评估肾细胞​​蛋白激酶C同工酶，线粒体功能及细胞活力的

Grażyna Nowak; Diana Bakajsova

doi:10.3791/4301

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摘要

活化的蛋白激酶C（PKC）的同工酶与呼吸，氧化磷酸化有关的线粒体功能和对细胞活力的影响进行说明。该方法适应腺病毒技术，选择性过度表达PKC同工酶在原代培养和各种检测，以确定线粒体功能和能量状态的细胞。

摘要

同功酶的蛋白激酶C（PKC）家族参与了许多生理和病理过程。我们最近的数据表明，PKC调节线粒体的功能和细胞能量状态。许多报告表明激活PKC-αPKC-ε提高在缺血性心脏的线粒体功能和介导的心脏保护作用。相反，我们已经表明，PKC-α和PKC-ε参与在nephrotoxicant诱导的线粒体功能障碍和肾脏细胞中的细胞死亡。因此，本研究的目标是开发PKC同工酶可以选择性地激活或抑制，以确定其氧化磷酸化和细胞生存的调节作用，保持积极的线粒体功能的肾细胞的体外模型。培养更好的条件，导致线粒体线粒体呼吸和活动的原代培养肾小管上皮细胞（RPTC）线粒体酶类似于那些在RPTC 体内。由于传统的转染技术（脂质体转染，电穿孔）在原代培养中是低效的，对线粒体功能产生不利影响，PKC-ε突变cDNA分别传递到RPTC通过腺病毒载体。这种做法的结果转染培养RPTC超过90％。

在这里，我们提出了评估的作用，PKC-ε的方法：1。调节线粒体形态和ATP合成，和2与相关联的功能。 RPTC在小学文化的生存期。由过度的组成性激活PKC-ε突变激活PKC-ε。 PKC-ε抑制过度的无效突变体的PKC-ε。线粒体功能的评估是通过检查呼吸，呼吸链的完整性，活动，呼吸复合物和F ₀ F _1-ATP酶，ATP生成率和ATP含量。呼吸是ssessed的毛地黄皂苷-透性RPTC状态3（最大呼吸中存在的多余的基板和ADP）和非耦合呼吸。呼吸链的完整性进行评估，通过测量所有4个配合物中分离线粒体呼吸链的活动。氧化磷酸化的能力的评价通过测定线粒体膜电位，ATP生成率，和F _{0 F 1-ATP}酶的活性。的RPTC的能源状况进行评估，确定细胞内ATP含量。在活细胞中的线粒体形态可视化使用Mitotracker有红580，专门蓄积在线粒体内的荧光染料，和活的单层，在荧光显微镜下检查。 RPTC可行性评估采用膜联蛋白V /碘化丙啶染色后流式细胞仪测定细胞凋亡和胀亡。

这些方法允许在个别的PKC同功酶的选择性激活/禁止，以评估它们的作用，在细胞功能中的各种生理和病理条件，可以在体外再现。

研究方案

1。原代培养肾小管上皮分离

麻醉兔，切除双侧肾脏，并将其放置在培养皿中充满了消毒缓冲（DMEM/F12介质）在层流罩。
每个肾灌注用50ml准备缓冲后跟50毫升无菌磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4（PBS）中，PBS-氧化铁溶液（45毫升+ 5毫升）。德封装的肾脏和转移他们的准备缓冲液去铁胺。
收获皮质每个肾。
使用15毫升的Dounce匀浆器匀化组织。超过2无菌网筛（85微米的底部和顶部235微米的）放置超过1升的无菌烧杯中倒入匀浆。冲洗筛去铁胺的缓冲。
收集85μm的筛上留下的任何组织，在无菌的离心管中填充用35-40毫升的去铁胺的含缓冲。轻轻混合细胞悬浮液。
建立一个强大米agnet管外部的除去铁填充肾小球，让悬浮液中定居。从磁铁使用巴斯德吸管的吸液铁。重复此过程。
准备1毫升消化培养基含有2,400-2,500单位的I型胶原酶和0.6毫克的大豆胰蛋白酶抑制剂溶解在去铁胺的含缓冲。过滤消毒的消化介质。
调整细胞悬浮液的体积至40ml，并加入1毫升的消化培养基。轻轻悬浮液混合17分钟，离心，在50×g离心2分钟，在4℃，在室温下孵育，吸出培养基，并添加新鲜的去铁胺缓冲液。
重复的铁除去与磁铁的过程几次，旋转的悬浮液再次向下，吸出培养基，并加入46毫升的不含有葡萄糖的培养基中。
轻轻混匀，并测量出500微升该悬浮液分为两个预先称重的Eppendorf管中。旋转细胞以10,000 xg 1分钟，抽吸介质，重量的颗粒。计算湿质量和蛋白质的总收率。
板的细胞在无菌的35毫米的培养皿中，在1毫克蛋白质/培养皿，使用无葡萄糖DMEM/F12培养基的密度。在2ml无葡萄糖的DMEM/F12培养基总是在轨道摇床中在37℃下（95％空气/ 5％CO _2）的培养箱^。1,2的培养细胞

2。肾小管上皮细胞培养

培养基是DMEM和Ham氏F-12营养混合不加酚红，丙酮酸盐，和葡萄糖的50:50混合物，补充有15毫摩尔的NaHCO _3，15mM的HEPES，和6mM乳酸（pH值7.4，295 mosmol / KGH _{2 O）。}媒体补充与L-抗坏血酸-2 - 磷酸（50μM），牛胰岛素（10纳米），人转铁蛋白（5毫克/毫升），氢化可的松（50纳米），和硒（5纳克/毫升），在紧接每日媒体的变化。
吸旧媒体使用无菌技术菜肴。温暖，新鲜的培养基中加入2毫升每道菜都使用无菌技术。重新NAL近端肾小管上皮细胞（RPTC）达到汇合后约5-6天，在电镀^1,2。

3。腺病毒感染的RPTC

腺病毒感染进行融合，静态的文化RPTC后的每日媒体的变化。显性负的PKC-ε突变（dnPKC-ε），通过更换构成：1）赖氨酸与精氨酸，在436位的ATP-结合位点，以及2）在位置与谷氨酸丙氨酸159的假底域。这些突变破坏结构的激酶活性不改变PKC-ε的活性构象^。3 PKC-ε组成删除其抑制假底域的残基^154-163。
添加存货溶液重组腺病毒caPKC-ε的cDNA或dnPKC-εcDNA的每个培养皿中，以获得期望的多重性感染（MOI）导致显着增加的蛋白激酶C-＆epsil的“;蛋白水平。孵育24小时腺病毒RPTC。改变媒体和培养细胞中的另一个24小时。显著磷酸化和总的PKC-ε蛋白水平的提高，可以得到使用25-50 MOI的腺病毒载体编码caPKCε。大MOI的结果增加更大的积极PKC-ε的水平，但它不建议在RPTC由于快速的细胞死亡和损失。显著水平升高的非活动的PKC-ε蛋白可以使用50-100 MOI方式获得不产生不利影响的情况下在RPTC ⁵
在感染后的48小时内，抽吸介质，洗单分子膜与PBS，并收集细胞进行免疫印迹分析，以确定蛋白质水平的^PKC-ε。

4。 RPTC呼吸的测量

准备一个测定缓冲液，用于测定状态3呼吸（120 mM KCl中，5mM的KH ₂ PO _4，10mM的HEPES，1mM的用MgSO _4，和2mM EGTA，pH值7.4）。为了测量复杂的I耦合状态3呼吸，补充的测定缓冲液，5mM的谷氨酸，5mM的苹果酸盐和0.1毫克/毫升的毛地黄皂苷。对于复杂的II-耦合状态3呼吸，补充的测定缓冲液中的10mM琥珀酸盐，0.1μM鱼藤酮，和0.1毫克/毫升毛地黄皂苷。对于复杂的IV-耦合状态3呼吸，补充试验缓冲液，1mM的抗坏血酸盐，1mM的N，N，N'，N'-四甲基 - 对 - 苯二胺（TMPD），和0.1毫克/毫升毛地黄皂苷。在37℃水浴中放置的解决方案。
吸媒体从培养皿中包含RPTC单层，加入2毫升的热态3呼吸缓冲，轻轻地刮细胞的菜用橡胶警察，将暂停Clark型电极消耗氧气室配备。
测量状态的呼吸（ADP的情况下）。启动状态3呼吸由ADP添加至终浓度为0.4mM。由增加的最终concentr寡启动状态4呼吸通报BULLETIN为0.5微克/毫升。非耦合测量呼吸，加入0.5μMFCCP，细胞呼吸作用状态^3。6,7
从腔室中收集的细胞悬浮液，沉淀蛋白质，使用高氯酸，和自旋向下的沉淀。确定在蜂窝沉淀的蛋白质浓度。

5。分析线粒体膜电位（ΔΨm）的

准备0.5mM的JC-1溶液中的无菌培养介质中。
缓慢加入20微升的JC-1溶液每个培养皿中，得到最终浓度为5μM。涡流盘来彻底混合染料。返回的菜肴的培养箱30分钟。
放菜在冰上，吸出物的介质，并用冰冷的PBS洗单层两次。吸出PBS，加1毫升的新鲜PBS，刮细胞的菜，然后将其转移到离心管中。吹打起来，并成单细胞单分子膜。
旋转暂停2分钟，ASP在1000 XG发怒的上清液，加入1毫升的PBS中，以沉淀和重新悬浮，得到单细胞悬浮液。再次重复此步骤，如果必要的话。
旋转细胞在1000×g离心2分钟，吸取上清液，加0.5毫升的PBS，重悬颗粒。分析通过流式细胞仪检测488 nm氩离子激光激发荧光。在两个独立的通道，FL1为525 nm和590 nm的FL2在阅读排放。线粒体膜电位作为荧光比例^FL2/FL1。6表示

6。线粒体分离

准备隔离缓冲液：缓冲液A（10mM的HEPES，225 mM的甘露糖醇，75 mM蔗糖，0.1mM的EGTA，pH值7.4），缓冲液B（缓冲液A含有蛋白酶抑制剂，1mM的的Na ₃ VO _4，1mM的氟化钠），和缓冲器C（10mM的HEPES，395 mM蔗糖，0.1mM的EGTA，pH值7.4）。在冰上执行所有步骤。
RPTC单层洗净两次，用冰冷的PBS缓冲液。刮Eppendorf管中旋转的单分子膜在500×g离心5分钟。在1ml的缓冲液A洗涤沉淀
重新悬浮沉淀在1ml的缓冲液B中，并且该悬浮液转移到一个2毫升的Dounce匀浆器。
均质的Dounce匀浆器中的细胞匀浆中，直到大部分的细胞在显微镜下检查时，被破坏。
以1,000 xg离心5分钟，在4℃下离心匀浆收集上清液并和旋转下降，以15,000 xg离心10分钟，在4℃下
丢弃上清液，并重新悬浮的颗粒含有粗线粒体在1ml的缓冲液C.附带上清液以15,000 xg离心10分钟，在4℃下重复⁵的粒料的2次以上的洗涤。
为了测量呼吸配合物的活动，重新悬浮线粒体沉淀在50-100微升测定缓冲液并冷冻在液氮中。慢慢地在冰上解冻样品。

7。测量活动的NADH-泛醌氧化还原酶（复合体I）

准备的测定缓冲液：10mM的KH ₂ PO _4，5毫摩尔的MgCl _2，pH值7.2。加入无脂肪酸BSA和NADH，得到最终浓度为0.25％和0.25mM，分别。抗霉素A溶液（1毫克/毫升）中加入2μl至终浓度为2微克/毫升。
在48孔透明板运行的样品。包括空白样品，有所有增加，但没有线粒体。向每孔加入500微升测定缓冲液与加法和线粒体中，并混合5分钟，在30℃下孵育板。
启动反应，向每孔加入10微升3.25 mM的泛醌。记录的吸光度（340 nm）的为3分钟，在20秒的间隔。加入5μl的鱼藤酮溶液（1毫克/毫升）的每个孔中，并记录额外的2分钟的吸光度。计算复杂，我鱼藤酮敏感的NADH氧化活性。

8。测量活动琥珀酸泛醌氧化还原酶（复合物Ⅱ）

准备的测定缓冲液含有0.25％脂肪酸游离BSA，的20mM钾琥珀酸，0.25毫摩尔2,6 - 二氯靛酚，2微克/毫升抗霉素A，和10μg/ ml的鱼藤酮。
在48孔透明板，包括空白样品，有所有增加，但没有线粒体，运行的样品一式两份。向每孔加入500微升测定缓冲液与加法和线粒体中，并混合2分钟，在30℃下孵育板。
启动反应，向每孔加入10微升3.25 mM的泛醌。记录的吸光度（595 nm）的为3分钟，在20秒的间隔。计算复合物II活性的2,6 -二氯靛酚还原后。

9。辅酶Q-细胞色素C还原酶活性的测量（情结III）

准备的测定缓冲液，含有0.1％无脂肪酸的牛血清白蛋白，80mM的琥珀酸钾，10μg/ ml的鱼藤酮，和0.24 mM的钾氰化物。
运行样品在48孔透明板，包括空白样品，有所有增加，但没有线粒体的副本。向每孔加入291微升测定缓冲液与加法和线粒体中，并混合5分钟，在30℃下孵育板。
开始反应6 mM的氧化中的细胞色素c在各孔中加入3微升。记录的吸光度（550 nm）的为3分钟，在20秒的间隔。抗霉素A溶液（1毫克/毫升），每孔加入5μl和记录额外的2分钟的吸光度。计算复杂III活性，抗霉素A敏感的细胞色素C还原^。7

10。细胞色素氧化酶的活性测定（复杂IV）

准备9的细胞色素c的1mM溶液中加入抗坏血酸钠和透析过夜，4℃下在1升的磷酸盐缓冲液中（10mM的KH ₂ PO _4，pH 7.2）中含有5mM MgCl _2的溶液，降低了对细胞色素c。准备在测定缓冲液中，其中包含0.1％无脂肪酸的牛血清白蛋白和抗霉素A（2微克/毫升）。
在48孔透明板，包括空白样品，有所有增加，但没有线粒体，运行样本。向每孔加入233微升测定缓冲液与加法和线粒体中，并混合5分钟，在30℃下孵育板。
除了减少，细胞色素c（90μM的最终浓度），开始反应。记录的吸光度（550 nm）的为3分钟，在20秒的间隔。 2微升的KCN溶液（8微克/毫升）加入到每个孔中并记录另外2分钟的吸光度。计算KCN敏感的细胞色素c氧化复合物IV的活性。

11。活性测定的F ₀ F _1-ATP酶（ATP酶）

准备F _{0 F 1-ATP}酶检测缓冲液（10mM的Tris-HCl，200 mM KCl中，2毫摩尔MgCl _2，pH 8.2）中。检测缓冲液中重悬线粒体颗粒，冻结线粒体样品的液体。三维氮气，慢慢地在冰上解冻样品。
运行一式三份样品在48孔透明板。每个治疗组中，2的井将运行来测量总的ATP酶活性（275微升测定缓冲液，5微升线粒体悬浮液，和5微升95％乙醇中）和1，以及测量寡霉素不敏感的ATP酶活性（275微升测定缓冲液，5微升的线粒体悬浮液，和5微升的1毫克/毫升的寡霉素在95％乙醇溶液）。
在31°C孵育10分钟恒定的颤抖。加入16微升的100 mM ATP溶液（pH 7.0），在31℃孵育5分钟，使用恒定的震动。
200μl的培养混合物转移到一个管中，50μl的3 M TCA。孵育样品在冰上10分钟，和自旋下来以10,000 xg离心5分钟，在4℃。使用上清颗粒，以确定磷酸盐和蛋白质含量分别。
确定使用上清液中的磷酸盐含量无机磷酸盐的测定。准备加入0.88克硫酸亚铁₄至10毫升3.75 MH ₂ SO ₄和调整到第90毫升，用H _{2 O，100}毫升的萨姆纳试剂按到该溶液中的FeSO ₄在H ₂ SO _4，加入10毫升的钼酸铵溶液（0.66克毫升H _{2 O）。}避光。
负载96孔板中，用50μl每个磷酸标准（0 - 1,000μM的KH ₂ PO _4）和50μl的每种上清液重复。每孔加入250μl的萨姆纳试剂的板在30°C孵育15分钟恒定的颤抖。
记下在室温下在595 nm处的吸光度。 F _{0 F 1-ATP}酶活性，是由从ATP测量的寡霉素敏感的释放_的 P i，正如我们前面所述^。7,8计算总和寡霉素不敏感的F _{0 F 1-ATP}酶活性。计算寡敏感的ATP酶激活VITY，寡不敏感减去总ATP酶活性的活动^。8,9

12。细胞内ATP含量的测定

将培养皿RPTC膜的冰，吸出培养基，用冰冷的PBS缓冲液洗两次单层。加入1 ml PBS中，各单层，刮去各单层的PBS中，并在Eppendorf管中收集的细胞悬浮液。附带的Eppendorf管中，在5秒的离心。
确定在每个RPTC样品的ATP含量的荧光素酶的方法，使用的ATP生物发光检测试剂盒HS II（Roche）和制造商的协议。确定在每个样品中的蛋白质浓度，并计算每毫克蛋白^。8的 ATP浓度

13。线粒体形态的可视化

改变培养基。加入2μl100μM解决方案的的Mitotracker有红580每道菜（终浓度100纳米）和返回的菜的incubator为30分钟。
检查活的单分子膜⁵在荧光显微镜下，用水浸物镜。

14。细胞活力分析

在开始测定之前，在24小时时，准备50mM的溶液中顺铂治疗，将作为阳性对照，细胞凋亡（膜联蛋白V-阳性细胞）的细胞。另外，准备500 mM的叔丁基过氧化氢的溶液中，将作为阳性对照胀亡（碘化丙啶（PI）阳性细胞）的细胞治疗。
治疗2款2μl的50毫米顺铂和2款2μl的500毫米叔丁基过氧化氢。 1碟专用无染控制。
在治疗与顺铂和TBHP的24小时后，制备的结合缓冲液（的10mM的Hepes，140 mM氯化钠，5mM的氯化钾，1毫摩尔的MgCl _2，1.8毫的CaCl _2）和碘化丙啶（PI）溶液（50微克/毫升）在结合缓冲液中。
一次洗单分子膜有约束力的BUFF呃。添加1毫升的冰冷的缓冲液中，每个培养皿中，除了无染色和膜联蛋白V-阳性细胞的PI溶液和50μl。包括菜肴和冰上孵育15分钟，温柔的轨道晃动。
洗净单层用结合缓冲液（10分钟），并加入1毫升的膜联蛋白V-FITC溶液每个培养皿中，除了没有污点和PI阳性细胞的结合缓冲液和2μl。盖菜，并在室温下孵育10分钟，温柔的轨道晃动。
吸液的缓冲液和洗单层用1ml冰冷的结合缓冲液在冰上10分钟，温和的轨道摇动。重复洗涤步骤。
吸结合缓冲液，加入500μl结合缓冲液，每道菜。轻轻地刮了的细胞用橡胶警察和转让的细胞，流式细胞仪可检测管。使细胞分散成单细胞悬浮液，通过移液样品向上和向下。分手的细胞团。
立即FLO量化PI和Annexin V-FITC荧光瓦特仪使用PI和FITC在590和530 nm，激发波长为488 nm，发射。每个样本数为10,000个事件。
将FITC荧光上的X轴方向和在Y-轴的流式细胞仪散点图数字PI荧光。被认为是细胞凋亡阳性细胞为Annexin V和负PI。被认为是细胞PI和Annexin V的负肿胀^。10,11