
5. 细胞在37℃，5％CO ₂ 72至96小时。 48小时后，大量增殖的B细胞群将在显微镜下清晰可见。

第四步：流量级交换的流式细胞仪分析

1. 当您准备好来看待级交换，删除你的细胞，从他​​们的文化条件和1毫​​升染色缓冲液（2％牛小牛血清的PBS）洗两次。
2. 为了防止你的细胞，颗粒细胞的非特异性抗体染色，纺纱350克和incuba特在5％的正常小鼠血清和FcBlock per106细胞在冰上15分钟1μg染色缓冲100μL。细胞阻塞，应在冰上进行。
3. 不洗你的细胞，每一个荧光标记的抗小鼠IgG3抗体¹⁰ 6细胞添加1μg，使细胞染色30分钟，在冰上。
4. 200-300染色缓冲液中的悬浮离心洗涤细胞两次。这些细胞是目前评估流式细胞仪准备就绪。
5. CFSE是最佳的兴奋在492 nm处（氩离子激光器），并在517 nm处发出。 IgG3抗体激发和发射光谱是取决于它的共轭荧光染料。

代表性的成果

磁性富集，细胞悬液应该看起来像一个同质人口难以区别小圆形细胞（图1A）。刺激后48-72小时，扩大增殖细胞的隔离集群将清晰可见（图1B）。会出现一个大比例的非增殖细胞和颗粒，因为它们发生凋亡。

CSR通常可检测刺激后，在72和96小时之间的最高水平之前，大部分细胞开始死亡^7。在这一阶段，细胞发生了细胞分裂交换出现在后来的女儿细胞群的细胞数量。图2可以看出，在代表流动CFSE稀释和表面的LPS刺激后96小时IgG3表达的流式细胞仪积。

表1。抗体同种型开关鸡尾酒。注：兴奋剂浓度值是唯一的建议。滴定法可能是必要的的。

期望中的同型	刺激鸡尾酒
IgG1and的IgE	LPS（25μg/mL）和IL - 4（10毫微克/毫升）
IgG1and的IgE	抗CD40（10μg/mL）和IL - 4（10毫微克/毫升）
IgG2a	LPS（25μg/mL）和干扰素-γ（10毫微克/毫升）
IgG2b和IgG3	LPS（25μg/mL）
IGA	LPS（25μg/mL），转化生长因子-β（2毫微克/毫升）和IL - 5（1.5毫微克/毫升）

图1。脾B细胞的分离和LPS刺激。 （一）前防磁丰富LPS刺激脾B细胞。 （二）与25微克/毫升的LPS刺激后48小时。增殖细胞被视为爆破和细胞凋亡的背景集群。

图2。扩散和类开关重组后96小时。 （一）CFSE稀释对LPS刺激细胞后96小时在文化。每个独立的峰代表稀释CFSE荧光对应一个独立的细胞分裂。 （二）IgG3表达一个IgG3阳性人群中，细胞分裂的几个回合后，出现。

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讨论

上文所述的协议提供了一个标准的检测，以分析在初级小鼠的B细胞级交换援助的表达和功能。该协议使用细菌脂多糖诱导从IgM的切换到IgG3，虽然刺激媒体的修改，可以切换到其他的亚型（总结^在表1 8，9 ）诱导。

我们注意到，对于未知的原因，小牛血清能影响类切换在体外观察到的水平。至关重要的是，同一批号的所有CSR实验，以确保实验的一致性。屏幕面板的胎?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate Buffered Saline	GIBCO, by Life Technologies	14190
EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit	Stem Cell Technologies	19754
Polystyrene tubes	BD Biosciences	352058
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit	Invitrogen	C34554
Bovine Calf Serum	Hyclone	SH30072.03
RPMI 1640 Culture Medium	GIBCO, by Life Technologies	11875
Lipopolysaccharides from Escherichia coli	Sigma-Aldrich	L6529
β-mercapt–thanol	GIBCO, by Life Technologies	21985
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30396.03
Normal Mouse Serum	Jackson ImmunoResearch	011-000
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141
Rat Anti-Mouse IgG3	BD Biosciences	553401