单果蝇 Ommatidium解剖和影像

摘要

在成人使用的限制因素果蝇眼来研究神经退行性疾病和细胞生物学，细胞内过程的困难成像。我们描述了单小眼的解剖，产生一个真正的初级神经细胞培养，可药物治疗和先进的成像。

摘要

果蝇神经科学的研究取得了宝贵的贡献，并已被广泛用作一种神经退行性疾病，因为^其强大的遗传学1的模型。尤其是飞眼睛已选择的器官，神经退行性疾病的研究果蝇的神经系统是最方便和生活可有可无的部分。但是完整的眼睛主要需要注意的是难度，因为强烈的自体荧光的色素，在成像的细胞内事件，如自体吞噬^动态 2，这是最重要的的神经退行性疾病的认识。

我们最近使用过的³单小眼的解剖和文化已经为我们的自噬功能障碍的认识中最重要的一个飞行模型Dentatorubro ^{- Pallidoluysian萎缩} （ DRPLA）3，4。

现在，我们的报告全面描述了这种技术（图1），改编自电生理研究，这是有可能大幅扩大，神经退行性疾病的飞行模型的可能性。这种方法可适应图像活细胞内的事件，并监测到感光细胞的有效药物管理局（图2）。如果使用与镶嵌技法^6-8相结合，可检测基因不同细胞的反应（图2）并行。

研究方案

1。 果蝇视网膜的解剖

1. 填写一个3井载玻片，用磷酸盐缓冲液（PBS 1X），然后麻醉苍蝇的_CO 2 。男性和女性都可以用于本次实验。
2. 苍蝇是麻醉后，拿起一个单一的飞行，使用镊子放入小碟的PBS。
3. 根据解剖范围，捏钳的长鼻，然后从身体分离的头撞断了脖子，使用产钳的第二套。
4. 控股的长鼻苍蝇头，沿左/右中线microscissors揭示大脑的飞头减少了一半。
5. 使用切割枪头拿起视网膜，并转移到了第二口井3井的玻璃幻灯片充满施耐德中等。
6. 首先，最头部的角质层剥离，然后取出用钳大脑。保留椎板间夹着的视网膜和角膜。
7. 下一步，转移到一个新鲜Schnieder介质直接放在载玻片下降（50μL）的视网膜。

2。解剖的小眼

1. 根据解剖的最终目的（是否立即成像或文化）和荧光显微镜（直接或倒置）的光学，这一步可以发生在显微镜幻灯片或在24孔板。剥离的最终目的，将被解剖小眼，直接在玻璃上滑动。
2. 把握的视网膜与钳最背侧或腹侧结束。使用microscissors沿背/腹侧中线，切一半的视网膜暴露在眼睛中间的小眼。
3. 继续把握视网膜，角膜是朝下和椎板朝上。用细的钨针，分离层和角膜的小眼。
4. 单小眼和小眼组将收集井或幻灯片的底部。删除任何较大的碎片可能在出发前收集。

3。处理，染色和成像

1. 为了分析自噬作用，淡化1:1000 Lysotracker施耐德下降（稀释1:10在施耐德，然后添加幻灯片上的下降0.5μL），混合，并等待10秒钟。
2. 从幻灯片中删除多余的液体，小心留下的小眼背后。罚款凝胶加载提示这是最好的。
3. 添加Vectashield下降盖的小眼，应用与指甲油的盖玻片和密封。

4。代表性的成果：

良好的执行该协议应该留下一个单一的小眼，小眼的小团体的数量，椎板的碎片放在一起，但很好地对角膜分离。这些都可以在这个例子中成像的可视化Atg8：GFP和Lysotracker，显示自噬溶酶体和autophagolysosomes（图3）。该方法可用于实时成像，但是，在这种情况下，要注意的是施耐德的中期自体荧光使其难以区分低强度的荧光信号。另外一个问题是，保持连接的光感受器，色素颗粒被强烈的荧光，特别是在红色通道，。可能需要一个明图片，以区别于真正的细胞器。

图1。解剖程序流程图，以获得从飞视网膜单一的小眼或小眼的小团体。

图2，这里简单的协议，可能的变化说明，涉及飞遗传学和老化上游长达24小时和下游药品监督管理局的解剖解剖和染色或培养。

图3从胡解剖的一个单一的ommatidium的自噬溶酶体的共焦扫描; GMR - GAL4 UAS - Atro75QN; UAS - GFP：：Atg8 / +飞，表达了一个多聚Atrophin突变和12岁的天，在29 ° C。明面板（右上）显示ommatidium几乎完好无损的结构和框架表示扫描的区域。红色标记的溶酶体，绿色的自噬，自动溶酶体，由两个细胞器的融合，出现黄色。箭头表示两个正在进行之间的自噬溶酶体融合事件。

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讨论

这里介绍的单ommatidium夹层使更深细胞像神经退行性疾病的进程， 在果蝇的眼睛为蓝本时的生物信息的收集。感光神经细胞更容易比其他神经元的访问和他们细胞质是非常相同的细胞在许多模型， 熟练使用量化体内的神经退行性疾病，特别大，因而适用于研究囊泡动力学。剥离的一个重要方面是主要的能力来执行它不固定的组织，绝不能暴露在空气中或干。这一基本的技术扩张的可?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论（可选）
便携式二氧化碳饮水机	Flystuff	59-150	笔芯也可用
DUMONT镊子5号	琼脂科学	T5034
3井载玻片	环境管理体系	71561-01
微型剪刀	VWR	HAMMHSB516 - 09
施耐德公司的培养基	VWR	733-1663
LysoTracker红DND - 99	Invitrogen公司	L7528
Superfrost幻灯片	VWR	631-0108
Vectashield用DAPI	媒介实验室	H - 1200
盖玻片	VWR	631-1336