使用光刺激神经元的负担得起的LED阵列

摘要

成人出生的神经元表达ChR2可以操纵片电生理的准备，以考察他们对嗅觉神经回路的功能的贡献。

摘要

标准片电已使研究人员能够探测单个细胞的电反应记录在电器或药理^操纵 1,2神经电路的各个组成部分。随着发明的方法，以光学控制基因有针对性的神经元（光遗传学），研究人员现在有一个前所未有的水平超过特定群体的神经元控制在标准片的准备。特别是，感光channelrhodopsin - 2（ChR2），使研究人员能够激活神经元^，光3,4。通过结合基于LED的标准切片电ChR2 photostimulation小心校准，我们能够更详细地探测成人出生interneurons的嗅球，嗅觉系统的第一个中央继电器的作用。使用病毒表达ChR2 - YFP专门在成人出生的神经元，我们可以选择性地控制在旧环境的年轻成年出生的神经元ð成熟的神经元。我们的光控，使用一个简单而廉价的LED系统，我们展示了如何该系统可以进行校准，以了解需要多少光线唤起扣球在单个神经元的活动。因此，简短的闪烁的蓝灯可以远程控制ChR2转新生细胞的放电模式。

研究方案

1。光学校正：测量LED电源

1. 将一个LED阵列积极冷却风扇，并加盖该LED /散热器aparatus一个准直透镜的散热片。
2. 在明照明用LED /散热片/风扇/镜头仪器的更换灯泡。本设备必须仔细定位，使平行的LED光束对聚光镜的光沿直线路径传播。确保散热片/风扇是正确的接地系统的共同点。
3. 电源，可以给当前的快速和方波驱动LED阵列。该电源可控制脉冲发生器产生一个5V TTL脉冲。
4. 中心沿之间的视场光阑和冷凝器的镜头定义光路的准直光束。理想的情况下，LED光束会稍微过量的全面开放的视场光阑。通常情况下，更紧密平行的LED光束会少填补这个光圈，会产生铁道部E电源牺牲的统一性。在我们的设置中，我们增加了选择准直透镜，预计其在consenser膜片的共轭平面略有扩大图像的LED阵列光均匀。
5. 实现由注重冷凝器，使视场光阑（最靠近光源的隔膜）的形象是集中对片室（ 图1）科勒照明。一个镜头纸薄组织可以作为投影屏幕，可视化集中在其他深度的视场光阑的图像。
6. 钻一系列已知直径在一个不透明的材料的针孔。放置的光学功率计传感器，这些小针孔。将功率计对试样阶段，中心的电能表集中的视场光阑，通过简单的移动功率计，直到它提供了最大读数的形象。张贴在这个位置上的功率计。
7. 完全打开光圈（aperature隔膜和视场光阑）。系统地将附片室/功率计，相对光学光路计算照射范围内的光功率的均匀性。构建你的系统的统一性情节。如果在显微镜正确设置与科勒照明目标的重点为中心，最大功率应直接下的目标，这一重点之外的地区，现在应该收到一个已知金额按均匀情节权力。
8. 对于每一个针孔大小，建立标准曲线的光功率与针孔表面积。通过调整输入电流LED阵列，产生这条曲线在多种功率级别，从每条曲线，计算出每平方毫米的电源。如果是用于修补光学LED阵列，确保引进修补必要的光学元件（冷凝器，针孔和过滤器）知道多少光线下修补照明传输。
9. 翻转功率计面对目标，在470nm的光照强度计算汞灯开启时。
10. 添加一个活切片室，重建标准曲线，以确定通过散射脑组织传输的光功率。

2。程序切片和电

A部分：切片制备

1. 麻醉（60毫克/公斤氯氨酮和甲苯噻嗪剂2mg/kg）和杀头的鼠标。解剖脑人工脑脊髓液（学联，MM：124 1.3 3氯化钾，氯化钠， _硫酸镁 ，26碳酸氢钠，1.25 NaHPO _4，20葡萄糖，氯化钙_{2〜310mOsm，pH}值7.4时的混合物起泡95％O2和5％CO ₂ ^5,1），注意不要损坏嗅球。琼脂分开的两个半球和地方，甚至一个边缘（水平段）的腹面。
2. 胶琼脂和每个皮质半球的背水面的vibratome夹头，慢慢填补，用冰冷学联的洗澡。腹面切片在300微米的部分，传输每个加热（34-36 ° C）节和含氧学联，使他们能够恢复30-45分钟。

B部分：松散的门槛补丁测量秒杀

3. 带来切片室温30分钟后，轻轻放置在显微镜下不断灌注含氧学联室录音室中分得一杯羹。
   EYFP - ChR2存在过分刺激ChR2感染神经元的风险，可以确认下epifluorescence（图2A）
4. 拉吸管拉马（萨特的P - 97）玻璃电极。该电极与学联填充。当学联浴尖阻力应介于7-10兆欧。
5. 在荧光灯照明，定位片与成熟形态健康ChR2 EYFP的神经元。同时定位下神经元的修补光学SOMA。
6. 随着光积极通过电极尖端的压力，降低对确定的荧光神经元的补丁电极。膜接触时，迅速释放出积极的压力，并申请通过尖端的吸量小而短暂的。一个千兆欧姆密封应质膜和补丁电极的墙壁之间。
7. GIGA密封即使没有形成，如果电极是足够接近一个荧光的神经元扣球活动应该产生一个可衡量的的局部领域的潜力。不同剂量的光闪烁激活ChR2在这个神经元。由于光剂量是两个LED电源和持续时间的函数，计算光线的多少，是必要的，以唤起动作电位在多个权力和持续时间（图2b）。此外观察扣球汞灯照明下发生多少。

3。代表性的成果：

在我们的显微镜（奥林巴斯BX51WI），我们的LED是我N线与2孔和一个聚光镜，从而保持了原有工厂安装的弧光灯的光路。通过关闭两个视场光阑和aperature隔膜，我们可以实现明对比足够的膜片钳记录（ 图1b）。所有隔膜完全打开，我们揭露切片channelrhodopsin激活（ 图1A）的最大光功率。在我们的显微镜，这个补丁配置产生的光密度约三个数量级，比最高的满场密度较低^（4.1μW/ 2毫米与^6.88毫瓦/平方毫米）。

一个成人出生的单ChR2 EYFP的表达粒细胞表明，我们看到强大的迁移在延髓的迁徙流（图2a）一个宽松的补丁录音神经母细胞的慢病毒感染后的标签成人出生的嗅球颗粒和periglomerular神经元周5毫秒的刺激在格言UM功率（6.88毫瓦/平方^毫米 ）足以唤起扣球（ 图2b）。由于细胞之间的表达水平的变化，通过的门槛秒杀的光量会有所不同，应为每个感兴趣的细胞类型的统计学描述。

图1。满场photostimulation和膜片钳切片电LED阵列设置。要激活channelrhodopsin（ChR2），我们通过打开背面的光圈和冷凝器光学（一）项目一个准直光束。此配置可完全关闭的视场光阑和调节视场光阑的宽度（b）改为高对比度的修补光学。缩写：A.，B.散热器风扇，C. LED阵列，D.准直透镜，E.镜，F.场光阑，G.光圈，H.聚光镜， 一 SAmple阶段，J.目标。

图2。膜片钳和整场photostimulation嗅球（一）一个300μm的水平切片图像。可以看出，从嗅球的核心辐射Lentivirally感染的成人出生的颗粒细胞表达ChR2 - EYFP。光剂量需要引起扣球可以通过增加LED闪光灯的持续时间（二）发现。这粒细胞的阈值是5ms的完整的LED亮度^（2.43mW/mm 2 ）。 （一）规模= 500微米，（B）= 50ms的规模。

讨论

近年来，人们在神经科学的研究⁶ optogenetic工具的普及爆炸。因此，它正变得越来越重要，希望开始使用这些新工具的实验室，以降低进入障碍。在这里，我们描述了如何进行一个简单和低成本的改造和传统的膜片钳钻机的校准，所以它可以做满场channelrhodopsin表达神经元光刺激。特别是，我们嗅球成年神经发生专门控制，新出生的神经元的研究应用此技术。

我们演示?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Imalgène 1000		100 mg/ml
Xylazine	Rompun		2%
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886	&nbps;
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
MgSO4	Sigma-Aldrich	M1880
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
NaHPO4	Sigma-Aldrich	S5011
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
CaCl2	Sigma-Aldrich	C7902
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Pipette Puller	Sutter Instrument Co.		P-97
Glass Capillaries	Harvard Apparatus	GC150T-10	1.5 mm O.D./1.17 mm I.D.
LED array	Bridgelux	BXRA-C2000
Collimating lens	Thorlabs Inc.	LEDC1	40 mm beam diameter
Power supply	A1W Electronik	HKO2800	2.8 amp
Optical power meter	Thorlabs Inc.	PM 100
Heatsink	Thermaltake	A1838	Silent Boost K8
Fan	Thermaltake	A1838	Silent Boost K8
Vibratome	Leica Microsystems	VT1200S