控制宫颈裂伤损伤小鼠

摘要

一种新型的技术来创建一个可重复的在体内脊髓型颈椎病在鼠标裂伤损伤模型。这种技术是基于对脊柱稳定固定的颈的侧面和使用的摆动刀片的精确度为±0.01 mm的脊髓裂伤。

摘要

利用转基因小鼠增强了我们的一些神经系统疾病，如脊髓损伤（SCI）的分子机制的理解。写意手动控制用于生产裂伤SCI模型创建不一致的受伤往往与暗恋或挫伤成分，因此，开发一种新技术。结合1）颈椎稳定椎小关节固定，2）增强脊髓暴露宫颈裂伤SCI我们的模型用写意的方法解决了固有的困难，3）建立一个可重复使用的脊髓裂伤的振荡片精确度为±0.01毫米的深度，而不相关的挫伤。如徒手使用手术刀或剪刀的创建SCI裂伤的标准方法相比，本方法已经产生了一致的病变。这种方法是非常有用的研究轴突再生corticosp原稿，红核脊髓和背上升大片。

引言

转基因小鼠的可用性是一个功能强大的工具来识别特定基因发挥作用机制SCI影响。裂伤SCI是一个重要的模型，用来研究治疗药物或分子可能提供有效的治疗，这次受伤后^8。由于难以把握参与维持脊柱内固定^5,11薄和脆弱的棘突固定在创建过程中裂伤损伤小鼠棘突是不精确。仅为0.2毫米（直径的10％的小鼠脊髓）的裂伤的深度的可变性导致的数据的误导性的解释。的性质和程度的脊髓裂伤病变的，必须精确地定义^10。为了应对这一挑战，我们已经开发出一种新技术，由椎稳定，并使用连接到路易斯维尔损伤系统装置的制造叶片（LISA）产生一个裂伤SCI ^7,14。这种伤害是由使用一个大幅振荡的刀片，避免组织裂伤过程中变形。裂伤的深度是通过使用微驱动控制裂伤深度为0.01毫米的精度精确。切割刀片是定制的，以特定的形状和宽度，以创建所需的裂伤轮廓^9。我们证明1）的方法，颈椎曝光，2）椎稳定的技术，使用双侧小关节固定装置，以及3）创建一个的宫颈裂伤损伤的使用振动叶片。

研究方案

1。动物脊柱稳定剂的制备及应用

鼠标颈椎凹腹面从横向视图。 C3至T1的棘突小而易碎，因此，不适合于稳定椎通常描述^3,4。我们建议进行横向面固定，脊柱稳定。固定装置由一个U形的金属通道，支持鼠标和两个可调节的不锈钢臂夹住各个方面的横向。这提供了极好的固定目标椎。脊柱内固定后，脊柱轻度升高颈椎曲率变平，以提供更好的暴露的脊髓。

1. 消毒手术器械以下：2-3双钳，2对microscissors，30 G针，缝合针器，皮肤剪辑，剪辑涂药。消毒脊柱稳定。 ANESthetize鼠标采用腹腔氯胺酮/甲苯​​噻嗪（100毫克/ 10毫克/公斤）的鸡尾酒。从鼠标的脖子剃了头发。
2. 皮肤清洁后用聚维酮碘溶液和70％的酒精，将鼠标移动一个加热垫加热走上手术台。包括动物的眼睛眼药膏，以防止角膜干燥。
3. 麻醉诱导后（达到当鼠标不响应的尾巴捏），使颈后正中皮肤切口从枕部皮下脂肪垫下颈椎。在放大倍率，执行正中切口，在C2之间的斜方肌和分裂半棘头癣肌肉。肌下脂肪垫的鉴定有利于正确层的夹层。
4. 中线肌肉解剖尾端延伸到T2棘突作为一个可靠的地标。剪切连接到T2椎骨的肌肉和移除软骨部为T2棘突。
5. 通过使用微型剪刀的一对T2薄层解剖从C2椎旁的肌肉。肌肉开始清扫相邻棘突及双侧小关节延伸。分开紧靠棘突和薄片（在骨膜层），以减少出血的肌肉。横向切面暴露后，将鼠标放在U形通道的LISA阶段。
6. 将不锈钢臂下方的暴露双边层面。武器一旦到位，拧紧拇指螺丝钢臂固定脊柱。保持坚定的目标椎固定，并提供了极好的曝光。臂可以进行调整，以提供精确的水平方向的脊柱。
7. 切开C5和C6之间的黄韧带，揭露相关硬膜。之间的层间空间，使用30 G针，创建一个小的durotomy通过它被放置microscissors延长durotomy。脊髓现正准备接受控制裂伤病变。

2。颈椎脊髓裂伤使用LISA设备的

1. 颈椎脊髓膨大的宽度变化在不同层面。于C5-6采用了2.3毫米的平刃背侧半切病变的设置的振动的振幅，以覆盖整个宽度的脊髓。叶片获得精细的科学工具公司（福斯特市，CA），并修改为脊髓挫裂伤。维持在≥0.5毫米刀片振荡的振幅较低的振幅电平会削弱便于编码裂伤。
2. 脊柱定位稳定剂和鼠标的LISA阶段。该刀片被安装到LISA，其位置控制的微驱动器能够运动的三个范围。 图1中描述的激光干涉仪的组件和它们的功能。
3. 功率叶片振动开关。根据MAGNIFication，移动鼠标，使暴露的脊髓下方的振动叶片直接定位。
4. 支持鼠标对振荡片提升阶段。 “0”的位置被记录下来，当刀片勉强触及脊髓背静脉。测量的深度相对于“0”的位置的脊髓裂伤。
5. 舞台上的地位提升微驱动控制：一个微驱动器旋钮转360°0.25毫米提升阶段。因此，0.75毫米背半切损伤是由微驱动器旋钮转动3次。病变部位的准确度是±0.01毫米。当叶片开始以划破的脊髓，润滑用生理盐水冲洗手术野。脊髓的切削深度控制由垂直微驱动器是独立的视觉指导。
6. 一旦已达到预定深度时，转动振动开关。在理想的情况下，振荡刀片定位在升esion组织变形没有证据的差距。下阶段从切刀和使用棉花棉签清除血液和生理盐水从手术领域。止血自发地发生在<1分钟。
7. 松开鼠标脊柱稳定。约椎旁肌用6-0丝线缝合关闭皮肤伤口使用不锈钢米歇尔剪辑。

3。动物护理

1. 皮下注入1-2毫升生理盐水共恢复知觉时保持足够的水化和鼠标放置在一个加热垫的回收笼。
2. 提供水和软食品即兴和管理48小时手术后的止痛药。有没有必要背的脊髓半切后膀胱护理。

结果

固定目标椎生成精确小鼠脊髓病变是极为重要的。我们的脊柱稳定装置克服的解剖短鼠标颈椎棘突和腹部前凸的问题。颈椎暴露我们的颈椎稳定（ 图2）。我们的鼠标脊椎稳定装置是一个可靠的技术准备脊柱脊髓型颈椎程序。使用LISA病变部位的深度是精确到0.01毫米^6,13。精确的裂伤导致没有挫伤上面的病变/组织界面（ 图3）。 C57BL / 6小鼠背侧半切病灶的精确度表现在，在一项研究中，0.9毫米深的裂伤延长只是超出了中央管在每个标本病理切片证实脊髓¹轴突再生。所有这些动物的运动恢复编后这脊髓裂伤损伤。

图1（A）鼠标在脊柱稳定放在LISA阶段。上述振动叶片朝向撕裂的脊髓。微驱动器的控件都位于舞台下方，设计定位鼠标，在适当的地点。垂直的微驱动器控制病变的深度和倾斜旋钮控制脊髓的水平面上，以防止成角的裂伤。开关控制振动电机，另一个旋钮调节的幅度。（B）0.75毫米背半切裂伤病变切割完整的层拱门之下。

图2。 >（A）鼠标的脊柱稳定剂组成的U形通道和两个手臂和连接器。鼠标被放置在C槽用于颈椎脊髓损伤，胸脊髓损伤的T槽（B）颈椎被固定放置武器下的横向切面，然后锁定拇指螺丝。硬脑膜暴露薄层C5-6，C6-7，和C7-T1之间没有任何清除骨。

图3。四脊髓背角撕裂，在深度为0.5，0.8，1.1，和1.4毫米，在矢状视图（甲酚紫和曙红染色）观察描绘了高的精确度，使用这种技术。

讨论

椎稳定裂伤伤害到脊髓前已经获得棘突固定。颈椎前凸曲线和夹具附件易碎短颈椎棘突从C3通过T1鼠标防止有效的脊柱稳定。此外，使用刀片或microscissors用于在手动控制下，会导致显着的组织变形创建病变⁶的深度的可变性。这可能导致的误译数据，尤其是在轴突再生的具体途径研究。例如，备用背皮质轴突可能被误解为再生轴突，如果背皮质脊髓是没有完全横断的时间之破坏。这些挑战是可以克服的脊柱稳定装置通过使用固定在一个单一的水平和精确之破坏的脊髓的各个。此外，使用啊IGH频率振荡片产生了尖锐的破碎或相邻脊髓挫伤，裂伤无。该方法已被用于生产脊髓裂伤损伤的大鼠^9,12,14，与后续的修改，以产生胸髓撕裂老鼠^6。在目前的通信中，我们描述了在鼠标的创建可靠的宫颈裂伤病变的方法。

就脊髓前后径<2毫米，鼠标，精确的深度的裂伤病变的建立了可靠的实验模型至关重要。最小的变性病变的深度将显着改变轴突再生以及体积和行为研究的实验评估的结果。的损伤深度，使用这种方法的准确度为±0.01毫米，因为我们使用高精密微驱动程序来控制所述切割刀片的位置。此方法减少了不一致的情况其他模型中创建一个裂伤SCI相干。这种方法是特别有用的研究轴突再生的长的通路脊髓位于脊髓背半部，如皮质脊髓束，红核脊髓束和背侧升序道。使用这种方法，这些纤维束可以完全可靠地横切。在这方面，数据的解释的错误被最小化，从而提高对SCI的实验研究报告的可靠性。

综上所述，我们已经描述了一种新的技术来创建一个可重复的脊髓型颈椎病裂伤损伤在鼠标体内模型。这种技术是基于对脊柱稳定的颈的侧面和裂伤的脊髓使用振动叶片固定。使用这种方法在⁶老鼠背部的胸椎脊髓裂伤模型中，我们表明裂伤深度，组织学和紧之间的相关性行为恢复。这样的技术也被认为是可靠的由多个其它实验室^2,12。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice vertebral stabilizer	Louisville Impactor System		Stabilize and expose the cervical vertebra
LISA vibraknife	Louisville Impactor System		Produce the laceration injury of the cervical spinal cord
Spring Scissors	Fine Science Tools (USA)	15013-12	Skin and trapezius muscle incision
Spring Scissors	Fine Science Tools (USA)	15023-10	Separate muscles from the laminae
Spring Scissors	Fine Science Tools (USA)	15002-08	Incision of dura
Graefe forceps	Fine Science Tools (USA)	11154-10	Retract skin
Dumont #7 forceps	Fine Science Tools (USA)	11274-20	Muscle retraction (tip modified)(Fig. A)
Dumont SS forceps	Fine Science Tools (USA)	11203-25	Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B)
30G needle	Becton Dickenson	305106	Create a dural opening
6-0 suture	Ethicon	8806H	Close muscle and fascial layers
wound clip	Fine Science Tools (USA)	12031-07	Skin closure
Tribrom–thanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	90710-10G	Anesthetic agent
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com
Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps.