利用反向遗传学操作的裂谷热病毒MP - 12菌株，以提高疫苗的安全性和有效性的NSS基因

摘要

裂谷热病毒的MP - 12疫苗株反向遗传学系统是一个有用的工具，用于创建附加的MP - 12突变体具有更高的衰减性和免疫原性。我们描述了协议的产生和表征NSS突变株。

摘要

裂谷热病毒（RVFV），从而导致出血热，神经系统疾病，或在人类中的盲目性，以及高利率流产和反刍动物^的胎儿畸形1，已被列为作为HHS /美国农业部重叠选择代理和风险组3病原体。它属于在家庭Bunyaviridae属Phlebovirus，是这个家庭的最致命的成员之一。自2006年以来已开发的RVFV MP - 12疫苗株^2,3以及野生型RVFV ^4-6株，包括ZH548和ZH501，几个反向遗传学系统。 MP - 12株（这是一个危险群2病原体和非选择代理）是由几个突变，其M -和L段高度减毒，但仍带有剧毒分部的S ^- 3，其编码的RNA功能的毒力因素，NSS。 rMP12 C13type（C13type）进行帧删除NSS的ORF 69％缺乏所有已知的NSS功能，而它复制为efficient作为MP - 12在VeroE6细胞缺乏I型干扰素。 NSS包括干扰素（IFN）-βmRNA的^7,8诱导的转录主机关闭，并促进在翻译后水平降解双链RNA依赖的蛋白激酶^{（PKR）9,10} IFN -β转录干扰素调节因子3（IRF - 3），NF - kB和激活蛋白-1（AP - 1），IFN -β结合IFN-alpha/beta受体（IFNAR）上调刺激IFN -α的转录虽然IRF - 3，NF - kB和激活的基因或其他干扰素刺激基因^{（ISGs）11，}诱导宿主的抗病毒活性，而主机包括NSS IFN -β基因的转录抑制阻止病毒复制的基因upregulations这些ISGs蛋白1（AP - 1），可以通过RVFV7激活。 。因此，NSS是一个很好的的目标，以进一步削弱MP - 12，并取消IFN -β的抑制功能，以提高主机的先天免疫反应。这里，我们描述了产生重组MP - 12的编码突变NSS的协议，并提供一种检查方法，找出缺乏的功能，抑制IFN -βmRNA的合成NSS突变体的一个例子。除了 ​​其在先天免疫系统的重要作用，I型干扰素是重要的树突状细胞诱导适应性免疫^反应 12-14的成熟。因此，NSS突变体诱导I型干扰素的进一步减弱，但在同一时间在刺激宿主的免疫反应更有效率比野生型MP - 12，这使得它们接种疫苗的方法理想人选。

研究方案

1。 ²质粒DNA的重组的MP - 12编码NSS突变（S）的回收

1. 传播幼仓鼠肾（BHK）/ T7 - ¹⁵ 9细胞，稳定表达T7 RNA聚合酶，到6厘米的菜最起码的基本介质中（MEM）-α（Invitrogen公司，CAT＃32561037），含10％胎牛血清（ FBS ），青霉素，链霉素（青霉素100 U /毫升，链霉素100微克/毫升）（Invitrogen公司，CAT＃15140122），和600微克/ ml的潮霉素B（Cellgro，猫＃30 - 240 - CR）。
   *病毒回收效率在6厘米的菜高出35 mm培养皿中。 BHK/T7-9细胞，通过水平低的支持率较高的恢复。另外，其他的BHK细胞株稳定表达T7 RNA聚合酶可以使用^4,5,16,17。
2. 当细胞达到70％-80％汇合，更换培养上清用新鲜的含10％胎牛血清和青霉素，链霉素（不含有潮霉素B）的MEM -α。
   
   *细胞应该是transfected内1小时后更换介质，以避免损失的T7 RNA聚合酶表达。
3. 对于RVFV，编码病毒基因组RNA的全长的病毒RNA表达质粒，恢复和病毒基因的开放阅读框，编码病毒蛋白表达（ 图1和2）第二组是必需的。准备在1.5毫升管以下plasmids2（ 图2）的混合物：
   1. pProT7 - S与NSS基因突变（2毫克）（S）（+）：这种质粒编码的抗病毒感（正面意义）全长RVFV MP - 12的S段两侧由T7启动子和丁型肝炎病毒（HDV）核酶序列。
   2. pProT7 - M（+）（2毫克）：这种质粒编码的抗病毒感（积极意义）全长RVFV MP - 12米段两侧由T7启动子和HDV核酶序列。
   3. pProT7 - L（+）（2毫克）：这种质粒编码的抗病毒感（积极的意义上）全长RVFV MP - 12 L型段FLAnked由T7启动子和HDV核酶序列。
   4. PT7 - IRES - VN（2毫克）：这种质粒编码的RVFV MP - 12 N打开阅读框（ORF），T7启动子和脑心肌炎病毒（EMCV）内部核糖体进入位点（IRES）的下游。
   5. PT7 - IRES - VL（1毫克）：这种质粒编码的RVFV MP - 12大号的ORF下游的T7启动子和EMCV IRES的。
   6. pCAGGS - VG（1毫克）：这种质粒编码RVFV MP - 12的M ORF的鸡β-肌动蛋白启动子的下游。
      PT7 - IRES - VN，PT7 - IRES - VL和pCAGGS - VG此外没有恢复MP - 12所必需的，但它增强了^救援效率2。作者通过PT7 - IRES质粒，可能是由于缺乏核糖体AUGs漏水扫描经历GN / GC不善表达。因此，我们构建了第依赖GN / GC表达pCAGGS - VG。
      
      
4. 添加30毫升过境LT1（Mirus，CAT＃MIR2300）385毫升OPTI - MEM（InvitrogeN，CAT＃31985070）在1.5 ml管，涡简要。
5. 在室温下5分钟孵化后，慢慢加入OPTI - MEM包含从步骤1.3脂质体的质粒混合，混合轻轻吹打，并培育在室温为15分钟。
6. 步骤1.2一滴一滴地（ 图3）BHK/T7-9细胞的培养基中添加脂质体和质粒混合物。
7. 在孵化器孵育转染细胞在37 ° _C，5％CO 2 24小时，并更换培养上清新鲜MEM -α含10％胎牛血清和青霉素，链霉素（不含有潮霉素B ）。
8. 细胞在37 °的孵化器中的C与_5％CO 2为4天（共5天孵化），并收集到15毫升管培养上清液。
   
   *这里观察细胞病变效应（CPE），并不一定反映病毒成功复苏的结果，因为转诱导细胞死亡，出现类似病毒RNA复制或病毒蛋白的合成引起的CPE。
9. 在4 ° C 5分钟，在2200 XG离心的上清液。
   
   *这一步的目的是沉淀下来的细胞碎片病毒股票。气溶胶紧离心桶建议以提高安全性。
10. 转移到螺丝帽的5毫升cryotubes的上清液，存储通道0（P0），于-80 ° C为进一步利用病毒的股票。

2。扩增病毒的P0

1. 在P0样品往往含有病毒滴度不足²下游实验。在VeroE6细胞扩增步骤，这是一个克隆的非洲绿猴肾细胞（VERO）缺乏IFN-alpha/beta基因^18,19，增加病毒滴度最高水平。另外，其他细胞缺乏IFNAR1敲除小鼠²¹ migh如²⁰ Hec1B细胞或MEF细胞类型，我干扰素反应T是用于这一步。蔓延到贝科的修改最低必不可少的培养基（DMEM）（Invitrogen公司，CAT＃11965092）10厘米含10％胎牛血清菜VeroE6细胞，青霉素，链霉素（青霉素：100单位/毫升，链霉素：100毫克/毫升），和孵化在37 ° C孵化器与5％的CO _2，直到他们达到80％汇合。
   *重组MP - 12菌株编码突变NSS往往不能有效的I型干扰素主管细胞复制。
2. 2.7毫升10％胎牛血清和青霉素链霉素的DMEM混合300毫升的P0样本。删除步骤2.1 VeroE6细胞培养基和稀释P0样品更换。在37 ° C的一个孵化1小时_，5％CO2孵育。
3. 取出接种10毫升的DMEM添加10％胎牛血清和青霉素链霉素每道菜。
4. 在37 ° C孵育3〜4天，直到VeroE6细胞CPE明显。
   *单层中断期间发生的MP - 12感染，whilË重组MP - 12缺乏NSS如rMP12 C13type（C13type）（ 图4），不破坏单 ​​层，但浮动细胞死亡人数出现在感染后2至3天。
5. 收获上清，在3至4 DPI节1.9）和1.10所述），并指定为E6P1样品。

3。滴定斑块检测重组MP - 12

1. VeroE6细胞扩散到6孔板。
   *每个样品的重复分析比单个分析更可靠。
2. 当VeroE6细胞生长至80％汇合，准备与10％FBS和10-6青霉素链霉素的DMEM 10倍系列稀释的病毒样本如下：
   
   • 10μL的样品E6P1 + 990毫升，用10％胎牛血清和青霉素链霉素的^DMEM（10-2稀释）
   • 10 ^-2样品100μL+ 900毫升的DMEM与10％胎牛血清和青霉素，链霉素（10 ^-3稀释）
   • 100μL的10 ^-3样品+ 900毫升的DMEM与10％胎牛血清和青霉素，链霉素（10 ^-4稀释）
   • ^10-4样本100μL+ 900毫升与10％胎牛血清和青霉素链霉素的DMEM（10-5稀释）
3. 吸步骤3.1 6孔板中并添加每个稀释液（步骤3.2），400入井（ 图3） 。
4. 在37 ° C的一个孵化1小时_，5％CO2孵育。
5. 在潜伏期，准备如下的琼脂覆盖两个15毫升管：
   管（保持在42℃水浴）：7毫升1.2％的崇高琼脂水（VWR，猫＃101170-362）
   管B（保持在37℃水浴）：7毫升改良Eagle培养基（MEM 2X）（Invitrogen公司，CAT＃11935046），含10％胎牛血清，青霉素，链霉素（青霉素100 U /毫升，链霉素100微克/毫升），和10％Tryptose磷酸盐肉汤（MP生物医学，CAT＃1682149）。
6. 孵育1 h后，删除病毒接种，并立即加入2毫升，每口井的管和管B（步骤3.5）1:1混合。
   *小心添加覆盖，立即干燥井导致未受感染的细胞死亡。
7. 板块与5％的CO ₂孵育3天的孵化器在37 ° C。
8. 准备管和管B再次在步骤3.5中所述。还准备500微升0.33％中性红的解决方案，每盘这也是保持在37℃水浴（西格玛Aldrich公司，CAT＃N2889 - 100ML）。
9. 混合管，管B和中性红溶液500毫升（终浓度为0.011％），加2毫升每口井的混合物。
   *要添加的中性红溶液的量的变化很多中性红溶液，是必需的初步优化。 0.33％中性红溶液长期储存会导致沉淀。在这种情况下，可完全溶解沉淀，孵育在55 ° C为10分钟剧烈摇晃。使用沉淀中性ř弱阳性细胞ED解决方案的结果，而重新溶解中性红溶液污渍细胞以及。
10. 板孵育16小时（或过夜）37 ° C的一个孵化器5％的CO _2。
11. 统计斑块的数量，以及其中包含的10％到100％以及斑块。计算斑块的形成单位/ ml。例如，如果我们观察接种^10-5稀释，28（＃斑块）×（1 ml/0.4毫升）× 10 ^5（稀释）= 7.0 × 10 ⁶斑形成单位（PFU）的井28斑块/毫升（ 图5）。

4。 NSS突变体的筛选缺乏I型干扰素抑制功能

1. 传播C57/WT MEF细胞（InvivoGen，CAT＃MEF - c57wt），编码一种分泌胚胎碱性磷酸酶（SEAP）基因诱导的NF - kB和IRF - 3 / 7（ 图6），到12孔板。 DMEM培养细胞均保持在10％胎牛血清，青霉素，链霉素（Penicillin：100单位/毫升，链霉素100微克/毫升），稻瘟素S（3毫克/毫升），和Zeocin（100微克/毫升）。
2. 当细胞成为融合（80％），细胞模拟感染或感染与MP - 12或重组MP - 12编码的多重感染（MOI）3或0.1（见第2和第3，金额NSS突变每接种300μL）。在感染后1小时，取出接种，并添加1毫升含10％胎牛血清，青霉素，链霉素（青霉素100 U /毫升，链霉素100微克/毫升）每口井的DMEM（稻瘟素和Zeocin不添加在这个时间）。
3. 在感染后14小时，收集培养上清。添加200μL定量蓝（InvivoGen，猫＃REP - QB1），每个样品50μL（一式三份），一个96孔板井。密封板在37 ° C孵育1小时
   * MP - 12和重组的MP - 12缺乏NSS清楚地诱导主机包括293细胞，MRC - 5细胞和鼠标embr IFN-alpha/beta胜任细胞的翻译抑制yonic成纤维细胞（MEF）的14个小时后，在高MOI感染后的细胞。另一方面，IFN -βmRNA或ISG56 mRNA的大量积累在7至8小时后感染的类型，我干扰素胜任细胞。因此，我们选择了感染14小时后收集上清，看到的先天免疫反应诱导SEAP的积累。
4. 阅读使用酶标仪（ 图7）在650 nm处的OD值。
   *北使用特定的鼠标ISG56基因ISG56 NSS表达的情况下（ 图 8）的mRNA的上调，这表明RNA探针的杂交获得的数据相一致的结果。
   应该指出，SEAP的活动是由丰富的蛋白质可以通过主机翻译活动的影响。的mRNA水平的提高相比，一个SEAP的相对水平可能不高，因为SEAP不能SEAP基因的存在，即使在合成细胞翻译suppressed。 Northern杂交是一种更直接的检测和更准确地评估在感染的细胞比SEAP报告基因检测NSS功能的缺乏引起的mRNA量。然而，SEAP报告系统比Northern杂交更迅速，因此NSS可能缺乏主机转录抑制功能的突变体的快速筛选有用。
   
   

5。代表性的成果：

反向遗传学系统不断生成可行的重组MP - 12病毒滴度大于1 × 10 ⁶ PFU / ml的高。 C13type病毒缺乏NSS的功能形成了大量的混浊斑，而MP - 12明确斑块形成^各种大小的2（图5）。模拟感染C57/WT MEF细胞或MP - 12的感染者并没有增加SEAP的水平相比，模拟病毒感染的细胞培养上清，而与C13type C57/WT MEF的感染细胞的培养上清中增加SEAP的水平，14小时后感染（HPI）（图7）。这些结果与北使用特定的鼠标ISG56 mRNA表达（图8）RNA探针的杂交获得的一致。

图1。RVFV的基因组结构
RVFV有三方负感或ambisense RNA基因组命名为S，M -和L -段。分部的S - N和NSS基因编码ambisense方式。从病毒感（负义）段的S - ñ mRNA的合成，而mRNA是合成抗病毒感（积极意义）分部的S - NSS。分部的M -编码一个M mRNA和合成5'region他们合作翻译裂解^22,23 M的mRNA的几个AUGs漏水扫描the78kD，NSM，GN或GC蛋白。分部L - L蛋白编码。 N和L蛋白是病毒的转录和复制所必需的，而Gn和GC病毒包膜蛋白。 NSS和NSM蛋白非结构蛋白，这是不纳入到病毒颗粒。

图2。质粒DNA重组RVFV MP - 12菌株的恢复设计
全长cDNA的反病毒检测的S，M或L段cloneddownstream T7启动子和丁型肝炎病毒（HDV）上游核酶序列，指定为pProT7 - S（+），pProT7 - M （+）或pProT7 - L（+）分别为^2。 BHK/T7-9细胞中表达T7 RNA聚合酶转录的RNA编码全长S，M，或精确的基因组3'末端L型部分。 N或L蛋白的开放阅读框（ORF）克隆脑心肌炎病毒（EMCV）内部核糖体进入位点（IRES），这是PT7 - IRES - VN或PT7 - IRES - VL，分别指定，允许不封顶T7 RNA转录在限额，独立的核糖体被认可凹痕的方式。的M的ORF克隆下鸡β-肌动蛋白pCAGGS质粒^24，这是pCAGGS - VG指定的推动者，让78kD的合成，NSM，Gn和GC蛋白，这是从不同AUGs产生^漏水扫描23。 N和L蛋白启动转录或RNA的复制，而PT7 - IRES - VN和PT7 - IRES - VL没有必要重组的MP - 12 ²的恢复，可能是由于presumable的渗漏表达POL二，驱动皑皑的RNA转录编码的N - ORF和L - ORF的pProT7 - S（+）和pProT7 - L（+），分别。

图3 RVFV MP - 12质粒DNA的回收 。
pProT7 - S（+），pProT7 - M（+）pProT7 - L（+），PT7 - IRES - VN，PT7 - IRES - VL和pCAGGS - VG质粒（图BHK/T7-9细胞转染）生成传染性重组RVFV MP - 12培养上清中的应变第在5天的后转上清收集，到新鲜VERO E6细胞病毒扩增传代。通常情况下，超过1 × 10 ⁶ PFU / ml的病毒在感染后3〜4天可以恢复。扩增的病毒（E6P1病毒）滴定使用Vero E6细胞斑块检测和表型分析和免疫原性研究。

图4段的S - MP - 12和rMP12 - C13type
MP - 12的比较和rMP12 C13type（C13type）的S -段。 C13type NSS的ORF与MP - 12菌株NSS相比，被截断了69％，是相同的自然隔离克隆13 ^株 2,25 。

图5牌匾MP - 12（功能NSS）和C13type（非功能NSS）检测。
单层的Vero Ë6细胞在6孔板是用于检测斑块。经过3天用0.6％的琼脂覆盖，第二琼脂覆盖含有中性红溶液孵化的是。然后，感染后第4天计算斑块。 MP - 12的形式明确不同大小的斑块，而C13type形式大混浊斑块（或灶）。以及10至100斑块应用于计数。

图6的分泌型碱性磷酸酶（SEAP）记者在C57/WT MEF细胞的基因激活途径
干扰素-β启动子包括AP - 1，NF - kB和IRF - 3的结合序列。 RVFV复制激活AP - 1，NF - kB和IRF - 3 ^7,11。然而，抑制IFN -β启动NSS释放阻遏复杂，即使在这些转录因子的结合，从而抑制IFN ^-βmRNA的26的合成。此外，NSS隔绝TFIIH P44 subunits8和LSO促进TFIIH P62亚基²⁷的降解，从而诱导普通主机的转录抑制，包括IFN -α基因和基因ISRE子下。 IFN -β的抑制功能的C13type或其他缺乏NSS突变体诱导IFN -β的合成，这反过来又激活IFN -α启动子和干扰素敏感反应元件（ISRE）发起人。 IRF - 7，然后IFN-alpha/beta刺激和支持IRF - 3 ^28,29的进一步上调IFN -α转录上调。在这个实验中，C57/WT MEF细胞分泌碱性磷酸酶（SEAP）编码在一个人工NF - kB的，IRF - 3和IRF - 7的结合序列下游。因此，NSS突变体，缺乏IFN -β的抑制功能上调SEAP的分泌，然后测量。

图7由C13type SEAP的感应。
C57/WT MEF细胞（InvivoGen）分别模拟感染或感染与MP - 12或rMP12 C13type（C13type）3（左侧面板）或0.01（右图）MOI。培养上清14 HPI（50μL）与200μL定量蓝（InvivoGen）在96孔板和650 nm处的OD值基板混合后测定1 h后在37 °彗星由酶标仪。 SEAP的模拟病毒感染的细胞相对增加。这些数据代表的平均+ / - 3次独立实验的标准偏差。从C13type感染的细胞培养上清显示SEAP的增加，表明主机转录抑制NSS缺乏。

与高辛标记的RNA探针Northern杂交图8。
野生型小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的模拟感染或感染与MP - 12或rMP12 C13type（C13type）MOI 3。总RNA用Trizol（Invitrogen公司），和北b 7 HPI大量使用地高辛标记的RNA探针的具体小鼠内源性ISG56 mRNA或MP - 12 N基因/抗病毒检测的S ^段 2,30 。为了使小鼠内源性ISG56 mRNA或RVFV ñ基因/抗病毒检测的S段的探针，引物的PCR扩增片段KpnmISG56F（GGG TGG TAC总部大楼台泥法案TTC AGA海合会TTC GCA AAG CAG）和HindmISG56 （TAC AAA级GCT达GGG AGA GAA TGC TGA TGG TGA文建会GG）为ISG56 mRNA或KpnNF（AGT TGG TAC猫GGA民航局注册税务师TCA AGA GCT TGC摹）和HindNR RVFV（GGG民航局GCT TTT AGG CTG C​​TG的大老山隧道的TGT AAG） ñ基因/抗病毒检测的S段消化用 KpnⅠ 和 HindⅢ，结扎成pSPT18质粒（Roche.然后RNA与地高辛标记的探针合成，使用辛RNA标记试剂盒（SP6/T7）（罗氏猫＃1 175 025），每个样品的28S rRNA的水平也显示装载控制。野生型MEF的C13type诱导ISG56 mRNA合成受感染的细胞，而那些与MP感染-12没有诱导，暗示缺乏主机在C13type感染细胞的转录抑制。图6 SEAP检测所获得的数据是一致。

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讨论

为RVFV反向遗传学系统已经开发了几个小组利用T7启动子^2,4,5或鼠标³人⁴ POL -我子。在这个手稿中，我们描述了一个协议， ^使用15个稳定表达T7 RNA聚合酶BHK/T7-9细胞产生重组RVFV MP - 12菌株。不同的病毒回收效率取决于BHK/T7-9细胞的条件，质粒量，转染细胞和数量等。我们总是放大的P0病毒在Vero E6细胞，获得高滴度实验的病毒储存。 I型干扰素主管的细胞，如人肺二倍体?...

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材料

试剂名称	公司	目录编号	评论（可选）
最低限度的基本培养基（MEM -α）	Invitrogen公司	32561037
贝科的修改最低限度的基本培养基	Invitrogen公司	11965092
改良Eagle培养基（MEM 2X）	Invitrogen公司	11935046
青霉素链霉素	Invitrogen公司	15140122
潮霉素B	Cellgro	30 - 240 - CR
Tryptose磷酸盐肉汤	MP生物医学	1682149
高贵的琼脂	VWR	101170-362
中转- LT1	Mirus	MIR2300
OPTI - MEM	Invitrogen公司	31985070
气溶胶紧盖子	Eppendorf公司	C - 2223 - 25
0.33％的中性红溶液	西格玛爱秩序	N2889 - 100ML
C57/WT MEF细胞	InvivoGen	MEF - c57wt
稻瘟素小号	InvivoGen	ANT - BL - 1
Zeocin	InvivoGen	ANT - ZN - 1
定量蓝	InvivoGen	REP - QB1
BHK/T7-9细胞15	日本岐阜大学，
Vero E6细胞	ATCC	CRL - 1586