体内近红外荧光（NIRF）血管内分子成像炎性斑块，多式联运方针成像动脉粥样硬化

摘要

我们详细介绍了一个新的近红外荧光（NIRF）导管二维血管内斑块的生物学分子成像在体内。 NIRF导管可以想像报告斑块狂热的激活和有针对性的近红外荧光存在的关键生物过程，如炎症。导管采用临床工程和电力的需求和目标是应用在人体冠状动脉。以下的研究描述了一个利用了一种新型的多模态成像战略在体内血管NIRF导管的形象和量化水解积极发炎兔atheromata炎性斑块。

摘要

血管损伤反应是一个精心策划的炎症反应的巨噬细胞内的血管壁，导致积累，管腔内充满脂质斑块，平滑肌细胞增殖和血管腔逐渐缩小的积累引发。这种易损斑块容易破裂，多数情况下急性心肌梗死的基础的形成。在复杂的分子和细胞炎症级联反应是精心策划的招聘T淋巴细胞和巨噬细胞和内皮细胞和平滑肌细胞的旁分泌的影响。

在动脉粥样硬化的分子成像已经演变成一个重要的临床和研究的工具，允许在体内炎症和其他生物过程的可视化。最近的几个例子证明能够及时发现高风险患者的斑块，并评估在动脉粥样硬化pharmacotherapeutics的影响。虽然数量（特别是MRI和PET）的分子成像方法可以形象大血管，如颈生物方面动脉，冠状动脉成像中存在缺乏选项^。2高分辨率光学成像战略的问世，尤其是近红外荧光（NIRF），再加上与激活的荧光探针，提高灵敏度，并导致新的血管的战略发展以改善人类冠状动​​脉粥样硬化的生物成像。

分子成像利用近红外荧光（NIRF）定义的频带宽度的光子源（650-900纳米），的光造影剂或荧光探针交付时，发出近红外窗口，可以检测到的荧光激发光使用适当的排放过滤器和一个高灵敏度的电荷耦合相机。相对于可见光，近红外光深深地渗透到组织，如血红蛋白，血脂和水的内源性光子吸收剂明显减弱，并允许由于在近红外窗口，以减少自体荧光的高目标背景比率。成像在近红外“窗口”可以大幅度提高体内成像的潜力^。 2,5

已经很好的研究炎症半胱氨酸蛋白酶激活NIRF探头^10，在动脉粥样硬化形成中发挥重要作用。通过降解细胞外基质，半胱氨酸蛋白酶作出重要贡献⁸动脉粥样硬化的进展和并发症。在斑块组织蛋白酶B活性，特别是半胱氨酸蛋白酶，组织蛋白酶B，高表达和colocalizes与巨噬细胞，在实验小鼠，兔，和^人类 atheromata此外3,6,7，可以利用先前描述1体内检测- ð血管内的近红外荧光技术^6，结合在一个多聚赖氨酸的聚合物骨架多个近红外荧光（VM110/Prosense750，EX / EM 750/780nm，VisEn医疗，沃，MA）的衍生物组成的纳米传感器与注射剂在基线强分子内淬火，结果¹⁰以下有针对性的组织蛋白酶B（已知colocalize斑块巨噬细胞），单独的荧光，如半胱氨酸蛋白酶的酶裂解，导致大幅扩增NIRF信号。利用新颖的二维血管NIRF导管血管内的近红外荧光信号检测，使高清晰度，几何体内发炎斑块组织蛋白酶B活性检测的准确。

在体内分子成像使用导管为基础的2D NIRF成像，而不是以前的1 - D光谱方法的动脉粥样硬化，是一种新型的和有前途的工具，利用增强巨噬细胞丰富的斑块蛋白酶活性检测血管^炎症 。11,12以下的研究协议介绍，血管内的2维NIRF导管的使用形象和斑块结构特征，利用斑块生物学的关键环节。这是一个翻译的平台，整合现有的临床成像技术，包括血管造影和血管内超声（IVUS），提供了一个独特新颖的综合多式联运分子成像技术，区分炎症atheromata，并允许在人类大小的冠状动脉血管NIRF信号检测。

研究方案

在体内动物模型实验AortoIliac动脉粥样硬化的代

1）基线血管造影和球囊剥脱

1. 获得基线血管造影和球囊剥脱之前，新西兰白兔喂食高胆固醇（1％）1周的饮食。这种动物是利用平移的相关性为1）在家兔的主动脉iliacs血管是人类冠状动​​脉（2.5 - 3.5毫米）和2）相同口径的高脂血症，球囊损伤模型，生成类似的炎性细胞（巨噬细胞发炎的动脉粥样硬化的轴承）和分子（蛋白酶）在人类动脉粥样硬化。
2. 胆固醇喂养，动物与异丙酚和氯胺酮麻醉。一英寸的腹侧中线颈部切口是使用一个大小为15 -手术刀刀片。使用钝性分离技术，筋膜气管右侧下方的肌肉暴露。沿结缔组织交界处，左边的sternocephalicus肌肉分离暴露右侧颈总动脉。动脉是从迷走神经分离。被放置在动脉的近端和远端缝合循环允许回缩和闭塞。一个1到2mm斜面动脉切开术是通过5法语（外径1.67毫米）血管鞘的插入和肝素（1000μ/mL〜150units/kg）管理通过内动脉鞘。
3. 然后注入造影剂（优维显）（1至2ml）超过2秒内获得控制远端的主动脉血管造影和两个髂动脉。
4. 髂股动脉和主动脉内皮剥脱，然后受伤。使用标准的透视方法，一个3FR福格蒂取栓导管是放置在远端髂动脉，并用0.3〜0.5毫升的对比（50％contrast/50％生理盐水）或空气膨胀。导管，然后撤回其膨胀的状态近端的最大距离沿右髂及远端主动脉左肾动脉起飞。气球剥蚀之后，血管造影是重复文件血管通畅。造影之后，所有的导管鞘被删除和近端右侧颈总动脉结扎，肌肉和筋膜，用4 / 0可吸收缝合线缝合，并用4 / 0非吸收性缝合皮肤切口封闭。
5. 动物然后让其恢复的一剂抗生素（头孢唑啉，0.5克的IM）管理。止痛药物，其中包括0.01毫克/公斤丁丙诺啡IM（两次需要一天）。动物，然后继续1％，为4周后，气球剥蚀胆固醇。在第5周，动物过渡到0.3％胆固醇饮食。

集成的多模态成像兔Atheromata

2）标签的蛋白质积极发炎斑块使用注射用纳米传感器;血管造影术，血管内超声（IVUS）， 并在体内血管NIRF成像兔动脉粥样硬化

1. 8周球囊损伤和成像前24小时后，兔子是通过耳缘静脉注射静脉注射500 nmol / kg的Prosense/VM110（珀金埃尔默）。
2. 二十四小时注射后，动物麻醉和动脉访问是通过左颈总动脉（见步骤1.2）获得。管理动脉内肝素（150单位/公斤）。基线血管造影获得以上。
3. 装上一个血管内超声导管的临床冠状动脉能力0.014英寸线，插入鞘中。使用透视引导，导线的不透X线提示定位到右髂动脉远端。血管内超声导管，然后到近端髂动脉，用一个标准的临床单轨技术先进。
4. 发起一个100毫米的回调和图像记录。获得纵向重建的船只和管腔牌匾标识。
5. NIRF导管^11,12加载到0.014英寸线（单轨系统），并小心地将导管插入鞘和成像头，右髂内动脉远端定位。
6. 多个自动化回调（1毫米/秒纵向回调，每分钟30发），动脉粥样硬化的区域内的荧光信号指出。录制的影像，并取得进一步的处理是适当的缩放和窗口基于信号范围。

3）安乐死和离体主动脉-髂组织隔离

1. 完成安乐死，安乐死代理与1CC（戊巴比妥钠390mg和50mg苯妥英钠溶液），静脉注射，单次注射。
2. 动脉树是0.9％生理盐水灌注，直到下腔静脉血液明确。确定动脉粥样硬化的主动脉和髂动脉及周围组织解剖。此外，小的2 × 2李厘米件版，肾，脾，心脏也获得。
3. 在这个阶段可以做体外 NIRF成像与血管NIRF成像导管。船只被拉长，NIRF导管重新插入到近端主动脉，直到成像头定位在右髂动脉或分叉。执行上述多个自动回调（见2.6）。

4） 体外荧光反射成像（FRI）主动脉和髂动脉的解剖

1. 解剖组织是摆在10-20毫升生理盐水和运输周五分析（柯达影像站4000MM临，Carestream Health公司）。
2. 主动脉，髂血管被拉长，以近似实时的长度和图像在多个波长[白光，绿色荧光通道（前495纳米，EM 515纳米），Cy5的（前565纳米，EM 670纳米）和Cy7（前获得波长650 nm，EM 760纳米）的渠道。一系列的曝光时间，利用每个波长（0.1 - 30秒），获得的图像导出为DICOM或16位的非标度的TIFF进一步分析文件。作为阳性和阴性对照，器官（肝，脾，肾和心脏）成像类似的渠道和曝光时间。
3. 增加的近红外通道（780nm的）信号的地方都注意到在动脉粥样硬化的动脉。

5）组织包埋切片和免疫组织化学分析

1. 地区的正常（非受伤的组织，即左髂内动脉）和斑块地区确定并组织5-10毫米的小环嵌入在华侨城（最佳切削温度）媒体。直到切片块保存在-80彗星。
2. 切片及免疫组织化学分析的标准技术进行。苏木精和曙红染色，RAM - 11和组织蛋白酶B染色的执行。

多模态图像的分析和集成（血管造影，血管内超声，NIRF和五）

6）NIRF和周五图像处理

1. （近红外780纳米通道）回调DICOM文件包含NIRF和周五成像数据处理使用MATLAB和Osirix软件，分别为。适当的窗口来显示信号强度的全方位的实现。最后将图像导出为TIFF文件。
2. 文件导入成标准的图像处理软件（可用于主旨）。图片是一致的参考点（即椎体血管造影，髂分叉，肾动脉）的基础上。正常血管和斑块的领域确定。
3. 利息率（ROI）的地区手动追踪（正常组织和地区的斑块）和平均信号强度，使用Osirix和MATLAB获得，分别为周五，NIRF图像。为了引导适当的跟踪，船只的纵向血管内超声图像的使用和正常血管和斑块的识别很容易识别。
4. 目标的背景（TBR）的比率计算斑块区。

代表性的成果：

上述协议完成后，我们可以识别和特征增强蛋白酶蛋白酶活性的领域内主动脉和髂血管炎性斑块。注射可激活纳米传感器（Prosense/VM110），使我们能够确定水解积极斑块。这些显示为亮点或信号成像时使用的近红外通道（750纳米）星期五激烈的区域。 NIRF回调关联周五增加信号强度和路线与血管内超声允许NIRF信号解剖登记。计算斑块TBR的星期五和NIRF获得相似（见图3：平均NIRF载重4.2，平均星期五载重2.9）。明亮的斑块的免疫组织化学分析证实存在激烈的RAM - 11和组织蛋白酶B在活动领域的斑块（数据未显示）。

图1。 2D NIRF导管的原理图 ，延长一维NIRF传感^方法 6的临床潜力，我们构造了一种新的2 - D导管血管成像^NIRF。11,12定制的导管组成的光纤（直径为125微米的安置聚乙烯管材：2.9F）照亮使用750 nm激光激发源。激光灯发出的纤维轴成90度角。该系统采用两个马达（旋转和平移）自动启用伴随360度成像和纵向回调，以获得真正的二维成像。参考11的许可使用的图片。

图2。示意图展示介导的蛋白酶激活的纳米传感器，Prosense/VM110。参考10的许可使用的图像。

图3。 在体内和体外斑块TBRs（目标背景比率）

讨论

发炎的高风险或易损斑块可能大多数心肌梗死的负责。如斑块识别到出现症状之前预测的结果和指导药物治疗的重要的临床意义。如X线血管造影常规冠脉动脉成像方式通常侧重于管腔狭窄的表征，而不是启发性的高风险，通常非狭窄病变的潜在的生物学概况。血管NIRF分子成像提供了一个心脏导管插入术实验室的翻译方法，包括利用纳米传感器，识别活跃的巨噬细胞内斑块斑块炎症的生物学，细?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Prosense 750	Visen Medical	VM110	500 nmol/kg IV injection
Heparin Sodium	APP Pharmaceuticals	401586D
Cephazolin	NovaPlus	46015683
Lidocaine HCL 2%	Hospira Inc.	NDC 0409-4277-01
Buprenorphine	Bedford Laboratories	NDC 55390-100-10
Ketamine	Hospira Inc.	NDC 0409-2051-05
High Cholesterol Diet 1%	Research Diets	C30293
HIgh Cholesterol Diet 0.3%	Research Diets	C30255