幼虫和成人测绘和增强子陷阱Flippase表达中的应用果蝇中枢神经系统

摘要

我们描述一个Flippase引起的交互联系Gal80/Gal4镇压（FINGR）方法，允许组织特异性FLP确定Gal80表达模式。无论GAL4和FLP重叠，Gal4的表达是开启（Gal80翻转出）或关闭（Gal80翻转）。 FINGR方法是多才多艺的克隆分析和神经回路映射。

摘要

GAL4 / UAS二进制方法是强大的基因和果蝇的神经回路操纵。然而，对于大多数的神经生物学研究，Gal4的表达是很少的组织特异性，足以让行为读数电路精确相关。为了克服这一主要障碍，我们最近开发的FINGR方法，以达到更严格的Gal4的利益的组织中的表达。 FINGR方法有三个组成部分：1）传统Gal4/UAS系统; 2）FLP / FRT -介导Gal80转换工具; 3）增强子陷阱FLP（ET - FLP）。 GAL4是用来定义主利益的神经电路。果与Gal4的一个UAS的效应，如无人机MJD78Q或UAS石^TS，调节神经元的活动，又表现在飞行行为的改变。 UAS - GFP，涉及具体行为的神经回路，如额外的无人机，记者可以同时映射形态分析。 Gal4的广泛表达线，Gal4的表达，可以限制使用两个互补Gal80转换工具： ^浴缸P> Gal80>（“翻转”）和^浴缸P <停止> Gal80（“翻转”） 。最后，调查人员可以把Gal80上或关闭，分别与具体组织ET - FLP的帮助。在翻盖模式，Gal80压制Gal4的表达无论GAL4和ET - FLP相交。在翻转式的模式，Gal80将缓解Gal4的镇压GAL4和FLP重叠细胞。这两种方法都使GAL4定义电路中的细胞数量的限制，但在一个反模式。 FINGR方法，是与广大Gal4的线在飞社区和高度传统的克隆分析和神经回路映射多功能集合兼容。在这个协议中，我们展示了FLP表达模式的选择，ET - FLPx2线中的感光细胞FINGR方法的有效性的映射。 FINGR方法的原则也应该适用于其他遗传模型Gal4/UAS，Gal80，FLP /首次登记税是用来生物。

研究方案

1。 果蝇株

1. Gal4的驱动程序：
   GMR - GAL4，这表示在Gal4的感光细胞。
2. 无人机线
   无人机MJD78Q（或UAS - polyQ），从而导致神经变性Gal4的表达细胞。
   UAS - GFP，它表达GFP Gal4的表达细胞。
3. FLP线
   EY - FLP，这表示在光感受器和FLP的大脑区域的子集。
   ET - FLPx2线，其中包含两个副本的FLP（FLP - IRES - FLP）的增强子陷阱线。我们已经生成〜1000，ET - FLP线（波姆等，2010），其表达模式有待特点。在这里，我们描述的幼虫和成人飞的中枢神经系统（CNS）的表达模式的选择，ET - FLPx2的表征。
4. FLP记者
   YW，肌动蛋白^P> CD2> Gal4的; UAS - GFP（Pignoni Zipursky，1997年），该报告ET - FLPx2的表达模式，通过肌^动蛋白 P> Gal4的FLP -> CD2介导的recombinational切除后的UAS - GFP。
5. 两个互补Gal80转换工具
   浴缸^P> Gal80>（Gordon与斯科特，2009），倒装的结构，组成表示在一个强大的微管蛋白启动子驱动的所有组织Gal80。 FLP -介导的重组后，> Gal80翻转和Gal80表达被终止，只有在ET - FLPx2表达组织。
   浴缸^{P <}停止> Gal80（波姆等，2010），构造，不正常条件下表达Gal80翻转。 Gal80表达是由微管蛋白启动子仅在打开ET - FLPx2表达组织在FLP翻转“>”停止“和在Gal80翻转。
6. 为测试中的复眼FLP活动的苍蝇
   GMR - GAL4，UAS - polyQ;浴缸^{P <}停止> Gal80（波姆等，2010），其中已变质和depigmented眼睛。在FLP表达的感光细胞，polyQ表达关闭以下Gal80倒装。
   GMR - GAL4，UAS - polyQ;（波姆等，2010）浴缸^P> Gal80>，其中有正常的眼睛。在FLP表达的感光细胞，polyQ表达打开以下Gal80倒装。

2。试剂

磷酸盐缓冲液（PBS，1X），pH值7.4。
4％多聚甲醛（PFA），在PBS稀释16％的煤灰，EM级（猫＃15710，电子显微镜学，哈特菲尔德，PA）
PBT，1XPBS含0.1％TRITON - X 100（Sigma公司）
反Elav（单克隆抗体，9F8A9;发育研究杂交瘤细胞银行，美国爱荷华大学），污渍在果蝇中所有的神经元。
反回购（单克隆抗体8D12;发育研究杂交瘤细胞银行，美国爱荷华大学）的污渍，在果蝇的神经胶质细胞。
Alexa的594鸡和鼠二抗（Invitrogen公司）

3。测绘表达的增强子陷阱FLPx2线模式（*关键步骤）

1. 从YW收集处女女性，肌动蛋白^P> CD2> Gal4的UAS - GFP的线和跨男性个人ET - FLPx2线。前者作为一个组织，ET - FLP表达GFP报告。
2. *徘徊3 _路龄F1幼虫解剖，保留的中枢神经系统（即脑和腹神经索，VNC）和体壁，固定在4％的煤灰为1小时，冰，用冰冷的PBS 3X其次与PBT的3倍洗涤。
   解剖
   1. 删除徘徊3 ^路龄F1幼虫，它们放入一个干净的Sylgard菜（35毫米× 10毫米培养皿中充满了Sylgard 2克-混合根据生产指令） 。
      1. 取出食物残渣与画笔
   2. 填写冰冷1XPBS置于冰上菜麻醉幼虫
   3. 幼虫口钩握住一双镊子和抢附近的延伸与另一钳对前气门和角质层剥离角质层对后部。中枢神经系统会附着到口，沿挂钩唾液腺，肠道，和成虫光盘。
   4. 删除多余的组织和周围的中枢神经系统的成虫光盘。
   5. 一个PBS填充以及耐热盘转移到中枢神经系统。
      1. 可以用一个硅的P200的枪头，以避免干燥的组织。
   6. 200微升4％的煤灰冰1小时修复。
      1. 确保完全淹没在煤灰中的中枢神经系统。
         1. 如果中枢神经系统的花车，这通常表明，中枢神经系统不正确地从周围组织清理。
   7. 与冰冷的PBS洗3X 3X清洗与PBT。
3. *解剖成人F1果蝇中枢神经系统。
   1. 麻醉与CO ₂的苍蝇或放置在冰上10分钟的空药瓶内所载的苍蝇。
   2. 放置成蝇到95％的乙醇填补冰玻璃盘30秒。
   3. 转移到一个1XPBS填补玻璃盘上的冰成蝇。
      1. 3X用冰冷的1X PBS清洗，以去除残留的乙醇
   4. 放置到一个35mm Sylga飞路菜充满了冰冷的1X PBS
   5. 将腹面朝上，插入一个小虫子笔（minutiens引脚0.1毫米），通过腹部中途。
      1. 使用一双镊子保持基地的腿和另一双钳取出腿。
   6. 删除头角质层
      1. 虽然抓住一双镊子的长鼻，放在眼睛下方和剥离角质层对飞头背中线另一回事。
      2. 抓住另一只眼睛，消除对方的其余角质层。
      3. 使用锋利的钳和/或削尖的钨针，取出气管周围组织的脑
         1. 气管清洗不当，会导致自体荧光强，阻碍GFP的表达，并能使大脑浮在固定
   7. VNC的夹层
      1. 取出胸角质层
         1. 胸部后开始，每方3 ^路 preepisternum钳（即抓基地的后腿）。
         2. 轻轻分开的角质层远离腹侧中线线，重复，直到你到达基地的脖子。
         3. 轻轻地传播胸角质层的两半，露出了VNC
      2. 接下来，从胸部取出腹部。虽然使用一双镊子举行第二回合基地的胸部，用另一双钳抢到了第一腹sternite附近的腹部，并拉出腹部。
      3. 若要从周围的胸组织的VNC。握住一双镊子，另一双钳轻柔撕离大多数胸胴体肱骨面积。
      4. 在这一点上应该有一个连接周边的颈椎结缔组织（颈部）组织环。使用两个镊子撕除环。
      5. 删除任何多余的胸椎周围组织的VNC
   8. 大脑和VNC转移到9以及耐热菜含有冰1X PBS
      1. 一个硅的P200的吸头可以用来避免干燥的组织
4. *固定在4％的煤灰1小时的成人中枢神经系统在冰上，用冰冷的PBS和与PBT的3X 3X。
5. 成人中枢神经系统准备或幼虫中枢神经系统和体壁孵育4 ° C过夜无论是神经元（反Elav，1:10）或神经胶质细胞（anti-Repo. 1:10）的抗体。清洗准备与PBT 5倍。
6. 育与成人或幼虫准备与Alexa的594对鼠二抗（1:100）鸡在室温下2小时，用PBS洗的准备。
7. 山幻灯片上的幼虫或成年中枢神经系统。为了维护中枢​​神经系统的的自然形状，作为一个小型桥的幻灯片使用一个O形塑料环（加固标签清除，艾利丹尼森，办公用品，布雷亚，CA）暂停盖玻片。
8. GFP和Elav（或回购）的表达模式，荧光显微镜下检查的准备。

4。在光感受器在镇压Gal4的两个互补Gal80转换工具的应用

1. 翻转通过浴缸Gal80 ^P> Gal80>（ 图5A）。
   1. 从GMR - GAL4 UAS - polyQ收集男性;浴缸^P> Gal80>行。请注意，这些果蝇复眼的正常。
   2. EY - FLP与处女交配。
   3. 收集F1的苍蝇和检查眼表型。
2. 在通过浴缸翻转Gal80 ^{P <}停止> Gal80（ 图5B）。
   1. 收集GMR - GAL4 UAS - polyQ;浴缸^{P <}停止> Gal80雄蝇和检查眼表型。注意的退化和这些果蝇的depigmented眼睛相比，野生型菌株（广州S）
   2. EY - FLP与处女交配;
   3. 收集F1的苍蝇和检查眼表型。
3. 选择ET - FLPx2表情纹，在感光细胞

步骤4.1和4.2，可反复使用ET - FLPx2线，表达FLP在感光细胞的一个子集。另外，无论是GMR - GAL4 UAS - polyQ浴缸^P>停止> Gal80苍蝇的GMR - GAL4 UAS - polyQ;浴缸^P> Gal80>苍蝇可以越过个人ET - FLPx2线为线，以屏幕表达工党在感光细胞。有价值的，ET - FLPx2线是指那些仅表达FLP的一个子集或单一的感光细胞（ 图6） 。

5。代表性的成果

一个特定的ET - FLPx2线的表达模式，可以很容易地检查和记录在F1幼虫或成蝇从YW，肌^动蛋白P之间的交叉派生> CD2> Gal4的UAS - GFP的处女和ET - FLPx2男性（图1） 。通常情况下，三至五年重复的F1动物解剖和检查，以确定的FLP的表达模式（波姆等，2010）的可重复性。 图2显示了在ET - FLPx2幼虫和成人CNS线173A FLP表达模式。的FLP模式可以使用一个神经元或神经胶质的标记（图3＆4）进一步分析。

在图7所示的结果说明Gal80倒装的成效和翻转式系统交互联系的镇压Gal4的下列FLP -介导的重组。浴缸^{P <}停止> Gal80构造不会出现有任何Gal80漏水的表达（统一的光感受器变性及色素脱失的），但它是100％，有效地翻转Gal80 eyFLP帮助压制GMR GAL4和眼睛恢复正常露面（ 图7A）。相反，浴缸^P> Gal80>完全压制GMR - Gal4的前eyFLP引进。以下Gal80翻转，GMR - Gal4的驱动器的UAS - polyQ表达，导致变质和depigmented眼睛（图 7B） 。在这个例子中，我们用一个泛photorecetor FLP地图感光“电路”，但没有审查的行为的后果。类似的方法使用行为有关Gal4的线，我们映射CCAP - Gal4的电路的一部分调节成蝇翼扩张（波姆等，2010）。我们相信，FINGR方法将帮助我们了解行为的神经基础的宝贵。

图1。检查的FLP表达模式的ET - FLPx2线（蓝色椭圆形） 的表达模式的ET - FLPx2线可以穿过的ET - FLPx2男（左上）与肌^动蛋白 P> CD2> Gal4的决定;无人机GFP的处女（右上）。无处不在的肌动蛋白^P>女在父母的Gal4的表达受到阻碍的首次登记税（灰色三角形）两侧的CD2的序列插入。在F1代中，工党将消费CD2的序列，允许肌动^蛋白 P> Gal4的驱动UAS - GFP的表达。

图2。 ET - FLPx2线的幼虫和成人的中枢神经系统的表达模式。这些图像描绘了从交配YW，肌动^蛋白 P产生的后代解剖中枢神经系统（脑和腹神经索，VNC）> CD2> Gal4的UAS - GFP的家长ET - FLPx2 173A线。 FLP重组> CD2>卡带，激活肌动蛋白^P> GAL4表达（随之而来的UAS - GFP的表达） 。因此，GFP模式报告FLP表达细胞。 A组幼虫FLP表达模式， 而 B组线173A成人的表达模式。

图3。表征类型的细胞表达ET - FLPx2线＃688A flippase。一个，一个一个固定的F1 3 ^路龄幼虫从ET - FLPx2线＃688A和GFP Flippase报告线之间的交叉与反回购染色的复合形象。 屋宇署 ，高放大倍率（蔡司计划复消色差透镜63X石油）的观点从一个VNC后从3龄幼虫。

图4。类型的细胞内ET - FLPx2线的蘑菇体的表征＃150。交流，反回购染色固定F1 3龄幼虫的蘑菇体（63X油浸）一个高放大倍率的形象。

图5。插图Gal80翻转和翻转式的策略 。 答 ：在翻转式的策略，微管蛋白启动子驱动^Gal80（浴缸P> Gal80>）是组成性激活，从而导致在GMR - GAL4的镇压和野生型眼表型（红眼）。引进FLP（紫色），这将翻转Gal80出（中，红色），并允许GMR - Gal4的驱动器的UAS - polyQ表达这种镇压被删除。这种感光细胞变性的结果，B（眼睛中的白点所示）。在以前的战略互惠中，微管蛋白启动子驱动Gal80表达中断两侧的“一站式”密码子的首次登记税（灰色三角形）。在Gal80的情况下，GMR - GAL4 UAS - polyQ结合，导致光感受器的神经元退化（眼睛中的白点所示）。跨越的GMR - GAL4 UAS - polyQ;浴缸^P>停止> GAL80处女雌表达FLP的感光细胞，FLP（紫色）的男性，将促进在汽车首次登记税网站的重组，归纳的“停止”密码子（中，红色），从而使Gal80表达和GMR - Gal4的镇压。这个储备在感光细胞的神经退行性疾病（由缺乏的W所示海特点在眼）。

图6。在翻转出使用ET - FLPx2线＃688A Gal80 FINGR方法的应用程序从一个ET - FLPx2线之间的交叉＃688A处女GMR - GAL4 UAS - polyQ F1 子代 ;。tubP> GAL80男性。眼小眼的中间缺乏色素的代表FLP表达＃688A线。在这方面Gal80 GMR - GAL4抑制被解除，使Gal4的驱动UAS - polyQ。

图7。或向外翻转Gal80相交的光感受器Gal4的应用程序的FINGR方法。答 ： ^浴缸P <停止> Gal80翻转系统限制在FLP依赖性GAL4表达。 GMR - GAL4 UAS - polyQ;浴缸^P>停止> GAL80苍蝇，感光细胞退化和depigmented（左飞）。 Gal80 eyFLP引进，是在感光细胞表达，导致GMR - GAL4，这反过来又关闭的表达polyQ，并产生与正常眼睛的苍蝇（右飞 ） ^镇压。浴缸P> Gal80>翻转相反的方式工作的制度^浴缸P <停止> Gal80倒装系统。浴缸^P> Gal80>组成压抑GAL4和抑制polyQ表达（左飞，与正常的眼睛） 。 Gal80 eyFLP引进，是翻转，从感光细胞，减轻抑制GMR - GAL4表达polyQ转向。这导致苍蝇与变质，depigmented眼睛（右飞）。

讨论

Gal4/UAS系统已被广泛和成功地用于各种生物研究Drosophilists（Perrimon和品牌，1993年，达菲，2002年）。迄今为止，飞行社会产生了数以千计的启动子驱动和增强子陷阱Gal4的线。一个FINGR方法的主要优势在于，它是与Gal4/UAS系统兼容，从而有可能显着扩大在果蝇研究的Gal4的电源。

FINGR方法的一个重要的应用是微调，通过Gal4/Gal80交叉口的基本行为的神经回路。这些行为包括但不限于，学习和记忆，求偶，睡觉，和昼夜节律。 FINGR方法也可以用于地图，很容易在模拟人类神经退行性疾病如阿尔茨海默氏症，肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS），和帕金森氏病神经退行性疾病的关键神经元。同样，神经细胞或神经回路调解可卡因，酒精和其他药物成瘾的关键灶可能映射使用FINGR方法。应该指出，有条件的Gal4s（奥斯特瓦德等人，2001年，罗马等，2001）可能是为了争取时间控制的神经回路和行为与FINGR方法。通过使用一个温度敏感的^{Gal80（Gal80} TS，麦奎尔等，2003）修改的Gal80转换工具，可以^产生浴缸P>停止^> Gal80 TS ^或浴缸^P> Gal80 TS>，加入进一步颞电路操纵的灵活性。除了神经系统，FINGR方法同样适用于限制Gal4的细胞亚群的表达，无论是左翼或腿。

ET - FLPx2线将首次登记税/ FLP基于克隆分析（徐鲁宾，1993年），包括MARCM（李洛，1999）感兴趣的所有果蝇生物学家的一个宝贵的资源。还预计一些ET - FLPx2行可能取代heatshock - FLP，生产重现性克隆和反复的形态和行为分析。增强子陷阱Gal4的线一样，大多数的ET - FLPx2线是不可能的，特别要表达的细胞在人的利益。大多数行会表达利益以及其他细胞或组织细胞和FLP。然而，缺乏“组织特异性GAL4和ET - FLPx2不会FINGR方法的一个主要关注，只要其重叠的区域是一个特定的实验需要。 FINGR的设计变成精致的两个“广义”的系统。

在这些协议中说明的方法，而标准和应重现。要求人的注意力主要警示步骤固定液的选择和使用。其他定影液，比煤灰，应避免，因为他们将淬火GFP信号。我们也注意到，解剖盘，应该不会有PFA固定使用，以避免工党表达不可靠绿色荧光蛋白报告的可能性。