Ferumoxytol，一个FDA批准的氧化铁纳米粒子标记干细胞

摘要

我们描述一个标签和跟踪与FDA批准的，超顺磁性氧化铁（SPIO），ferumoxytol（Feraheme）的干细胞的技术。这种细胞成像技术，利用磁共振（MR）成像的可视化，易于成功或不成功的患者干细胞engraftments的长期监测和诊断。

摘要

干细胞为基础的疗法提供了显著的再生医学领域潜力。然而，仍有许多工作需要了解有关在体内移植的细胞动力学。一种非侵入性的方法来重复监视体内移植的干细胞，将允许调查人员直接监控干细胞移植，并确定成功或不成功的植入结果。

广泛的干细胞仍然是无数的应用研究。此协议侧重于3种不同的干细胞群：人胚肾293（HEK293）细胞，人骨髓间充质干细胞（HMSC）和诱导多能干细胞（iPS）细胞。 HEK 293细胞来自人类胚胎肾细​​胞在培养与剪切的腺病毒5 DNA。这些细胞被广泛用于研究，因为它们很容易培养，生长迅速，而且很容易转。成人骨髓中发现的hMSCs。这些细胞的CAn是未分化的细胞复制，同时保持多能或潜在的分化成的细胞命运的数量有限。的hMSCs可以分化为间充质组织，包括成骨细胞，脂肪细胞，软骨，肌腱，肌肉，骨髓基质谱系。 iPS细胞的基因重新编​​程成年细胞已被修改，以表达基因和类似胚胎干细胞的定义属性的因素。这些细胞是多能干细胞的意义，他们有能力分化成^所有细胞谱系1。双方的hMSCs和iPS细胞已经证明体内组织的再生能力。

磁共振（MR）成像与超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒细胞标签的使用已被证明有效的，在体内的干细胞，由于附近的显微解剖决议跟踪，更长的血液半衰期，允许纵向成像和高灵敏度Ÿ纳米粒子的超顺磁性氧化铁MR成像提供细胞检测^2-4。此外，SPIOs使用MR成像是临床上的翻译。与右旋糖酐，carboxydextran或淀粉表面涂层服务包含从血浆成分的生物活性铁芯的氧化铁核心组成SPIOs。这些代理商创造局部磁场的不均匀性，导致一个下降T2加权MR图像⁵信号。不幸的是，SPIOs不再生产。第二代超小型SPIOs（USPIO），但是，提供一个可行的选择。 Ferumoxytol（FerahemeTM）是一种非化学计量的磁铁矿由缩合葡萄糖山梨醇carboxymethylether大衣包围的核心组成之一USPIO。 ferumoxytol胶体，粒径17-30纳米光散射确定。分子量为750 kDa的，2T磁共振成像领域的弛豫常数为58.609毫米1秒1的^实力 4 。 Ferumoxytol最近被FDA批准一个是一个在与肾功能衰竭⁶患者的补铁治疗缺铁。本集团已应用在“关闭标签”细胞标记应用程序的使用此代理。我们的技术演示ferumoxytol显著MR MR图像标记细胞信号的影响，导致干细胞的有效标签。这种技术可应用于非侵入性的干细胞疗法在临床前和临床设置监测。

研究方案

1。第1天

1）板细胞

1. 板HMSC T75烧瓶在一个汇合的80％至少18-24小时前标签。备用船只的指令，请参考表1。

2。第2天

2）准备标签的解决方案。这种准备将标签一（1）T75烧瓶中铁400微克/毫升的浓度在80％汇合。备用船只的指令，请参考表1。

1. 创建一个解决方案（解决方案1），1毫升的无血清培养基和93.1μLferumoxytol（股票：30毫克/毫升）混合在15毫升的锥形管。
2. 混合1毫升的无血清培养基和7μL硫酸鱼精蛋白（股票：10毫克/毫升）创建一个第二的解决方案（解决方案2）在第二个15毫升的锥形管。
3. 让每一个解决方案，休息5分钟。
4. 添加解决方案1和2在一起。轻轻地混合新的标签解决方案。允许休息5分钟的解决方案，允许USPIO - PRO组胺硫酸盐复合物形成。
5. 加入5毫升的无血清培养基超顺磁性氧化铁/最终成交量为7毫升的硫酸鱼精蛋白溶液混合2毫升。

3）准备为标签的细胞

1. 从细胞吸媒体。
2. 轻轻地用2-3毫升预热毫克/无钙的D - PBS或无血清培养基细胞一次，冲洗残留血清蛋白和其他媒体，或组件可能损害造影剂的吸收和标记效率。吸出的冲洗液。

4）标签细胞

1. 添加完整的标签解决方案，以细胞7毫升。
2. 进入孵化器（37 ° C / 5％的CO _2），并允许细胞在4个小时的标签解决方案孵化细胞。
3. 加入700μL的FCS细胞的标签解决方案，最终实现10％的血药浓度。血清添加重新建立丰富的环境，其中的细胞是习惯于，并协助在MInimizing细胞死亡的突然转变，可能会导致24小时暴露在无血清的环境。
4. 允许细胞孵育一个额外的20小时内的标签解决方案。

3。第3天

5）准备标记细胞

1. 吸从细胞的标签解决方案。
2. 用2-3毫升预热镁/钙免费的D - PBS轻轻冲洗细胞。吸出的PBS。重要的是要使用的Mg / Ca无PBS Mg和Ca将损害在下一步的胰蛋白酶的效率。
3. 加入2毫升预热的0.05％胰蛋白酶的细胞，来回倾斜烧瓶，烧瓶中，以确保整个表面覆盖着一层薄薄的胰蛋白酶。放置在培养箱（37 ° C / 5％的CO _2）的细胞，让细胞休息5-7分钟，或，直到细胞开始脱离板块。可能有必要在显微镜下确认支队。轻轻拍打的容量瓶中的双方，如果有必要发cilitate细胞表面脱离。
4. 预热完整的媒体加入4毫升的容量瓶中的胰蛋白酶。轻轻吹打胰蛋白酶/媒体/细胞溶液上下几次冲洗烧瓶。收集在15毫升的锥形管的整个解决方案。离心5分钟，在400离心力的电池解决方案。
5. 小心吸上清，而不会干扰细胞沉淀的。媒体5毫升（含药血清或无血清）重悬细胞。离心5分钟，在400离心力的电池解决方案。
6. 重复步骤5.5中所描述的细胞洗。在总额中，细胞会被冲洗三次，以消除媒体和细胞表面上的残留，无造影剂。
7. 细胞计数在这一点上达到最准确的细胞计数，细胞将失去在以前的洗衣机。执行细胞的活力测试。现在准备后续分析，或实验应用细胞。可以进行磁共振成像T1 - W T2 - W参数，因为虽然ferumoxytol是T2 - W的造影剂，ferumoxytol也表现出T1的效果。代表T2 - W MRI，可用于图像ferumoxytol标记细胞的参数包括：法兰克福或SE_Multislice 2000-2500 MS和TE 60-80毫秒的TR序列。要获得一个T1 - W的形象，降低TE值或一个FSE SE_Multislice序列或使用一个GRE序列具有较高的TR和低的TE。图4演示了标记干细胞成像在体内的应用潜力。

4。代表性的成果：

标记细胞表现出显著变暗或负上T2加权MR图像的对比效果和对T1加权磁共振图像增亮或阳性对比效果（图2）。纵向磁共振成像和可行性测试后的标签进行了5天没有表现出显着的MR信号，并没有显著的可行性的影响相比，无标签控制（数据未显示）。

jove_content“>标记的干细胞随后可以分化成各种细胞类型或静脉注射注入体内调查。

图1。时间线，ferumoxytol氧化铁纳米粒子标记干细胞的示意图。

图2。MR图像矢状截面thrrough的Eppendorf管细胞在细胞沉淀。一）未标记的控制。 B）标记的细胞表现出显著的T2或T2加权FSE或阴性造影剂效果SE_Multislice成像和T1或T1加权GRE序列的阳性对照剂的作用。

跨矢状Eppendorf管中的部分细胞PEL 细胞图3 。让。通过T2 - W磁共振成像可检测低至万ferumoxytol标记细胞。

图4。议员可视化ferumoxytol标记的干细胞注入小鼠脑室。 a）轴向，没有USPIO标记的干细胞注入小鼠barin MR图像。二）轴向，C）冠状，和D）矢状位磁共振图像描绘USPIO标记的干细胞在小鼠的大脑注入（白色箭头）T2，消极的对比效果。

表1。标签替代血管细胞的数量adaptions 。

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讨论

提高疗效的干细胞engraftments是再生医学的进步是至关重要的。一个在体内的干细胞的非侵入性可视化技术，大大增强了我们的理解能力成功植入成果的机制，导致。磁性标签的议员，如我们已经证明过程的可视化，可在体内的干细胞与磁共振成像跟踪。以前的磁标记干细胞被移植到靶组织，已可视化与磁共振^成像 7周。长期的标签和纵向成像是可能的， ^因为 8的氧化?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论（可选）
D - MEM高糖	西格玛	D5648	或其他所需的干细胞系用于基础培养基
D - PBS（ 钙离子，镁+免费）	GIBCO公司	14190-144
胰蛋白酶EDTA 0.05％	Invitrogen公司	25300-120
胎牛血清（FBS）	Hyclone公司	SH30071.03
Ferumoxytol （Feraheme）	AMAG	59338-0775-​​01
硫酸鱼精蛋白	APP的医药。	22930