一个系统为培养虹膜色素上皮细胞，研究蝾螈镜头再生

摘要

蝾螈，镜头再生总是背虹膜虹膜​​色素上皮细胞（IPES）转分化。在这里，我们描述一个过程，文化背，腹蝾螈IPE细胞和蝾螈眼植入。植入的细胞，然后由组织切片及免疫组织化学研究。

摘要

像蝾螈和蝾蝾具备的再生能力，其失去的身体部位，如四肢，尾巴与脊髓，眼，脑，心， ^颚 1 。具体来说，蝾螈是它的镜头再生能力的唯一。镜头拆除后，背光圈IPE细胞transdifferentiate晶状体细胞，并最终形成在大约^一个月 2,3一个新的镜头。腹侧虹膜细胞的这种再生的财产是从未展出。虹膜细胞的再生潜力， 可在体外培养IPE细胞移植的研究。文化，背，腹虹膜细胞中首次 ​​分离出从眼，分别为2周（ 图1）的时间内培养。 reaggregated这些培养细胞和蝾螈眼植入。过去的研究表明，背reaggregate保持其镜头形成能力，而腹侧总量并没有形成一个镜头，扼要， 从而在体内过程（ 图^2）4,5 。这一决定的背，腹虹膜细胞的再生潜力的系统研究镜头再生的基因和蛋白质的作用是非常有用的。

研究方案

1。虹膜细胞培养

1. 从7蝾螈（麻醉乙基3 - 氨基甲烷磺酸的PBS准备酸的0.1％）和钙，镁免费汉克斯的解决方案（CMF）收集的眼球。
2. 更改手套和工作在组织培养罩。
3. 3秒Lugol's - 乙醇消毒眼球。
4. 洗净CMF的2倍。
5. 转让眼睛汉克斯开始清扫。
6. 剖析虹膜角膜复杂和消除神经视网膜。
7. 转移到了汉克斯的新菜的复合物。
8. 使用15号手术刀，独立的复合物，到背，腹两。
9. 删除一个菜含有1毫升的L - 15虹膜片段（腹侧第一）和地点。
10. 添加15％（​​150 UL）dispase量（7.5单位/ ml的浓度）。
11. 孵育27 ° 2小时（套菜用封口膜）。
12. 隔离IPE细胞从基质（胰蛋白酶溶液在27 ° C）。
13. IPE细胞收集到1.5 ml管。
14. 在1000 RPM（室温）在室温下离心2分钟，去除上清液。
15. 在1000转速为2分钟，在室温下用1 ml汉克斯和离心机洗净，去除上清液。
16. 添加1毫升的胰蛋白酶液，孵育2小时27 ° C。
17. 在1000转速为2分钟，在室温下离心，去除胰蛋白酶。
18. 加入1毫升的L - 15洗涤，离心2分钟1000转。
19. 新增800 UL的L - 15，吸管慢慢向上和向下〜10倍（超过12次降低遵守）。
20. 板24以及胶原蛋白涂层板，并在27孵育IPE细胞℃，2周（通常情况下，背，腹井4 7蝾螈获得）。
21. 在这个阶段的细胞基因转染或治疗与因素，以确定他们的作用，诱使或干扰镜头再生。

2。虹膜细胞的聚集

1. 板块包含虹膜细胞中添加400μL培养基，漩涡轻轻dispase解决方案20μL。
2. 在27℃过夜孵育板。
3. 吸取轻轻向上和向下打跑细胞
4. 到Eppendorf管中，并在1000转速在室温下2分钟旋转的位置细胞。
5. 删除介质和清洗，加入1毫升完整的L - 15旋转2分钟，在室温下在1000 RPM删除介质。
6. 使用2000-7000细胞每总。添加到每管200 UL每总的L - 15。
7. 拆分单元格（200μL）进入新的Eppendorf管中。
8. 1000在室温下2分钟的转速旋转。
9. 孵育48小时，在27 ° C。

3。 Aggregrated细胞植入

1. 缝在蝾螈眼的角膜和取下镜头。
2. 镜头拆除后，放在眼睛的腹侧IPE细胞总正下方的角膜组织。
3. 蝾螈是保持了一个月，让他们再生的镜头。

4。嵌入蝾螈眼

1. 取出植入眼蝾螈与骨料和磷酸盐缓冲液（PBS）。
2. 在4％多聚甲醛固定在4 ° C，至少4小时或隔夜。
3. PBS中，4℃洗为30分钟。
4. 治疗用0.85％生理盐水：4 ° C，30分钟。
5. 在生理盐水/乙醇（1:1）洗涤：RT为15分钟。
6. 洗净，70％乙醇：RT，15分钟。重复一次。
7. 85％的乙醇和95％的乙醇洗涤，在室温下，每次30分钟
8. 清洗，100％乙醇：RT，30分钟。重复一次。
9. 储存于4 ° C或继续。
10. 100％二甲苯：RT，30分钟洗净。重复一次。
11. 二甲苯/石蜡（1:1）：60℃，45分钟的治疗。
12. 100％石蜡：60℃，20分钟的治疗。重复两次以上。
13. 嵌入嵌入模具。

5。切片

1. 准备15微米嵌入式眼部分，使用切片机。
2. 明胶涂层幻灯片上放置的眼睛部分，离开幻灯片温暖。

6。染色

1. 放置幻灯片二甲苯10分钟。重复一次。
2. 水合物：100％，95％，80％，70％，30％的乙醇各1分钟
3. 在DI水冲洗一分钟。
4. 在PBS冲洗15分钟。
5. PBST（0.2％TRITON - X 100的PBS），15分钟后洗净。
6. 在PBS冲洗15分钟。
7. 在堵了一个小时的解决方案（10％山羊二抗）的地方。
8. 初级抗体的地方过夜。
9. 在PBS清洗15分钟的主要抗体。
10. PBST洗涤15分钟。
11. 在PBS冲洗15分钟。
12. 2小时在黑暗的地方二级抗体（1:100稀释的PBS）。
13. 在PBS，PBST和PBS清洗15分钟，然后装入。
14. 在荧光显微镜下观察的幻灯片。

7。代表性的成果：

这种培养蝾螈红外的过程是细胞已被用来研究背侧和腹侧IPE细胞的再生潜力。此外，它也可以研究特定的基因，有助于对蝾螈眼晶状体再生机制。当细胞培养2周（ 图1），他们可以由基因转染，重新审视自己在镜头再生的功能。特别感兴趣的基因可能诱导腹侧虹膜。由于腹侧虹膜细胞不能transdifferentiate镜头（ 图2）的一个候选基因的感性的功能，可以研究。在过去，使用这种技术，我们已经表明， 当6 - 3以上的镜头维甲酸诱导的存在表示从^腹侧虹膜6。在图3中我们可以看到，腹侧虹膜总上升到了一个完全成长和分化的镜头（箭头），而不是比从背侧虹膜（箭头）的主机镜头的不同。

图1。一）背虹膜色素上皮细胞体外培养期为2周。 B）腹虹膜色素上皮细胞体外培养期为2周。请注意，色素沉着持续到了这个阶段，背，腹虹膜细胞。

图2。培养IPE细胞的再生能力。 a）从背IPE细胞聚合（箭头）的镜头感应。主机镜头感应背光圈（箭头），DI：背光圈，VI：腹侧虹膜，乐：晶状体上皮细胞，LF：晶状体纤维。二）缺乏诱导的镜头从腹IPE细胞聚合（箭头）。主机从背光圈镜头（箭头）的诱导。

图3。镜头从腹侧总诱导转6 - 3和维甲酸治疗。主机从背光圈镜头（箭头）的诱导。镜头诱导腹侧聚合（箭头）。

讨论

该协议已经建立了体外培养系统研究蝾螈镜头的再生机制。由于聚合（背侧或腹侧忠实地遵循其在体内再生过程中的行为，这种技术可以缓解巨大的努力，需要在蝾螈的转基因和可用于增益功能，以及丧失^功能的实验7,8,9。 ，碎石或作为一个整体的虹膜，可以很容易地被视为与生长因子研究在本议定书中所描述的影响，例如对BMP通路的作用已^使用这种技术6的研究。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lugol’s solution	Sigma-Aldrich	L-6146
HEPES	Sigma-Aldrich	H-4034
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	E-10521
Dispase	GIBCO, by Life Technologies	17105-041
Trypsin 1:250	GIBCO, by Life Technologies	27250018
L-15 ( Leibovitz)	Sigma-Aldrich	L-4386
DNase 1	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
Kanamycin Sulfate	GIBCO, by Life Technologies	100x, 15160
FBS	Sigma-Aldrich	F4135
Fungizone (amphotericin B solution)	Sigma-Aldrich	A2942
24 well collagen coated plate	BD Biosciences	354408