转换到一个点阵仪XMAP含量，使用多重抗体筛查方法的捕获ELISA

摘要

ELISA方法可以很容易地转换到一个点阵仪XMAP法，通过复用，几种抗体的好处，可以同时进行筛选，以确定最佳的抗体对，导致更高的灵敏度和动态范围，同时降低检测成本。

摘要

酶联免疫吸附试验（ELISA）长期以来的利益为生命科学研究和临床诊断的生物样品的分析物检测的主要工具。然而，酶联免疫吸附试验有其局限性。它通常在96孔板，井都涂有捕获抗体，需要的样本量相对较大，捕获抗原的利益。表面积大井和捕获抗体的疏水约束力，也可以导致非特异性结合和增加的背景。此外，大多数的ELISA依靠酶介导的信号放大，以达到合理的灵敏度。这种放大是不总是线性的和可倾斜的结果。

在过去的15年中，出现了一种新的技术，提供了酶联免疫吸附试验的好处，但也实现更高的吞吐量，增加灵活性，减少样本量，降低成本，具有类似禾rkflow ^1，2。 Luminex液相xMAP技术是1（珠）微阵列平台，使双方monoplex和复用，可应用于蛋白质和核酸的应用^3-5检测。珠捕获抗体共价固定在一个较小的表面积，需要较少的捕获抗体和样本量较小，比较酶联免疫吸附试验，非特异性结合是显著减少。与限制样品，如脑脊液，滑液等^6个工作时，较小的样本量是重要的。复检测，进一步降低样本量的要求，使多个结果，从一个单一的样本。

最近由点阵仪的改进包括：新MAGPIX系统，体积更小，更便宜，更易于使用分析仪;低浓度MagPlex磁性微球的消除需要昂贵的过滤板，来更好的检测方法开发适合的工作浓度和低吞吐量应用; XMAP抗体偶联（ABC）的工具包，其中包括一项协议，试剂，消耗品耦合珠捕获抗体的利益所必需的。 （见材料第一个包内容的详细清单。）

在这个实验中，我们的XMAP平台转换为TNF-α的细胞因子的预优化的酶联免疫吸附试验和比较两种方法的性能^7-11。 TNF-α是一种生物标志物用于测量与自身免疫性疾病患者的炎症反应。

我们开始由四个不同的微套或地区耦合四个候选人捕获抗体。当混合在一起，这四套允许有四个单独的抗体检测方法的所有四名候选人，以确定最佳的抗体对，节省试剂，样品和时间同步测试。 ，两个XMAP检测构建两个最优化的抗体对他们的表现相比原ELISA法检测到的信号强度，动态范围和灵敏度方面。

研究方案

一，试剂准备

1. 抗体的选择和制备
   1. 确定要在实验中使用的抗体。
      1. 四捕获抗体：人肿瘤坏死因子-α单克隆或多克隆具体;所有相同的宿主物种。
      2. 四个抗体检测方法：具体的人肿瘤坏死因子-α或者未修改，生物素，或PE标记。
      3. 一个确认抗体：PE标记的和具体的捕获抗体的宿主物种。
   2. 重组抗体的制造商建议的工作浓度。
   3. 低浓度MagPlex微球（珠）套或地区选择四个小瓶，例如，Luminex液相部分号码MC10012-ID，MC10013-ID，MC10014编号，MC10015-ID。
2. 耦合的抗体MagPlex微，使用的XMAP抗体（ABC）耦合套件
   重新FER到完整的耦合过程（＃89-00002-00-319）ABC试剂盒的用户手册。 （注：光敏微球应避光尽可能。）
   1. 带来的ABC试剂盒的试剂室温和偶联反应珠地区选择的数字标签4个反应管。 MagPlex珠4瓶（1毫升或2.5×10 ⁶珠）的内容转移到四个标记的反应管。
   2. 珠集清洗两次激活缓冲区，如ABC试剂盒说明书所述，在500μL。
   3. 激活每个珠子集激活的缓冲区，磺酸基NHS的10μL，10μL的EDC试剂480μL，按ABC试剂盒说明书的步骤，并孵育20分钟。 （注：EDC的试剂必须在250μL激活缓冲区，立即到这一步之前重组。）
   4. 与现在的“激活”微重复以前的洗涤步骤共苏氨酸500μL激活缓冲区EE倍，ABC试剂盒说明书中所述。
   5. 准备四个单独的解决方案，每片含7.5微克捕获抗体激活缓冲区（即3微克/万微）。
   6. 这四个捕获抗体解决方案添加到各自的反应管，涡每个试管，立即和孵化上肩的两个小时。
   7. 现在“耦合”微球的3倍，ABC试剂盒附带的洗涤缓冲液500μL总重复以前的清洗步骤。
   8. 最后的洗涤步骤后，每个反应管中加入500μL洗涤缓冲提供了500万每毫升抗体偶联珠最后的股票集中。涡和超声反应管分散微球。
      注：部分淹没在充满纯水超声波清洗机的封闭微小瓶提供有效的超声所有洗涤步骤。 （见电子材料表quipment细节。）
   9. 加上珠储存在2-8℃，避光，直到需要。
3. 枚举的耦合微
   1. 计算微球的耦合采用细胞计数或血球的反应后恢复。这样做适当的指导，参考计数仪的用户手册。从偶联反应的复苏通常是90％以上。
4. 耦合确认
   1. 确认偶联反应是准备为每套测试解决方案，加上珠股票成功，缓冲液中的最后100珠/μL的浓度（以1％BSA的PBS）。准备在4微克/毫升缓冲液稀释藻红蛋白（PE - ）标记的抗种抗体确认抗体。
   2. 分装50μL，每到一个圆底，96孔板，共16口井，四口井的测试解决方案。然后加入50μ成井8 L的缓冲液，来衡量的背景下，与50μL稀释后确认抗体成八其余井。
   3. 移液器多通道移液器上下几次，轻轻搅拌反应。覆盖板，板振动筛上30分钟，在室温下孵育。
   4. 为1-2分钟的解决方案，绘制出的珠子放在一个磁板分隔板。然后，取出液体有力反相板，而分隔，多浪费插座。
   5. 洗每个两次加入100μL检测缓冲和消除上清从盘使用磁板分隔在一个类似的时尚。
   6. 重悬于100μL检测缓冲液中轻轻吹打向上和向下的五倍多通道移液器珠。
   7. 1点阵仪XMAP仪器，如MAGPIX仪器，分析。这种反应的荧光信号的强度是directlŸ比例的金额上的珠子表面的蛋白质，加上珠蛋白相对量提供了一个快速评估。
5. 耦合生物素未修改抗体检测
   1. 如果使用未修改的检测抗体，这些抗体与赛默飞世尔EZ-LINK磺酸基NHS-LC-生物素试剂（货号PI-21335）和包装说明书中所述的程序biotinylate。一旦生物素，可以在以后被标记的抗体检测方法，使他们可以与XMAP分析仪检测与链霉亲和素，藻红蛋白检测（SA聚乙烯）（步骤三.6。）。

二。试验设置

1. 10μL每增加1％的牛血清白蛋白（缓冲液。请参阅材料表），以确定哪些是最有效的与XMAP检测到0.96毫升的PBS准备的所有四个珠集的初始混合物。
2. DIL的准备检测抗体解决方案uting每1微克/毫升缓冲液。
3. 准备于2000皮克/毫升缓冲液中的R＆D Systems的TNF-α蛋白标准。
4. 至8微克/毫升缓冲液稀释链霉rPhycoerythrin的（SA聚乙烯）（提供1毫克/毫升）。

第三。抗体筛查

1. 1 COSTAR圆底96盘筛选试验16口井，每年加入50μL抗体耦合的微球混合。
2. 加入50μL检测缓冲液的16口井8，测量背景。
3. 加入50μL的R＆D Systems的TNF-α的标准（2000皮克/毫升），其他8口井，测量响应。
4. 在室温，避光，孵育一小时，而一个试验板振动筛震动。
5. 加入50μL四个抗体检测的四口井（两个背景和两个反应）和孵育30分钟，在室温，避光，一个试验板沙晃动，而KER。
6. 加入50μL的SA-PE试剂所有油井，室温孵育15分钟，由轻保护，而一个试验板振动筛震动。
7. 将在一分钟的磁板分隔板，然后取出液体，有力地反转的板块。
8. 加入100μL检测缓冲液的16口井，将磁板分隔板一分钟，然后取出液体而有力反相板分隔。
9. 16口井，每年新增100μL检测缓冲和阅读的Luminex MAGPIX仪器板指到用户的正常操作手册。
10. 选择一种抗体对，以满足您所需的信号强度。

四。 XMAP功能检测

1. 在选择最佳的捕获抗体，稀释100μL抗体偶联磁珠股票（从步骤IB8）10毫升缓冲液。
2. 加入50μL78口井的两个合演轮底96孔板稀释珠。 （78井×2板= 156井），每块钢板将用于评估不同的检测抗体的性能。
3. 准备12点的标准曲线，开始于8000 pg / mL和结束于4皮克/毫升，在R＆D Systems的TNF-α的标准。加入50μL检测缓冲液每6个50μL，每个稀释复制到每个板块，加上六口井，为背景，共有78口井/板。
4. 板在室温，避光，孵育一小时，而一个试验板振动筛震动。
5. 加入50μL的第一次检测抗体所有78口井的第一盘。重复第二盘的第二次检测抗体。
6. 板块孵育30分钟，在室温，避光，而一个试验板振动筛震动，。
7. 添加了SA-PE试剂50μL，每块板的所有油井。
8. 孵化15分钟的两个板块，在室温，避光，而一个试验板振动筛震动。
9. 放置在一分钟的磁板分隔板，然后取出液体而有力反相板分隔。
10. 加入100μL检测缓冲板78井，放置在一分钟的磁板分隔板，然后取出液体，有力地反转的板块。
11. 加入100μL检测缓冲板78井和上MAGPIX仪器分析，指的是用户的正常操作手册。

五，ELISA检测

1. R＆D系统的人力TNF-α/TNFSF1ADuoSet ELISA试剂盒（研发部＃DY210）中包含的指示，测量与研发套件提供的标准所产生的响应。重复三次，酶联免疫吸附试验替代的R＆D Systems的捕获和检测蚂蚁ibodies与其他厂商的抗体。为简单起见，对供应商的抗体（如微孔微孔检测抗体捕获抗体，Abcam Abcam检测抗体捕获抗体，等）。
2. 评估每对独立，由ELISA格式的要求，与TNF-α蛋白的三个标准。

六。代表结果

此协议表明了一个典型的酶联免疫吸附试验可转换的XMAP平台的同时利用多重的技术能力迅速优化检测。在这个例子中使用的酶联免疫吸附试验是人类肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的酶联免疫吸附试验，DuoSet从R＆D系统套件（研发部＃DY210）。

除了 ​​套件中提供的抗体对从不同来源（见材料表），三对其他抗体进行了评价，同时使用XMAP平台。火炭你的抗体被指定为捕获抗体和耦合到MagPlex低浓度微。其他四个抗体检测抗体被指定为三，其中购买生物素耦合第四，生物素，在“议定书”中所述。

这项研究的抗体被选为可用性和供应商的基础上。然而，在实际环境中，抗体应选择基于个人用户的偏好和过去的表现，抗体经验。虽然，这个实验并不作为捕获抗体与检测抗体测试抗体的适用性，可以很容易地修改此协议用于这一目的。

作为一个多元化作为一种​​混合物，以评估所有四个捕获抗体进行的Luminex XMAP检测的，结合四套肿瘤坏死因子-α抗体耦合MagPlex微。捕获抗体进行了评价与四个生物素化检测抗体单独四个捕获抗体，每一个检测抗体的相互作用等，可同时测定。等四个检测，并行执行，确定所有四个捕获抗体与所有四个检测抗体的相互作用。 图1显示了从这些筛选试验的比较数据。

结果表明，从R＆D系统DuoSet抗体对执行最好在6183位数的荧光强度（MFI）单位产生的响应。也有人指出，Millipore公司的R＆D抗体对响应（86％）和Abcam（67％）的抗体检测方法提供了一个合理的回应，在XMAP检测时的R＆D系统捕获抗体结合。 Abcam，Millipore公司和Novus公司的捕获抗体产生在XMAP法的反应不太理想。

重要的是要注意，该PUR这项研究的姿势不一定是突出特定抗体或供应商之间的差异，而只是为了说明，观察他们的表现有类似的条件下使用时的差异，并在XMAP平台可以提供评估这些差异的有效手段。

的R＆D系统DuoSet协议是用于在ELISA格式比较四种抗体对。在R＆D Systems的协议，因为它反射典型ELISA今天广泛使用的协议，并与所有的抗体对类似于使用xMAP技术的协议。酶联免疫吸附试验表明，从R＆D系统的抗体对再次给了最好的结果（ 图2）。 Abcam抗体对生产没有Millipore公司和Novus公司生产的适度反应和对抗体反应。

以评估抗体反应的变化，用任何标准所有四个antibod的Ÿ对三种不同的重组TNF-α蛋白标准进行，从三个不同的供应商（见材料表）。在图2显示的数据，重组肿瘤坏死因子-α蛋白标准，从三家厂商给了相同的结果。

从R＆D系统的肿瘤坏死因子-α蛋白被用于生成与酶联免疫吸附试验（ 见表1）和（ 表2及表3）XMAP检测标准曲线。而ELISA法的R＆D Systems的抗体对，XMAP检测利用从R＆D系统或Millipore公司的R＆D系统的捕获抗体和检测抗体。从R＆D系统的肿瘤坏死因子-α蛋白稀释到生产从8000到4皮克/毫升的浓度范围。只对R＆D系统的抗体产生的预期结果在XMAP法，以响应> 20,000小额信贷机构，如表2所示，图3。时，从微孔检测抗体被使用的地方的研发系统检测抗体（ 见表3），的响应（6000小额信贷机构）约30％的检测抗体从R＆D系统获得的答复XMAP含量;如图3。

表1中的数据代表的酶联免疫吸附试验，其中有制造商的建议TNF-α的范围16至1000皮克/毫升的标准曲线。这个范围是非常有限的，因为在1000 OD皮克/毫升比2外径单位和分光光度计是无法衡量上述3外径。因为分光光度计的限制，这是不可能的酶联免疫吸附试验的范围进一步增加。此外，在表1的数据表明，R＆D系统DuoSet酶联免疫吸附试验是不能够检测TNF-α的浓度远低于16皮克/毫升。另一方面，XMAP检测能力的衡量ING肿瘤坏死因子-α在无论是R＆D系统或微孔检测抗体结合的R＆D系统的捕获抗体浓度小于7.8皮克/毫升。

日志记录规模绘制（ 图4），更好地说明这两种方法的动态范围和灵敏度。从XMAP检测的ELISA反应和响应的斜率之间的明确区分可以看出，进一步表明为与ELISA检测TNF-α的浓度较高和较低的更多限制的能力。

近似​​确定最低的TNF-α的浓度，观察反应水平（MFI）比背景，加上三倍标准偏差（SD）两个功能肿瘤坏死因子-αXMAP检测检测限（LOD）的限制。为了达到统计学意义，6复制的XMAP和ELISA方法被用来确定的SD。 THESLOD的的é估计是乐观的，并打算与理解，在正常工作条件下，只有两个或三个复制将用于提供“最好的情况”的情景，。 表2中，它可以，使用的研发系统配对，在最低的肿瘤坏死因子-α在3.91浓 ​​度时，皮克/毫升产生66小额信贷机构，大于的背景+ 3SD的响应的响应，满足此条件。当微孔检测抗体的R＆D系统的捕获抗体（ 见表3），检出限为小于7.81皮克/毫升。在这种情况下，第二最低的TNF-α浓度产生17个小额信贷机构的可接受的响应;大于最低的肿瘤坏死因子-α浓度的响应加三倍的标准偏差。 （10 MFI + 3（2.4）= 16.29小额信贷机构），同样的R＆D系统DuoSet酶联免疫吸附试验，检测限估计为63 pg / mL和31皮克/毫升（ 见表1）。

图1。的中位数的荧光强度的研发系统标准（@ 2000皮克/毫升）每天的4捕获抗体可能结合（加上4不同的微区）和“4检测抗体（MFI）。。 点击这里查看大弄清楚 。

图2。四个捕获和检测抗体对组合三种不同的重组标准（1000皮克/毫升）的光密度（OD值）。捕捉和抗体检测为简单起见，由供应商任意配对， 点击这里查看大图 。

的R＆D Systems的DuoSet

皮克/毫升	外径	STD开发	+3的SD
1000	2.084	0.035	2.187
500	1.328	0.038	1.441
250	0.787	0.025	0.863
125	0.476	0.026	0.554
63	0.304	0.023	0.374
31.3	0.212	0.025	0.287
15.6	0.167	0.026	0.244
0	0.118	0.021	0.182

表1的光密度值（OD）的2倍稀释的研发系统DuoSet包插入，使用标准曲线指定系列;。包括标准偏差（SD）的和的检测估计限（LOD值），31.3 pg / mL和63皮克/毫升。

R＆D系统的捕获和抗体检测
皮克/毫升	小额信贷机构	STD开发	+3的SD
8000	20,320	463	21707
4000	15,594	223	16263
2000	11,098	79	11336
1000	6,985	160	7465
500	4149	80	4,390
250	2,233	30.0	2,323
125	1199	43.8	1330
63	636	14.0	678
31.3	340	12.9	379
15.6	183	5.9	201
7.8	103	2.2	109
3.9	66	2.4	73
0	11	0.8	13.8

表2中位数的荧光强度（MFI）。1标准稀释xMAP技术测量系列，使用的抗体对包含的研发系统DuoSet;。包括标准偏差（SD）的和的检测估计限（LOD值），低于3.91皮克/毫升。

R＆D系统与微孔检测抗体的捕捉抗体
皮克/毫升	小额信贷机构	标准开发	+3的SD
8000	5800	143	6,229
4000	3,881	120	4,242
2000	2,176	73	2,396
1000	1138	32.1	1234
500	578	31.3	671
250	289	6.2	307
125	142	3.1	151
63	75	5.3	91
31.3	44	3.3	54
15.6	28	2.6	35.5
7.8	17	1.5	21.2
3.9	10	2.0	16.3
0	7	1.4	11.4

表3中位数的荧光强度（MFI）。1标准稀释xMAP技术测量系列，使用的研发系统捕获抗体，并在EMD的微孔检测抗体;。包括标准偏差（SD）的和的检测估计限（LOD值），少比7.81皮克/毫升。

图3。两个XMAP实验和研发系统DuoSet ELISA的标准曲线。 点击这里查看大图 。

图4。一个XMAP标准曲线和日志记录规模ELISA标准曲线的比较。 点击这里查看大图 。

讨论

酶联免疫吸附试验转换的Luminex XMAP平台，可以简单，只要代链霉亲和素辣根过氧化物酶（SA-HRP）的，在一个典型的链霉，藻红蛋白（SA-PE）的ELISA试剂盒和性能优化。对于那些谁想要建立XMAP免疫，从地上爬起来，这可以用一个简单的协议，也使快速，多重抗体对评价完成。为XMAP检测试剂很容易被准备使用XMAP抗体偶联试剂盒夫妇指定的捕获抗体MagPlex低浓度微。使用低浓度微减少，而高浓度微提供相同的检测性能检测方法开发的成本。的准备再加MagPlex微所需的时间量是大约3个小时，这是速度远远超过了22 - 24小时大衣以及酶标板治疗涂井。的XMAP法的性能也优于酶联免疫吸附检测（<4皮克/毫升与31皮克/毫升）和动态范围（<4皮克/毫升至8000皮克/毫升比16的限制条款皮克/毫升至1000皮克/毫升）。板读者有一个有限的外径范围是3或4外径，限制检测的动态范围为上限。

毫无疑问，并非所有的抗体，将工作在ELISA格式，并非所有的抗体，在酶联免疫吸附试验工作，随时转让的XMAP检测格式。然而，因为XMAP检测可复用（例如，同时运行），它是可能的，以评估数的捕获和检测抗体组合，同时使用一个试验以确定最佳的一双。这个过程中可以节省大量的时间和试剂相比，酶联免疫吸附试验发展过程中，时间是有限的一对评价。如果两个或两个以上的抗体对执行等价;其他参数的检测被认为是对的（例如，可用性，成本等），以确定适宜。

除了与XMAP检测以提高​​检测性能和灵活性，也有显着的成本节约。建议的抗体数量所需的外套单井酶标板是400ng，而用于一个XMAP检测珠所需的数量大约是7.5纳克。因此，所需金额为酶联免疫吸附试验的抗体，将提供超过50个测试结果，如果用在XMAP法。对于涉及珍贵样品的应用，XMAP也有一个显着的优势。建议的酶联免疫吸附试验的样本量为100μL，而为XMAP检测所需的数量可以是一半，或更少。

总之，酶联免疫吸附试验的Luminex XMAP平台转换是简单，高效，节约成本，同时生产具有优异的动态范围和灵敏度的检测。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
描述	供应商	目录编号	评论
人类TNF-α/TNFSF1ADuoSet ELISA试剂盒	R＆D系统	DY210	包括单克隆抗体和生物素耦合多克隆抗体和重组肿瘤坏死因子-α蛋白标准
肿瘤坏死因子-α单克隆抗体	abcam	ab18696	捕获抗体，克隆CH8820
肿瘤坏死因子-α单克隆抗体	abcam	ab16166	生物素耦合检测抗体，克隆AS1的
肿瘤坏死因子α蛋白	abcam	ab9642	重组肿瘤坏死因子-α蛋白标准
肿瘤坏死因子-α单克隆抗体	ñovus	NBP1-50115	捕获抗体，克隆4H31
肿瘤坏死因子-α单克隆抗体	Novus公司	NB100-78162	生物素耦合检测抗体，克隆MAb11
肿瘤坏死因子α蛋白	Novus公司	NBC1-18460	重组肿瘤坏死因子-α蛋白标准
肿瘤坏死因子-α单克隆抗体	EMD的微孔	MAB1141	捕获抗体，克隆3C7.2
肿瘤坏死因子-α多克隆抗体	EMD的微孔	654250	兔多克隆抗体检测抗体
链霉亲和素 - 藻红蛋白	苔	SAPE-001	荧光记者点阵仪XMAP含量的试剂
MAGPIX W / xPONENT软件	Luminex公司	马GPIX-XPONENT	Luminex液相仪器
XMAP抗体偶联（ABC）套件	Luminex公司	40-50016	包括EDC试剂，磺酸基-NHS的试剂，激活缓冲，洗涤缓冲液，1.5 ml反应管，一次性移液器
MagPlex微球，低浓度	Luminex公司	MC10012-ID，MC10013-ID，MC10014-ID，MC10015编号	低浓度珠（@ 2.5×10 6珠/毫升）
EZ-Link的磺酸基-NHS的 - LC-生物素	赛默飞世尔	PI-21335	未修改检测抗体生物素试剂盒
Tecan公司无限F200的读者	Tecan公司		酶标板读卡器
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich公司	的P-3688	1％PBS-BSA的，缓冲液;
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磁板分离器	Luminex公司	CN-0269-01	对于96孔板磁分离检测洗涤步骤