人牙髓干细胞的分离，鉴定和比较性恒牙使用两种不同的方法，得出

摘要

通过使用所描述的方法分离和鉴定人牙髓干的细胞（hDPSCs）或比较分化成成牙本质细胞。

摘要

引言

干细胞是细胞克隆细胞具有两个显着的特点，被称为多潜能和自我更新^15。在所有的干细胞不同的复制效力，牙齿干细胞的产后干细胞引起的关注，近年来，因为其可访问性，可塑性强，高增殖能力比较与其他成体干细胞^16。典型地，类似的间充质干细胞，牙髓干细胞粘附的克隆形成有多个成间充质细胞的分化能力和/或非间充质细胞谱系，无论是在体外和体内的细胞，这些细胞^。1-8,17,18稳干细胞鉴定阴性表达造血抗原（ 如 CD45，CD34，CD14），阳性表达的CD90，CD29，CD73，CD105，CD44和^{STRO-1。19,20}

容易获得潜在的疼痛和发病率最低，作为一个有价值的人DPSCS能源间充质干细胞相比普通的来源，如骨髓间充质干细胞^21。在一般情况下，稳干细胞已被分离由任何生长的方法， 即 ，从的牙髓组织外植体^{（DPSC-OG）22-24，}和/或酶消化^{4,6,25（DPSC-ED）}的干细胞的迁移。以往的研究表明，隔离方法和培养条件下，可以吸引不同的人群或谱系体外通道^26,27。在的箱子恒牙（pDPSCs），Huang 等人透露，酶消化pDPSCs超越全部牙髓之中相比，有较高的增殖潜力^，26此外，在箱子乳牙（dDPSCs），它表明一个STRO-1及CD34的标记表示在比较更多的dDPSC-ED与dDPSC-OG。此外，dDPSC-ED显示定义的骨/ odonto介质的高矿化率在²⁷因此，由于出色的潜力DPSCS在regenerative药，将有更多的研究，以更好地了解可能来自不同的隔离方法不同人群的需要。

在这里，它是尝试引入纸浆提取的简单的方法，通过使用一步牙科金刚石盘以方便处理纸浆提取。此外，在申请ED或OG方法的人牙髓源性干细胞的分离，两组间的一般特性及分化能力进行了调查。

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研究方案

1。准备的酶液和增殖培养基（PM）

1. 车型胶原酶类型I解：称出I型胶原酶（12毫克/毫升），并溶解在1ml PBS及过滤器，用0.2μm注射器过滤器。然后将其放在15毫升的试管，并保持在-20℃，直到需要。
2. 使分散酶解：称取分散酶（16毫克/毫升），并溶解在1毫升的PBS及过滤器，用0.2μm注射器过滤器。然后将其放在15毫升的试管，并保持在4℃直至需要。
3. 酶溶液：加入到2毫升无菌PBS中含有100毫克/ ml青霉素，100毫克/ ml链霉素1毫升胶原酶I型溶液（12毫克/毫升）和1毫升分散酶解决方案（16毫克/毫升）。最终成交量为纯净和胶原酶我总含量应为4毫克/毫升和3毫克/毫升，容易接受。然后，分装到4个15毫升的试管，每片含1毫升酶溶液。此卷每个管可以用于一个纸浆的蒸解。
4. 使清洗溶液：加入100毫克/ ml青霉素，100毫克/毫升链霉素的PBS中。
5. 车型基本培养基：阿尔法修改的Eagle培养基（α-MEM），补充有10％FBS及100单位/ ml青霉素，100毫克/毫升链霉素。
6. 设为的扩散介质（PM）：阿尔法修改的Eagle氏培养基（α-MEM）辅以10％胎牛血清，100μML-抗坏血酸-2 -磷酸，2 mM的L-谷氨酰胺，100单位/ ml青霉素，100毫克/毫升0.25毫克/毫升链霉素，两性霉素B。
7. 车型牙源性媒体：阿尔法修改的Eagle氏培养基（α-MEM）补充有10％胎牛血清，100μML-抗坏血酸-2 -磷酸，2 mM的L-谷氨酰胺，100单位/ ml青霉素，100毫克/ ml链霉素，0.01μM地塞米松，5mM的β-甘油磷酸，1.8 mM的磷酸二氢钾。

2。准备人牙髓组织中牙髓干细胞Isolatio的Ň

1. 正常的人类第三磨牙的成年人（21-29岁）下认可的机构审查委员会（IRB）的伊玛目阿里在牙科诊所。
2. 牙齿被置于基本培养基（α-MEM培养基补充有10％FBS），在4℃下，并转移到实验室
3. 在无菌条件下，一个生物危害的层流罩内工作，设置被完成一个100毫米的培养皿中，以被处理的每个齿。齿面，用70％乙醇清洗。
4. 虽然工作在一个培养皿，牙齿保持的牙科镊子和一个手术刀，清洁碎片和牙周膜的根上。
5. 釉牙骨质交界处慢慢减少使用消毒的牙科盘揭示牙髓腔。它应该被认为必须缓慢进行，切割过程中的牙齿组织，以减少过热。
6. 轻轻分开的牙冠和牙根的牙髓组织。
7. 牙髓组织切成小块与援助的手术刀刀片。

3。人牙髓隔离的

1. 牙髓组织进行的hDPSCs隔离的牙髓组织的外植体牙髓组织或细胞直接产物无论是酶解。
2. 牙髓组织的酶分解：
   1. 牙髓组织的小片的酶溶液在37℃下1小时，转移到涡，每30分钟到分手组织。
   2. 后来被拆除，大细胞聚集和单细胞悬浮液，通过细胞通过一个70μM细胞的过滤器。
   3. 单细胞悬浮液，在1,200 rpm下离心5分钟，在室温下。
   4. 上清液仔细移液和沉淀物重新悬浮在1ml的增殖培养基（PM）的。 （ 注：FBS增殖培养基终止酶的显示解离）。
   5. 单细胞悬浮液接种到25cm ^2的培养瓶中用PM牙髓，然后在5％CO ₂在37℃下孵育。
   6. 培养基中被改变，直到细胞汇合实现每三天。
3. 直接从牙髓组织的外植体细胞的产物：
   1. 牙髓组织切碎成1-2毫米的碎片，每片被放置在个25-cm ²培养瓶中用PM，然后温育在37℃下在5％CO _2。它应被视为细胞产物，总体积的PM必须支持进一步的细胞生长（2-3毫升按每烧瓶）的纸浆片的安装。
   2. 换液后的产物观察。
   3. 超越在汇合的细胞子的比率为1:4（通道1）培养。

4。免疫表

1. 250,000细胞/管的这两种类型的细胞在通道3由PE或FITC标记的抗人用自己的同种型的抗体温育30分钟，于4℃下在黑暗的地方。 （ 注：施加的抗体浓度根据制造协议。）
2. 的孵育时间后，加入100μlPBS或FACS稀释液加入到每个试管中，并在1,200 rpm下离心5分钟，在黑暗的地方。
3. 除去上清液与沉淀物重新悬浮于100μl的PBS或FACS稀释在黑暗的地方。
4. 有针对性的表面标志物（CD标记）BD FACSCalibur进行了评价。

5。矿化细胞诱导分化的DPSCS量化的茜素红S含量

1. 牙髓组织任酶解（称为作为DPSC-ED）或直接的细胞生长自牙髓组织的外植体（DPSC-OG），通过以下方式获得的全部牙髓之中子培养第3代。
2. 一吨第3代，将细胞种子到6孔板中，以5,000细胞/孔。
3. 在60％的汇合，牙源性介质取代以往的PM。三个孔作为阴性对照，加入生长培养基中保持。
4. 换液，每3天至21天。
5. 在第21天，将细胞用PBS洗涤，1ml /孔，在室温下的15分钟的10％多聚甲醛固定。
6. 然后，多聚甲醛，用移液管关闭，仔细和细胞洗涤3次（每次5-10分钟）用蒸馏水，H _{2 O。} （ 注：避免干扰单层。）
7. 在洗涤后，1ml /孔茜素红S中加入在室温下20分钟。
8. 由去离子H _{2 O} 4次（每次5分钟，用温和的摇摆）洗涤细胞以除去任何额外的茜素红。
9. 1ml /孔中加入H _{2 O，}以防止细胞干燥。
10. 板被假定为视觉插件pection和/或图像采集。
11. 茜素红S的定量测定对于由1毫升10％乙酸到6孔板与在室温下振摇孵育30分钟的各孔中，H _{2 O}取代。
12. 然后，单层细胞/孔分别为刮＆醋酸及细胞被转移到单独的1.5毫升微量离心管。 （ 注：每口井应该转移到一个单独的管即三个测试井和三个控制井为每个ED＆OG组。）
13. 管被涡旋大力，持续30秒。
14. 加热至85℃，持续10分钟。 （ 注：为避免蒸发，管密封，封口膜）。
15. 加热结束后，将试管转入冰浴5 min。 （ 注 ：管不应该被打开，直至成为冷却）。
16. 浆料在20,000 xg离心15分钟，离心分离。在离心过程中，茜素红的标准了。

茜素红S的标准制备首先通过的稀释缓冲液稀释，及用于基于该表的2 - 倍系列稀释。

高浓度范围内的染料

低浓度范围内的染料

2毫米

1毫米

500μM

250μM

125μM

62.5μM

31.3μM

15.6μM

7.8μM

3.9μM

1.9μM

0.9μM

0.4μM

空白

16. 离心后，被转移到新的，独立的1.5毫升微量离心管1毫升上清液/管。
17. 将pH中和〜375微升10％氢氧化铵，按每管的。 （ 注：pH值的愤怒应该是4.1-4.5）。
18. 一个不透明的壁透明底96孔板中加入150μl的标准样品（包括单独的测试及控件）。
19. 读出在405nm处的吸光度，并从样品的OD值相比，标准样地，作进一步的分析。

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结果

1. 酶解（DPSC-ED）是通过以下方式获得的全部牙髓之中这里示出在第10天，15,18（图1）。发起的菌落上形成几乎为3至5天之后，隔离。
2. 超越DPSCS（DPSC-OG），如图2所示。成纤维细胞样细胞开始从牙髓组织迁移到烧瓶平行订购了近5天播种后5天，10日，13日及18。
3. 全部牙髓之中使用这两种方法在通道3的图3中所示，这两种类型的稳干细胞几乎相同的大小...

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讨论

该协议描述了hDPSCs牙髓使用两种方法，酶解和牙髓组织的外植体干细胞的直接产物的分离和鉴定。此外， 在这些细胞的体外分化成成牙本质细胞，通过茜素红S的定量测定＆QPCR评估。

现有的协议，用于隔离从人类牙齿的牙髓组织已被用于各种仪器，如钳子（骨镊子）9，摘除手术中，针^29，格雷西刮匙^30，牙科裂缝毛刺^4，等，这些方法是?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录或地段。数	评论（可选）
的α-MEM	GIBCO	11900-073
I型胶原酶	Sigma-Aldrich公司	C0130-100MG
中性蛋白酶	GIBCO	17105-041
青霉素/链霉素	GIBCO	15140-122
两性霉素B	GIBCO	15290-018
定义胎牛血清（FBS）	胎牛血清	SH30070.03
L-抗坏血酸-2 - 磷酸	西格玛	A8960-5G
L-谷氨酰胺	GIBCO	25030-024
地塞米松	西格玛	D4902
β-甘油磷酸二钠盐水合物，BioUltra	西格玛	G9422-100G
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich公司	P5655
成骨检测试剂盒	密理博	PS01802031
同型对照小鼠IgG2b-PE	BD Pharmingen公司	50808088029
FITC小鼠IgG2b同种型控制	BD Pharmingen公司	559532
FITC小鼠IgG1κ型	BD Pharmingen公司	11471471
FITC / PE的小鼠抗人CD34/CD45	BD Pharmingen公司	341071
PE抗人CD146	BD Pharmingen公司	550315
单克隆小鼠抗人CD90/FITC	特嘉	00034418
PE的小鼠抗人CD73	BD Pharmingen公司	550257
抗H CD105/Endoglin PE的	BD Pharmingen公司	FAB10971P
PE的小鼠抗人CD11b/Mac1	BD Pharmingen公司	5553888
小鼠抗人CD44 PE	BD Pharmingen公司	555479
磷酸盐缓冲溶液（PBS）中	GIBCO	003000
70微米的细胞过滤器	鹰	352360
0.2微米针头式过滤器	新型Millex-GV	SLGV033RB
25厘米2的培养瓶中	Sigma-Aldrich公司	Z707481
			设备
BD FACSCalibur	BD	342975
multiskan微孔板分光光度计	Thermo Scientific的	51119200
Fleurcense显微镜	奥林巴斯
流动软件版本2.3.1