GENPLAT：生物质酶的发现和鸡尾酒优化的自动化平台

摘要

GENPLAT（GLBRC酶纲要“）是一个生物质降解酶鸡尾酒的发现和优化的自动化平台。它可适应多种原料和包含多个组件的酶的混合物。

摘要

酶的生物质解构的成本高，木质纤维原料的液体运输燃料如乙醇的经济转换的一个主要障碍。我们已经开发了一个集成的高通量平台，为来自不同的预处理/生物组合的糖释放的发现和开发新的酶和酶鸡尾酒GENPLAT。 GENPLAT包括四个要素：个人纯酶，统计设计的实验，生物泥浆和酶的机器人pipeting，并自动发布GLC和木糖colorimeteric决心。个人酶在毕赤酵母或里氏木霉 ，中的表达，或从商业鸡尾酒或新型微生物提取物的色谱净化生产。单纯格（部分因子）混合模型设计商业设计实验统计软件的使用。高度复杂的酶混合物性构造成96格式的机器人pipeting。发布GLC和木糖的测量是采用酶联比色法自动化。已经过测试，对各种原料和预处理组合优化酶的混合物，含有多达16个组件。

GENPLAT是适应纯酶，商业产品的混合物（例如，1000 Accellerase和Novozyme 188），新型微生物的提取物，或组合的混合物。为了使测试〜10纯酶的混合物，要求小于100微克每一个蛋白质和少于100人的总反应，蛋白质15毫克/ G葡聚糖在最后的总负荷运行时。我们使用从多个来源的酶。纯化的酶可以从天然来源，如真菌文化（如黑曲霉（Aspergillus niger），Cochliobolus carbonum，Galerina marginata），或他们可以通过编码基因的表达（从增加numbe获得R的微生物基因组序列）在诸如E.主机大肠杆菌，毕赤酵母 ，或如T.丝状真菌瑞氏木霉 。蛋白质也可以从商业酶鸡尾酒（例如，Multifect木聚糖酶，Novozyme 188）的纯化。越来越多的纯酶，包括糖基水解酶，细胞壁积极酯酶，蛋白酶，和裂合酶，可从商业来源，例如，Megazyme公司（www.megazyme.com），NZYTech（www.nzytech.com） PROZOMIX（www.prozomix.com）。

设计专家软件（STAT - EASE，公司）是用于创建单纯晶格的设计和分析响应（在这种情况下，GLC和木糖发布）。混合物含有4-20组件，它可以在0和100％之间的比例不同。检测点通常包括足够数量的干预点，以产生一个有效的模型的极端顶点。在实验设计的术语，我们的研究大多是“混合”的实验，这意味着一笔将组件添加到一个全社会固定资产蛋白加载（毫克/克葡聚糖表示）。单纯晶格的混合物的数量依赖于混合物中的元件数目和多项式（二次或三次）的程度。例如，6组件的实验将需要63增强特殊的立方模型不同的反应，它可以检测三个双向互动，而只有23个人的反应是必要的增强二次模型。对于包含超过八个组成部分的混合物，二次实验设计更实用，而且在我们的经验，这种模型通常是统计学上有效的。

所有的酶负荷，最后总负荷（我们的实验通常是15毫克蛋白质/ G葡聚糖）的百分比表示。对于“核心”的酶，较低的百分比限制设置为5％。此限制是来自我们的经验，GLC和/或木糖的产量非常低，如果任何核心酶是目前在0％。不良模型结果从太多的样品表现出非常低的GLC或木糖产量。依次设置下限，确定一个上限。也就是说，一个六分量的实验，如果设置为5％的下限为每个单独的组件，然后将各单项组件的上限75％。被视为“附件”的所有其他酶的下限设置为0％。 “核心”和“附件”的名称有点乱，将基板上的不同而有所不同，但在我们的研究从玉米秸秆释放GLC的核心酶包括以下酶从T 瑞氏木霉 ：CBH1（也被称为Cel7A），CBH2（Cel6A），EG1（Cel7B），BG（β-葡萄糖苷酶），EX3（远藤-β1,4 -木聚糖酶，GH10），和BX（β-木糖苷酶）。

研究方案

1。产酶

1. 在毕赤酵母中的蛋白质生产到向量pPICZ或pPICZα相应基因的克隆和改造成体育酵母 。在百思不得其解的500毫升烧瓶增长甲醇诱导细胞在300毫升的批次，每24小时（班纳吉等人，2010A）。
2. 精矿和切向流过滤脱盐培养滤液。
3. 商店小等分的酶在20％甘油于-80 ° C。毫克/毫升的浓度范围是1-10。

2。试验设计

1. 输入要测试的酶的数量，他们的上限和比例较低（例如一个核心酶的5％的比例较低）和实验设计的类型（例如，二次或三次）到设计，Expertsoftware。
2. 计算微克每一个要加入使总负载的15毫克/克葡聚糖酶的数量，然后计算出每一种酶在μL的量添加到每个反应。
3. 生成Excel工作表指定配药水和酶的实验设计和使用从文件转移功能导入Biomek的FXP软件源的实验器皿，井源，目的地实验室器皿，目的地水井，和传输卷。

3。酶解

1. 暂停50 mM柠檬酸钠，pH值4.8生物质的泥浆，含5μg/ ml的四环素和5微克/毫升酮，在桨水库。
2. 机器人吸管的泥浆200μL到每孔96孔深孔反应板采用跨度8 1000 -μL与去年0.5厘米切断的吸管提示。一次混合的泥浆，在100μL/秒，然后吸桨水​​库相同体积和分配到板。
3. 免除到同一板使用的程序输入到贝克曼FX的酶。
4. 穿孔capmats密封板。
5. 倒像，挖掘板块多次克服表面张力。杂交孵化器旋转10转48小时，放置在50 ° C的板块。

4。 GLC和木糖的测定

1. 摆动桶离心机在1250 XG 3分钟离心反应板。
2. 100μL上清转移到常规96孔板使用的Biomek FX AP96 POD。
3. 孵育板在90-95 ° C下10分钟，以灭活酶，然后在1250 XG离心30秒。
4. GLC测量，转移到常规的96孔板12μL上清。加入192μL的葡萄糖氧化酶/过氧化物酶（GOPOD）试剂。板在50 ° C孵育20分钟，并宣读酶标仪在510 nm处的吸光度。空白是没有酶反应混合物。
5. 木糖测量，转移到384孔板4μL。加入检测试剂，并在340 nm处读取的板块。空没有酶的反应混合物。

5。数据分析

1. 转换的吸光度值％GLC和木糖产量的基础上著名的GLC和木糖的原生物质的含量。这些百分比作为回应导入到设计专家软件。检查统计paramenters，以确保一个强大的模型的标准履行。
2. 确认实验的最佳模型预测。

6。与GENPLAT代表性的成果：

（1）建立个人纯蛋白质的优化混合物 。结果表明酶是重要的，以及在什么比例，而其中的酶并不重要。一些蛋白质丰富的T.瑞氏木霉 secretome（Nagendran等，2009），如Cip1和Cip2，玉米秸秆预处理氨纤维膨胀（AFEX）或碱性路政署没有作用发挥GLC释放 rogen过氧化氢法（AHP）（班纳吉等人，2010B）。另一方面，一些蛋白质是出乎意料的重要。例如，内切木聚糖酶糖基水解酶家族10日和11日都是重要的GLC释放一个木聚糖酶不能为其他（班纳吉等人，2010B，C）代替。 Cel61A，轻微的蛋白质中的T.瑞氏木霉 secretome，是非常重要的GLC，但不木糖释放。某些酶的重要GLC和木糖的释放，而另一些仅适用于一个或另一个（班纳吉等人，2010C）的必要。

16个组件，每一个合成的混合物，含有浓度为0.94毫克/毫升（即非优化的混合物），发布从AFEX预处理的DDG - 38％可用GLC。在相同的条件下水解下，优化的混合物，其中的16个组件的浓度范围从0％到32％，52％的GLC公布（图2）。这个实验说明了建设定义混合物的效用。

_content“>（2）建立不同的预处理/基材组合优化的鸡尾酒。当前商业纤维素酶制剂是”一个尺寸适合所有“，在现实中，最好的鸡尾酒取决于基板和预处理。单一产品如Accellerase 1000提供了从不同的基板，以同样的方式预处理，从接触到不同的预处理（图1）在同一基板不同的收益率。我们用GENPLAT优化多个预处理和多发原料（班纳吉等纯酶的混合物人，2010C）。图2显示了如何AFEX预处理玉米秸秆，AHP预处理玉米秸秆，AFEX预处理DDG - 16纯酶最佳酶的比例不同。只有11酶在图2所示，因为最佳被发现的其他5个（Cel61B AbfB，Cip1，Cip2，并Cel12A）的比例为0​​％（班纳吉等人，2010C）。

（3）新型酶的发现 。的纯蛋白质的优化混合物的建设是一个持续的过程。由于新的蛋白质成为纯粹的形式（从商业来源，异源表达，或净化）提供的，他们可以将它们添加到当前的优化设置，系统测试。 GLC或木糖的新型蛋白质，有助于释放，然后成为一个新的，优化组合的一部分。这样，GENPLAT变成一个确定新的酶生物质解构平台。我们已经取得了其他真菌提取物比t 瑞氏木霉和A 。 尼日尔不同衬底上生长。加入到我们的核心设置一个特别提取带动GLC产量。负责蛋白质纯化，并没有任何商业酶制剂（Banerjee和沃尔顿，未公布结果）是一种新的糖基水解酶。

（4）发现更好的酶 。显示GENPLAT哪些酶是最重要的的一个退化特别是生物质，我们有更好的理解其中的酶应重点改善。可以找到更好的关键酶的例子在自然界寻找或蛋白质工程。 （一种酶可以“更好”比T.瑞氏木霉同源取决于所需的属性，在几个方面，例如，更高的具体活动，更大的协同作用，减少蛋白水解的灵敏度，或热稳定性增强）。 GENPLAT，提供了一个有意义的化验可能更好的酶平台，因为它采用了切实复杂的鸡尾酒（重要，因为没有生物酶隔离工程）和一个现实的基板（重要的，因为纯纤维素或其他人造基板的结果可能不相关天然木质纤维材料）。

（5）商业酶的优化 。纯酶的数量足够大的还没有在现实世界中存在。直到他们这样做，乙醇亲ducers必须依靠商业产品，如Accellerase 1000和MultifectXylanase。然而，商业酶的混合物，通常执行比任何个人的更好，GENPLAT可用于设计多个商业酶的优化鸡尾酒。图3显示了GENPLAT使用优化的四种商业酶制剂的混合物。 AFEX预处理DDG - GLC释放的最佳比例分别为47％Accellerase1000 Multifect果胶酶Novozyme 188，22％和4％Multifect木聚糖酶（班纳吉等人，2010C），27％。图3b显示AFEX - DDG - GLC产量从四个酶制剂的差异;优化的商用混合物提供了更高的GLC产量仅比Accellerase1000，SpezymeCP单独，或16组件的合成混合物。这个实验还表明，16组件的合成混合物是缺少一个或多个酶最佳GLC释放，这是在一个或更多的商业酶需要。 GENPLAT可以被我们教育署，以确定这样的组件。

图1。没有一个单一的商业酶制剂是所有基材和所有预处理的最佳选择。五基板和三个预处理磨（0.5毫米粒度）的类似条件下进行比较，酶量（15毫克/克葡聚糖）和水解条件（48小时，50 ° C）A.不同的AFEX预处理基板消化Accellerase 1000。B.消化玉米秸秆预处理Accellerase 1000由三个不同的方法（见班纳吉等人，2010C）。

图 11 AFEX预处理玉米秸秆（AFEX - CS），碱性过氧化氢 ​​预处理玉米秸秆法（AHP - CS），或AFEX预处理干GLC释放酶的最佳比例提取2 。ERS“五谷（AFEX副总干事）。班纳吉等人的数据。 （2010C）。沿的酒吧上方的数字是在生物样品的总GLC％GLC产量。

图3。GENPLAT使用产生四个AFEX预处理DDG - GLC发布的商业酶制剂的优化混合物。 Multifect木聚糖酶的贡献最小（4％），因此，从这个三元相图省略。B.从AFEX DDG - GLC产量与在相同的条件下水解（15毫克/克葡聚糖酶，48小时，50℃）不同的酶处理。 “四组分商业”已确定的比例从如图所示的实验。 3A。

讨论

人们普遍认识到，降低酶的成本经济的木质纤维素乙醇产业的发展是很重要的。目前可用的商业酶鸡尾酒复杂不清的许多蛋白质​​（Nagendran等人，2009年）的混合物，他们主要是为适应酸预处理的玉米秸秆使用。为了加快发展更好的酶鸡尾酒，一些实验室已经开发出高通量平台，酶的发现和鉴定。在这方面的努力已纳入也发现在GENPLAT以下属性的一个或多个：配药机器人的酶和生物量的泥浆，统计，实验设计，和/或GLC自动化的决心和木糖（柏林等，2007;德克尔等。人，2009年;金等，1998; King等，2009）。 GENPLAT扩展这些早期的努力，最显著最多6个组件，可以从分析的复杂性，在酶的混合物早期的研究在我们的最新作品，以超过16（班纳吉等人，2010C）。 GENPLAT其它关键特性是珠混合室（桨水库）的使用，可以保持在配药暂停秸秆泥浆;温柔消化在年底高端旋转混合;和自动化比色法测定谷氨酸和木糖。

材料