miRNA的目标使用的任务目标ID库的全基因组屏幕

摘要

目标ID图书馆是一个基于质粒，用于识别miRNA靶基因的克隆基因的全基因组的集合。在这里，我们展示它的使用和应用。

摘要

目标ID库的设计，以协助发现和鉴定的microRNA（miRNA）的目标。目标ID图书馆是一个基于质粒的全基因组cDNA文库中克隆到双选zeocin胸苷激酶（TKzeo）融合蛋白，3'UTR下游。第一轮的选择是稳定的转化，引进miRNA的利益，最后，选择的cDNA包含的miRNA的目标。确定选定的cDNA序列（目标ID图书馆的工作流程和细节，请参阅图1-3）。

人类转录，以确保覆盖面广，目标编号图书馆的cDNA产生寡-dT通过使用准备从多种人体组织和​​细胞系的总RNA池启动。造成cDNA的范围从0.5到4 KB，一个1.2 kb的平均规模，并克隆到的p3TKzeo双选质粒（质粒图谱见图4）。在李代表的目标基因brary Sigma-Aldrich公司的网页上可以​​找到。 （ 见表3），Illumina的测序结果表明，该库包含16922 21518在UCSC的RefGene独特的基因（79％），或14,000 10或更多的内容（66％）的基因。

研究方案

1。转染与目标识别库和稳定细胞系的选择

1。 zeocin杀曲线

zeocin用于选择稳定转染细胞。然而，zeocin过剩导致不受欢迎的表型反应，在大多数细胞类型。因此，必须执行KILL曲线分析，建立最低致死剂量。

1. 板1.6×10 ⁴成井的细胞在96孔板120μL媒体。
2. 第二天，添加浓度的增加，从50微克/毫升1毫克/毫升，以适当的井zeocin。
3. 检查的可行性，每2天。
4. 更换媒体包含zeocin每3天。选择试剂的最低浓度，导致完整的细胞死亡所需的时间后，应使用该细胞类型和实验。我们的研究结果表明，500微克/毫升的zeocin是最佳的A549，HeLa细胞，MCF7细胞。

2。图书馆通过核转染和选择

1. 选择一个单元格的行要么不表达或表达水平低的你感兴趣的miRNA。稳定表达目标ID库后，将在B节中介绍的miRNA实现的目标选择。
2. 文化/扩大细胞。 2×10 ^7％，库转染的细胞，我们已取得优异的成绩。
3. Trypsinize细胞> 80％汇合，2×10 ⁷细胞转移至15毫升无菌螺钉平顶管。
4. 在200 XG颗粒胰酶消化细胞5分钟。
5. 取出介质的HBSS或1×PBS洗涤细胞沉淀。
6. 200 XG离心5分钟，吸洗。
7. 重复洗涤细胞沉淀的一步。
8. 预温6孔板2毫升完全培养基，在37°C
9. 每0.5毫升管加入转染对每个目标ID图书馆2微克（不超过10μL）。
10. 在15毫升管重悬细胞，每2×10 ⁶细胞的Amaxa核转解100μL（细胞特异性）以上。例如，添加10 Nucleofections 1毫升的试剂。
11. 一次在一个反应​​，添加100μL细胞质粒2微克。混合用吸管。
12. 将混合传输以Nucleofector试管。
13. 插入Nucleofector仪器试管和运行优化方案适当的细胞株（高效率，多细胞活力的首选）。
14. 填写预温中移液管。占用相同的吸管和转移到6孔板中的细胞。重复为每个核转，每口井之一。
15. 返回到生长室过夜培养。
16. 第二天，更换培养基，使细胞恢复为3-5天。
17. 更换介质含有完整的中等zeocin适当的水平，从杀曲线分析确定。
18. 莫zeocin选择nitor细胞（细胞死亡）。
19. zeocin每2-3天更换培养基。
20. 一旦合流，在6孔板，通道，游泳池和拓展更大的烧瓶的细胞。
21. 细胞体外扩增的时间长度是用户和依赖细胞株，但强烈建议扩大zeocin耐药细胞冷冻库存，为今后筛选产生（〜2-3周;细胞系而定）。

2。染图书馆细胞miRNA的表达构建，选择稳定的细胞系，并选择miRNA靶

注：Zeocin选择不再需要或想要的。 zeocin中miRNA的表达和更昔洛韦（目标）选择的细胞接触，可能会导致miRNA靶基因的损失。

3。嘌呤霉素，G418筛选，和更昔洛韦杀曲线

1. 执行杀野生型细胞更昔洛韦稳定表达目标ID库和嘌呤或G418的曲线细胞。
2. 板1.6×10 ⁴成井与96孔板120μL新鲜媒体的细胞。第二天从0.1到10微克/毫升，puromycin/G418或2至32μM更昔洛韦选定井。
3. 检查的可行性，每2天。含有选择试剂，每3天更换介质。所需的时间后，导致完整的细胞死亡*选择试剂的最低浓度，应使用的细胞类型和实验。我们的研究结果表明，嘌呤0.25到1微克/毫升是最佳的A549细胞，HeLa细胞，MCF7细胞，0.3μg/ ml的G418和MCF7细胞8-16μM的更昔洛韦最佳的A549细胞，HeLa细胞，MCF7细胞。
   
   *注意：随着更昔洛韦选择，可能会不完整的细胞死亡观察细胞生长缓慢或没有。观察了几天的治疗，以验证他们不积极分裂的细胞。如果是这样的情况，然后在中酚红仍然是红色的。这也可能是必要的执行基目标ID库LL曲线分析转染细胞，如果在发生的变化是观察。然而，这将需要的细胞类型的具体基础上确定。

4。通过核转染和目标选择的miRNA转染

1. 成长/扩大目标ID图书馆细胞，达到2×10 ⁷细胞，，并trypsinize细胞> 80％汇合时。
2. 转让2×10 ⁷细胞15毫升无菌螺丝突破在5分钟的200 XG管和沉淀。
3. 取出介质的HBSS或1×PBS洗涤细胞沉淀。
4. 200 XG离心5分钟，吸洗。
5. 重复洗涤细胞沉淀的一步。
6. 预温6孔板2毫升每口井的完全培养基，在37°C
7. 新增2微克的miRNA表达质粒（不超过10μL）每0.5毫升每转管。 origene microRNA表达质粒（新霉素 - G已成功用于418选择）或pBABE-PURO（质粒1764自我克隆miRNA基因; Addgene）。对于后者，一方〜200 bp的miRNA的发夹，PCR克隆人类DNA。
8. 在15毫升管重悬细胞，每2×10 ⁶细胞的Amaxa核转解100μL（细胞特异性）以上。例如：对于10 Nucleofections，加入1毫升的试剂。
9. 一次在一个反应​​，添加100μL细胞质粒2微克。混合用吸管。
10. 将混合传输以Nucleofector试管。
11. 插入Nucleofector仪器试管和运行优化方案适当的细胞株（高效率的多细胞活力的首选）。
12. 填写预温中移液管。占用相同的吸管和转移到6孔板中的细胞。重复为每个核转，每口井之一。
13. 返回到生长室过夜培养。
<李>替换介质，使细胞恢复为3-5天。
14. 取代完整的杀曲线的miRNA的构造与转染前进行的测试确定的培养基含有嘌呤或G418的适当水平中等。
15. 监测细胞嘌呤/ G418筛选（细胞死亡）。
16. 嘌呤/ G418的每2-3天更换培养基。
17. 一旦合流，在6孔板，通道，游泳池和拓展更大的烧瓶的细胞。
18. 细胞扩张的时间长度是用户的依赖，但它强烈建议扩大嘌呤/ G418抗性细胞冷冻库存，为今后筛选产生（〜2-3周;细胞系而定）。
19. 适当水平的更昔洛韦（GCV），和嘌呤/ G418的决心杀曲线的miRNA的构造与转染前进行的测试，更换介质。
20. 监测选择的细胞（细胞快要枯萎G，miRNA的目标和TK-的ZEO击倒）。
21. 扩大细胞GCV和嘌呤/ G418的存在。
22. 准备选择在GCV的细胞基因组DNA。
23. PCR扩增引物试剂盒（PCR扩增）插入。
24. 标准测序或提交深度测序的PCR产物克隆到TOPOTA载体（Invitrogen公司）。

3。 PCR的扩增选定库插入和序列

注：此程序进行的PCR扩增库，幸存下来的更昔洛韦选择目标。

5。收集更昔洛韦选定的单元格准备染色体DNA，用1 GenElute哺乳动物的基因组DNA小量提取试剂盒（目录号G1N10）或同等学历。我们建议准备从母细胞株不包含目标ID库，用于与DNA相比，从目标选定在聚合酶链反应的细胞作为阴性对照DNA。

1. 聚合酶链反应（上午）plify基因组DNA扩增引物和扩增引物2。已获得成功扩增的JumpStart REDTaq预拌反应预混 - 聚合酶链反应（目录号P0982）。可能是必要的，如果使用另一个聚合酶条件的优化。请参考表1样本PCR PCR循环条件设置和表2。
2. 解决2-5μL的PCR产物在1％琼脂糖凝胶。预期的产品应该具有一些明显的DNA带的涂抹。比较来控制细胞基因组DNA的PCR产品，没有目标的ID库。
3. 进行克隆和/或深层测序的PCR产物。如果没有观察扩增产物，或者是相同的DNA来控制，优化PCR扩增条件（即，引物浓度，退火温度和循环）。

6。克隆和测序

注：我们强烈建议克隆的PCR产物s，然后使用克隆扩增试剂盒提供的引物至少96执行标准测序。执行此程序已成功使用96过夜培养和质粒纯化系统。即使所需的深度测序，克隆和标准测序的初步结果可以用来作为质量检查，以确定是否是必要的额外费用的深度测序。

1. 按照TA克隆试剂盒制造的克隆PCR扩增产物（以上）的协议。
2. 改造为主管细菌细胞的克隆和选择抗生素含中等过夜。
3. 孤立和生长在液体培养基中的单个菌落，含有适当的抗生素。
4. 净化质粒DNA。 6.5。扩增引物进行测序反应。
5. 识别靶基因与人类转录组（已知的成绩单）和人类基因组序列的BLAST对齐（新型TRanscripts）。

*克隆故障排除：如果一个从序列插入质粒序列，优化等克隆/排序条件：

• PCR扩增产品（插入）的质量和数量
• 连接反应
• 质粒制备（数量和质量）
• 测序反应条件

4。代表结果

图书馆屏幕的miR-373的目标
为了评估性能的任务目标ID图书馆中，miR-373的目标选择的MCF-7表达细胞库。 MCF-7选择，因为它表达很少或根本没有检测到miR-373的（数据未显示）。 miR-373的选择，其生物的兴趣。 miR-373的表达促进MCF-7在肿瘤侵袭和转移，通常是一个非转移性细胞株[2]。此外，鼠标的miR-373同源的小鼠胚胎干细胞中的miR-290簇涉及电池保养[3]的miR-373家族成员中，miR-372，促进成纤维细胞重编程诱导多能干细胞[4]。最后，我们用锌指核酸插入PGK启动子的miR-373表达建成AAVS1网站在MCF-7细胞，并产生潜在的miR-373的RNA微阵列分析（数据未显示）的目标清单。

目标ID图书馆MCF-7细胞的转染，稳定人口的细胞被选为和zeocin含中等扩增。由此产生的细胞（MCF-7细胞库）稳定转染与miR-373的表达结构，选择和更昔洛韦含中等，以丰富的细胞表达的miR-373的目标。我们观察阴性对照图书馆的MCF-7细胞的miR-373（无）没有分离，成为圆润如预期的死细胞。然而，他们没有停止生长，这是很容易发现，因为酚红含中没有变成橙黄色作为观察FOR细胞表达的miR-373（ 图5）。细胞含有更昔洛韦的培养基中，扩大和侧翼目标ID cDNA文库插入和准备从幸存的细胞DNA引物的PCR目标序列分离。 Illumina的测序PCR产物。

如表4所示，我们得到的cDNA 17740719读取，这映射到11,076独特的基因。这些独特的基因，2898人被发现超过40条，因此被认为是可靠的命中。 13106469载体读取预计因为PCR引物，用于扩增的cDNA插入40个和300个碱基的插入部位远离。正因为如此，它预计将不同于较传统的基因材料的深度测序载体，导致大部分序列。百分之十四没有映射到任何载体或基因，但没有配合NCBI的非冗余核酸数据库（即，与NR命中），只有1％的人没有cDNA片段。

初步比较发现，10个目标ID库确定了独特的基因是先前发现miR-373的在TarBase的目标（ 见表5）的名单也。这些10 miR-373的目标是先前发现的一种人工合成的miR-373的模拟[5]瞬时转染的HeLa细胞与RNA芯片。此外，我们发现这些相同的10个基因下调的MCF-7细胞表达miR-373的AAVS1网站（数据未显示）。因此，这10个是可能的miR-373的有效目标。正在进行的工作是表征的潜在目标名单，并尝试实验验证定量PCR，Western印迹和荧光素酶报告基因检测的选择命中。

图1。目标ID库的工作流程。部分AC：参考过程中的部分。每一步都说明，并详细描述图2和3。

图2转染和Zeocin选择。 目标ID图书馆是一个质粒池（A）与人类基因插入后，将胸苷激酶zeocin融合蛋白（TKzeo图4）每到3'-UTR。细胞转染目标ID图书馆（二），并允许恢复3-5天。回收期（三）在此期间，可以整合到基因组的结构和表达编码的谈话全文（四）。恢复后，细胞暴露zeocin（五）。稳定的综合目标ID结构TKzeo融合蛋白表达细胞生存zeocin选择（F）的。转染细胞死亡（G）的。此外，任何细胞含有一个结构，是一种内源性的miRNA的目标，或任何超视距呃目标ID结构会死（高）TKzeo表达的细胞，抑制因子表达。

图3 miRNA的转染和更昔洛韦的选择。包含目标ID图书馆（即选定zeocin-细胞）的细胞转染与可选择的microRNA表达构造（ 一 ）。在恢复过程中，miRNA的表达结构可以集成（B）和表达miRNA的构造上的编码选择标记。选择稳定的集成（C）和细胞扩张后，细胞治疗用更昔洛韦（四）。 （五）另一方面生产中存在更昔洛韦（即细胞结构没有针对性的miRNA TKzeo）胸苷激酶（TK）的细胞就会死亡，细胞中含有与miRNA靶小号图书馆结构的ITES将不会产生传统知识，因此，将生存更昔洛韦选择（F）的。可以生长，存活的细胞基因组DNA隔离，含基因的miRNA靶位点PCR扩增使用的目标ID扩增引物。 PCR产物可识别miRNA靶基因与人类基因组测序和对齐。

图4质粒图谱和扩增引物的位置。 SFI我cDNA的克隆网站。

引物序列

任务目标ID扩增引物1

5 ACGACGTGACCCTGTTCATC 3

任务目标ID扩增引物2

5 TAAAACGACGGCCAGTGAAT 3

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图5。细胞生长的影响更昔洛韦。二十四孔板接种二十万MCF-7细胞MCF-7细胞含有目标ID库。二十四小时后，培养基含有0，8，或16μM更昔洛韦的培养基取代。 15天之后，该板块被拍到（6上井），然后与HBSS中与艳蓝R染色液（B6529）（6井）染色洗井。请注意，更昔洛韦有没有图书馆MCF-7细胞没有影响，因为他们不表达胸苷激酶（TK）。另一方面，MCF-7细胞库细胞做明确的传统知识，但不完全由更昔洛韦杀害在8或16μM，采取了Brillinat蓝色的活细胞中。然而，图书馆细胞停止生长，更昔洛韦，苯酚在他们介质的红色染料的颜色证明。被捕的细胞不酸化他们的媒介，和颜色保持红色，而不是改变或昂热 - 黄色。

试剂	体积/反应
Jumpstart的REDTaq预拌反应混合物	10μL
扩增引物1（25μM的）	0.2μL
扩增引物2（25μM的）	0.2μL
基因组DNA	50-200纳克
水，分子级	20μL

表1。

步骤	温度。	时间	周期
初始变性	95℃	5分钟。	1
变性	95℃	30秒。	泛=“3”> 40次
退火*	62℃	30秒。
延期	68℃	2分钟。
最后一次延长	68℃	5分钟。	1
举行	4℃	举行

表2。

*退火温度可能会有所不同，但我们已经观察到最好的扩增产物与退火温度在53和64之间不等°C。

表3。目标ID Illumina的测序图书馆内容。

表4。miR-373的Illumina的测序选定的目标。

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表5。先前由RNA微阵列确定了10个目标。

讨论

microRNA是20-24核苷酸的RNA调节基因表达的转录后通过抑制mRNA的翻译，经常动摇的目标mRNA（综述[6]）。单个的miRNA可以调节数百个基因来控制细胞的发展和环境信号的响应。识别和验证目标基因是决定一个miRNA在这些途径中的作用和功能是必不可少的。然而，目标识别，因为在动物中，miRNA和其目标网站不完全互补的，并不是一件简单的。 “种子”的地区，基地通过7 miRNA的5'-端，通常是互补的目标。不过，也有许多例外的种子规则，和下游的碱基配对可以弥补不完善的种子比赛。已开发的计算机算法来预测种子匹配和下游的补偿，目标结构上的miRNA靶D的位置，序列保守性，以及各种实验验证目标（综述[7]）已观察到的其他参数。而在硅片的预测是方便做识别许多有效的miRNA靶基因，预测基因实验验证测试失败，许多实际的目标是不预测。此外，由于计算机算法根据先前确定的目标功能，他们根本不容许什么是已知的偏离目标的发现。

一些实验系统已成功地用于识别或发现在活细胞功能的miRNA靶基因。这些全球性的筛查方法包括微阵列和RNA测序，RNA的免疫共沉淀（RIP）和氨基酸在细胞培养稳定同位素标记（SILAC的），蛋白质的方法（综述[7]）。每种方法都有优点和缺点。由于miRNA的目标往往破坏的mRNA，并导致其降解，损失ØR GAIN后引进的miRNA模仿或抑制剂，分别在mRNA水平，可以识别miRNA靶标。很容易被检测芯片或深度测序表达这方面的损失或收益。虽然mRNA的检测方法是蛋白检测方法相比更简单，更敏感，基​​因检测将错过任何miRNA的目标是没有退化。从巴特尔实验室SILAC的那些miRNA靶RNA检测结果比较从最近的报告[8]或核糖体分析[9]表明，哺乳动物的miRNA主要采取行动，减少目标mRNA水平。然而，许多其他实验室工作与个人的miRNA靶基因检测中蛋白质的变化，但在mRNA水平没有变化。什么似乎是没有检测到mRNA的损失与翻译调控的报告包括：miR-10B的上HOXD10 [10]，miR221/222上p27kip1的[11]中，miR-21 PDCD4 [12]，miR-126的p85β[13]中，miR-34对SIRT1的[14]，miR-21的PTEN [15]中，miR-302D Arid4b [16]，miR-200C的JAG1 [17]，和miR-299，297，567，ND VEGFA 609 [18]。此外，克兰西等[19]最近报道，let-7的翻译调控只发现当包含let-7的目标网站的个人表达亚型选择性检测。后者表明，至少在某些情况下，翻译调控可能被忽略在复合型材 - 也就是说，当所有的mRNA异构体作为一个mRNA的检测 - 与许多芯片和序列分析获得。通过Argonaute蛋白（通常AGO2）或其他相关蛋白（RNA免疫沉淀，或RIP）的miRNA-mRNA的复合物的免疫共沉淀分离miRNA靶基因调控机制。此外，RIP检测内源性的，想必生物学相关，相互作用。但是，不知道是否所有的miRNA-mRNA的相互作用功能，RIP会错过任何mRNA的目标关联只是短暂的，或者是正在迅速退化。此外，特定的miRNA-mRNA的伙伴必须推断bioinformati的美云，因为所有的miRNA表达对共沉淀一起。最后，SILAC的直接识别miRNA调控，蛋白质本身的最终产品，但不敏感，因此错过难得的蛋白质和蛋白水平的小折变化。

鉴于当前miRNA的目标识别方法的局限性，我们认为需要一个附加的全局分析，识别功能miRNA靶基因的一种替代机制。为了满足这种需要，我们许可由JOOP Gaken伦敦大学国王学院和阿齐姆Mohamedali发明的技术。他们的发明是一个双选择融合蛋白，特别是一个胸苷激酶zeocin融合的，在其3'UTR潜在的miRNA靶序列的cDNA文库由监管。可以选择与表达基因TKzeo，结构稳定转染细胞与zeocin，在图2所示。 miRNA的表达了兴趣后，可以选择的miRNA的目标无线网络日更昔洛韦，在图3所示。更昔洛韦杀死细胞表达胸苷激酶，也就是说，任何细胞表达TKzeo的基因缺乏利益的miRNA的目标。有针对性的基因可以分离的DNA的PCR扩增细胞的生存更昔洛韦使用侧翼的cDNA和PCR产品可引物测序，以确定目标。

我们已经发展成为一个全球性的鉴定和功能的人类miRNA靶基因的发现，新工具的国王学院的技术 - 任务目标ID图书馆。与目标识别库，用户可以通过一系列哺乳动物细胞培养转染和药物筛选的步骤隔离miRNA靶基因。图书馆是全面的，包含66-79％的人类基因。初步结果表明，先前发现以及新的目标，可以从任务目标ID图书馆隔离。

虽然该协议是一些长度，目标ID库需要使用标准的分子实验室技术 - 哺乳动物细胞培养，转染，药物筛选，PCR扩增，测序 - 因此，应该在大多数生物学家的手段。我们建议支付足够的重视，适当的实验设计，优化培养条件，最重要的是，预先测试每一个新的细胞类型选择步骤（杀死曲线）与目标识别库，以确保成功，以确定最佳的药物浓度。

与所有的miRNA目标识别方法，它强烈建议用第二种方法，如芯片，定量RT-PCR，记者法（即荧光素酶），或西方的分析，验证，筛选目标ID图书馆确定的目标。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
订JumpStart REDTaq预拌	Sigma-Aldrich公司	P0982
更昔洛韦	Sigma-Aldrich公司	G2536
G418的	Sigma-Aldrich公司	G8168
嘌呤	Sigma-Aldrich公司	P9620
TOPO TA	Invitrogen公司	KNM4500-01
GenElute哺乳动物的基因组DNA小量提取试剂盒	Sigma-Aldrich公司	G1N10
细胞特异性核转ķ它	龙沙
nucleofector	龙沙	反倾销协定，1001
zeocin	Invitrogen公司	R250-01
目标ID库	Sigma-Aldrich公司	MREH01