寿命测量<em&gt;果蝇</em

Nancy J. Linford; Ceyda Bilgir; Jennifer Ro; Scott D. Pletcher

doi:10.3791/50068

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摘要
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摘要

黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）是一个功能强大的模式生物，探索长寿调控的分子基础。该协议将讨论生成一个以人群为基础的重现性好，测量的长寿以及潜在的缺陷和如何避免它们所涉及的步骤。

摘要

老龄化是一个现象，就是在稳定的生理恶化，几乎所有的生物体中，它已审查的结果，减少物理性能和疾病的风险增加。个人老龄化是明显的年龄相关的死亡率增加，这往往是在实验室中测量的观测寿命在大样本的年龄相匹配的个人在群体水平上。实验，寻求量化的程度，遗传或环境的操作影响在简单的模型生物的寿命已经非常成功的理解方面的老化，延长寿命，预防与年龄有关的疾病在哺乳动物中是保守的类群和鼓舞人心的新战略。

飞醋， 黑腹果蝇（Drosophila melanogaster），是一个有吸引力老化的机制，由于其寿命相对较短，畜牧业方便，轻便遗传学研究的模式生物。然而，人口老龄化的措施，包括年龄特异性生存率和死亡率，即使是轻微的实验设计及环境的变化是非常敏感的，需要维护的持续时间老化实验，严格的实验室操作规范。这些考虑，一起实践需要仔细控制的遗传背景，用于产生强大的测量是必要的。事实上，有许多著名的推论寿命实验，酵母，蠕虫，果蝇和小鼠已追踪到环境或遗传的文物^1-4的争议。在这个协议中，我们描述了一系列的程序进行了优化，经过多年的测量长寿果蝇的实验室瓶。我们还描述了使用的dLife软件，这是由本实验室开发的，并且是可用于下载（ http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab /软件）。 dLife，加速吞吐量和促进良好做法，通过整合优化的实验设计，简化飞处理和数据采集，规范数据分析。我们还将讨论很多潜在的隐患在设计，收集和解释的寿命数据，我们提供的步骤，以避免这些危险。

研究方案

我们建议存储实验食品，酵母膏，和葡萄的琼脂平皿上，出现在协议中，在4℃下，在1-2个月内，并使用它们，只要模具和干燥设置不英寸的标准环境条件下的幼虫和成虫阶段涉及维护一个12:12的人力资源光线暗的周期和60％的相对湿度在25°C的苍蝇孵化器。

1。制备实验性食品的

幼虫的生长，我们使用修改后的加州理工学院，这是简称为CT在本协议中的中等^5。
我们建议成年果蝇（SY），包括糖（蔗糖）和酵母（冻干整体啤酒商的酵母）在2％的琼脂基，即已经被煮沸，辅以抗生素和抗真菌剂的饮食，和分布（10毫升每瓶^）6。食物应巩固和蒸发12-24小时之前存储。因为营养盐的环境substantially影响寿命，在烹饪过程中的一致性是至关重要的，在实验和实验之间的比较。
如果是要添加到成人的食物的药理活性剂，这种药物可以被混合成一小批粮食和分层（2毫升）在食品表面上，与接收含有车辆单独的层的控制小瓶。

2。一个活酵母膏的制备

结合5-6毫升的水，活性干酵母3克，拌匀。的一致性，酵母膏应该是一个光滑的花生酱。

3。的一个葡萄琼脂平板的制备

添加一个葡萄琼脂预混料的一包500毫升的蒸馏水在1000毫升容量瓶中，并按照包装上的说明，解散葡萄琼脂混合。
小心地倒了一层厚厚的混合物为100毫米的培养皿中，同时避免了泡沫的形成。预混料生产一包约14 GRA聚乙烯琼脂平板上。
让媒体冷却，并在室温下固化15分钟的盖子。板材可保持在4°C，包上保鲜膜，或立即使用。

4。收集同步蛋

在该协议中，使用的所有媒体即酵母，葡萄琼脂平皿上，CT和10％SY食品上，应该是在室温下。

铺2-3厘米直径在葡萄琼脂平板上的酵母膏层，并预留。
在CO _2焊垫的网格面朝下麻醉苍蝇，放置一个大鸡蛋收集笼。氮麻醉是CO ₂的替代品，一些实验室使用，可以生产高品质的成果。
用漏斗，转让150-200对苍蝇的蛋收集笼。
将葡萄的琼脂平板上，以覆盖开口端的保持架和固定用的端部帽。
莱在其一侧的笼子里，，直到苍蝇醒来。然后，保持笼子里，葡萄琼脂平板上侧下，在孵化器中过夜。
第二天，交换葡萄板一个新yeasted的葡萄板。只放直径大约1厘米的酵母膏的板的表面上。丢弃的^第一天葡萄板。
允许胚胎收集表面上的葡萄琼脂平板上16-22小时。一旦完成，收集的葡萄琼脂平板和丢弃父苍蝇。
葡萄琼脂平板的表面洗净用1x磷酸盐缓冲液（PBS）。鸡蛋可以用棉签轻轻刮动员。请小心不要划伤，损坏，或刮薄件琼脂，从表面板。与援助的漏斗，倒入到一个15毫升锥形管的洗涤过的蛋。
让鸡蛋定居管的底部，倒出上清，小心不要失去任何鸡蛋。剩余容量应约2-3毫升。
8-10毫升的PBS加入到试管中，并重复上述步骤2-3铁道部e时代的彻底清洗鸡蛋，直至上清液是明确的。摆脱残余酵母是在这一步的关键。
洗净后，沥干一切的上清液，直到剩余量为2毫升。分装到CT瓶使用大口径的移液器吸头32μl的鸡蛋。鸡蛋在吸头应紧凑，几乎没有液体吸气。这可以通过以下来实现插入移液管尖，深入到蛋沉降，并迅速释放柱塞吸。
广场种子，CT瓶在整个飞发展的孵化器。

5。收集的年龄相匹配的成人苍蝇

成人通常会从第9天开始E关闭。丢弃的第一天，地方瓶上的苍蝇出现在培养箱中培养过夜。这种做法将避免因疏忽而选择为早期emergents和允许的最大数量的同步苍蝇的集合。
16-22小时后，转让日龄的成蝇INTO 10％SY食品瓶。如果需要的话，可以收集一批又一批的第二天。
返回飞回孵化器，让苍蝇达到性成熟，交配，为期两天。记录转移到10％SY瓶作为成年的第一天的天。

6。排序苍蝇和长寿实验

麻醉麻醉垫的苍蝇，小团体的男性和女性进行排序，分成两组，用画笔。如果使用的是CO _2，这是至关重要的风险降至最低，以防止可能出现的持久的健康问题，可以妥协的完整的长寿实验。
将30苍蝇同性别的成单独的小瓶中。假设不均衡的人口和健康的后代的染色体，每一瓶应产生约3-4瓶了，每次性爱。成单独的小瓶等分苍蝇应该不超过3-4分钟，因此，在总，苍蝇只露出一个最大的麻醉9-10分钟。
重复步骤6.1-6.2，直到有8-10瓶重复，每个性别和实验性治疗。

7。设置Excel电子表格来跟踪长寿实验

我们建议使用随机化的实验条件下，为了避免与药瓶在孵化器中的位置的偏置，并掩盖样品瓶同一性实验者样品瓶位置，而不是分组小瓶。要做到这一点，首先分配一个随机的数字ID，每个瓶在电子表格程序，然后安排在托盘ID号瓶。如果您使用的dLife的实验管理软件，按照教程上的实验装置产生的ID号每小瓶。
（可选）如果您使用的是与dLife的RFID读取器或条形码阅读器，RFID或条形码标签附加到每个小瓶和关联的标签的小瓶中的数字ID在dLife。该程序会识别扫描时，每小瓶与读者和引导记录在电子表格中的数据在正确的位置。结合dLife一个标签阅读器的使用，大大减少了数据收集时间和记录错误。

8。保持长寿实验

的小瓶含有新鲜食品应该是在室温下为每个传输。

在实验期间，转移到新的小瓶苍蝇含有新鲜的食物，每2天（年轻女性），或每周3次（男性或女性，年龄> 3周）。此步骤将确保年轻女性的饲养环境，不破坏幼虫的存在。应完成转让无需麻醉，可诱发急性死亡，尤其是在旧的苍蝇（普莱彻，个人意见）。
每小瓶传输，记录年龄，老瓶算死苍蝇，死苍蝇进行新瓶。记录此信息，分别在在电子表格中的两列（无论是dLife的或自己的电子表格）。这将确保进行苍蝇不重复计算。总的死亡人数（死亡+进行）应至少等于进行苍蝇的数量从以前的传输。减去先前进行的苍蝇从总死亡人数的多少来决定的新的死亡病例。
一只苍蝇被认为是正确的审查，如果离开实验之前通过逃生自然死亡或意外死亡的。在这样的实验动物退出应订立一个单独的列在当天的飞行退出实验。删失苍蝇不会被记录为死亡（见下文）。
继续重复步骤8.1-8.2，直到最后的幸存者死了。要知道，一些苍蝇，苍蝇年龄可能在于在他们的后面，出现死因为他们不积极。因此，当计数进行（死）的苍蝇，点击上侧的小瓶，以确定是否有腿的动作。如果是这样，THESË苍蝇还活着。在苍蝇的情况下，仍然坚持的老瓶，但活着的食物，他们不应该被算作死亡，应进一步挖掘的小瓶撞出飞救出。如苍蝇审查应谨慎使用，因为它可能会导致实验偏差。

9。数据分析

存活曲线显示一个人生存的概率，一个给定的年龄，通常计算用Kaplan-Meier法（ 图1）。在右删失数据的情况下，该公式可以简化这个年龄特有的生存年龄为x（S _x）的数除以个人活着，在开始的人口普查时间的年龄为_x（N×）在实验中的苍蝇的总数（N _{0），S =的} N×/ N _0。 9.2）的存活曲线的数据呈现的最常见的形式，并且它们可以测试使用log-rank检验群体之间的平等。合理的推论，可以得出从50-100个人的队列中。存活是一个累积性的措施，但是，并因此死亡，不老化相关的，如那些在生命的早期，会抑制生存的整个生命周期难以确定的影响，具体的老化。
第二个数据可视化方法是特定年龄的死亡率功能，它会显示每个年龄区间，并提出了更细致入微的描述生存数据^9,10死亡的风险。死亡率措施是独立从一个到另一个年龄，和死亡率曲线的形状推理有关的动态老化是有用的，特别是当治疗成年生活期间调整。特定年龄死亡率的估计，但是，缺乏小样本尺寸精度和准确度，而且往往需要数个到数百个的每个队列一个可靠的ES志盈^11。
估计寿命差异的其他方法，包括参数（例如贡佩尔茨）和半参数（如 Cox回归）模型。这些模型可以是强大的，但应谨慎，因为假设的死亡率曲线的形状和性质的治疗效果，这可能会导致不正确的推论^11,12。