配售早期鸡胚生长因子包被的磁珠

摘要

多种生长因子和蛋白质相互作用，从而诱导细胞在发展过程中不同的细胞命运。在这里，我们展示了一个在OVO准备使用，以解决发展中的不同的蛋白质之间可能的相互作用，由珠E2.5鸡胚。

摘要

神经管表示在特定的时空模式，在开发过程中的多种蛋白质。这些蛋白质已被证明是对细胞命运的决心，细胞迁移，并形成神经回路至关重要。神经元的诱导和图案涉及骨形态发生蛋白（BMP），刺猬（SHH），成纤维细胞生长因子（FGF），等等。 FGF8的表达模式，尤其是在邻近地区表达BMP4和SHH。这种表达模式与发展的互动，以促进在端脑的图案一致。

在这里，我们提供的视觉示范在其中OVO准备一个可以用来测试在形成前脑Fgfs的影响的方法。珠涂有蛋白质和发展中的神经管提供持续的曝光。因为程序使用小，小心地放在珠，这是微创，并允许被放置在一个单一的神经管几个珠子。此外，该方法可以使胚胎可以在一个比较成熟的的阶段分析，以检测在解剖学和神经图案的变化，持续发展。这一简单实用的协议允许实时成像。它提供了一种手段，使内源性蛋白水平的空间和时间有限的修改。

研究方案

1。取出鸡蛋从孵化器

在E2 - 2.5（〜圣17 HH），去掉鸡蛋和相应准备。他们可工作立即或几个小时的孵化器。鸡蛋可以安全地放置在室温下了一个多小时。鸡蛋可以留出操作的持续时间。有时，这些都需要一个小时或更长时间。

注 ：他们在室温下坐的时间越长，不太可能，他们要生存。

2。印度墨水的制备

1. 准备新鲜的解决方案的4％，印度油墨在无菌PBS。
2. 3毫升注射器填充解决方案。
3. 放置了27计，半英寸的注射器针头。
4. 使用对止血，弯曲到90 °角针。

3。打开墨汁的鸡蛋和注射

1. 使用一对镊子，剥离的录像带，并在打开的窗口，确保蛋的背面使用的磁带背面。
2. 指南在直角针，直到它位于下方的胚胎。配售项下的浮动盘针，确保墨水，这是胚胎毒性，不会直接接触。
3. 您只需注入足够的墨水来创造一个舒适的反差。这通常是小于¼毫升。

4。开放性神经管

1. 一双细清扫剪刀和削减位于顶部的薄膜，有时甚至左右，胚胎。
2. 就拿了一双55钳或钨探针，从后到前的开放性神经管。确保开放是大到足以放入珠。

注 ：根据不同的年龄，罚款钨探针可以用来做同样的事情。

5。检索涂肝素压克力珠

1. 使用一对55钳，找到解决方案中的一个完整的珠子。让珠附加给小费，慢慢接近的镊子。
2. 从溶液中取出磁珠和鸡蛋的顶部。
3. 一旦珠是其解决方案，它不太可能会脱落，直到它被放置在白蛋白。

6。放置珠

1. 一旦珠一直放在目标区域的顶部，使用钨探针，以指导对前脑或固定在后脑。
2. 添加几滴使用的PBS 10μL移液器。

7。关闭鸡蛋

1. 使用的磁带的薄薄的一片关闭窗口关闭鸡蛋。
2. 根据预备协议的鸡蛋，在可用 http://jove.com/index/Details.stp?ID=306的密封。

讨论

根据您要使用的蛋白质，有不同的协议，关于如何准备珠。在这些实验中，我们使用肝素丙烯酸珠，但也可用于阿菲 - 凝胶珠。我们发现，肝素丙烯酸珠更容易操纵在水环境中的卵白蛋白。珠蛋白质在5升浸泡在4 ° C过夜控制珠被放置在无菌PBS，直到放置时间。在使用OVO准备的优点是，胚胎仍然活着，和自由发展^通常为1。虽然保存在其中的一个外植体的环境，可用于特定变量控制的，活的胚胎允许^的<...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eggs	Animal			Fertilized, E2-2.5 (~ St. 17 HH)
Incubator	Profi-I	Lyon
India Ink	Tool	Higgins		Prepare a 4% solution in sterile PBS.
Sterile PBS				Alternatively, an antibody cocktail can be used
1ml syringe
27G 1/2 needles	Tool	BD Biosciences	305109	Angled at 90 degrees
Forceps	Tool	World Precision Instruments, Inc.		size 55
Hemostats
Dissection scissors	Tool	World Precision Instruments, Inc.	500086	vannas, 8.5cm
Parafilm tape				to seal eggs
Tungsten Probe	Tool	Electron Microscopy Sciences	62091	Tool #24. Handle optional.