在激光诱导轴突病变张力释放测量评估轴突在Piconewton和毫秒级的分辨率对基材的附着力

摘要

我们测量了张力释放部分病变进行附着膜的轴突的光学捕获探针上的的同时力显微镜测量用激光剥离器通过在一个轴突。所开发的实验协议评估轴突的培养基材的粘附性。

摘要

一个发展中的神经元网络的功能连接的形成是受外部线索。神经突起生长发育中的神经元受到化学和机械信号的机制，感知和响应机械信号却知之甚少。阐明细胞的成熟过程中的力的作用，使支架的设计，可以促进细胞粘附和细胞骨架耦合到衬底，因此提高损伤后再生的能力，不同的神经元类型。

在这里，我们描述了一种方法，同时力光谱测量应用在激光诱导的细胞病变。测量张力释放部分病变轴突附着膜的轴突的光学捕获探针通过同时干涉跟踪。我们的实验协议检测的张力释放与piconewton灵敏度和动态的张力释放毫秒级的时间分辨率。因此，它提供了一个高分辨率的方法来研究细胞和基片之间的机械耦合，可以调制的药物治疗和/或通过在基板的不同的力学性能。

引言

光学显微镜是一种较少侵入性的成像系统，可观察活细胞。随着开采的辐射压力（如在光学镊子^1），或高能量光子通量（在激光剥离器^2）的影响，如，这种技术被扩展到纳米操纵。的光学成像系统，可视化和操纵子的细胞的目标^3。提供精确的控制。与此同时，得益于精确标定交付的激光功率，光工具完成软或侵入性的样品操作，以前所未有的重现性。

几个实验室的集成，在相同的实验装置，光学镊子和激光剥离器，以消融细胞器^4，不同的细胞融合在一起^5星 ，或光学驱动的货物^6,7刺激细胞。虽然光镊后校准的光刚度，以便的作用力细胞一个piconewton规模的控制，激光剥离系统可以调节光学操纵，单细胞器或亚细胞结构的解剖消融范围从照片蒸发膜。然而，激光剥离校准依赖于光学操纵实体与定性评估的能量传递到样品，主要是基于图像分析说明形态的变化而引起的标本^8。在该方法中，我们将演示如何执行力在一个发展中的神经元轴突解剖激光光谱测量，量化，上piconewton规模，产生的力平衡，改变细胞骨架结构的亚细胞室^9。培养神经元坚持为基材，并在开发过程中两极化。极化阶段发生在第一天的体外 。在第二阶段的偏振，的EXTRUD之一的神经突起变长，它会分化成为轴突^10。轴突生长锥伸长响应牵引力先前已为蓝本由Dennerl的模型^11。最近，这种模式被扩展¹²包括突起粘附到细胞外基质底物的作用。这种生物物理模型，实验观察¹³后提出，表明拉力沿神经轴突生长锥，传播，调制焦点粘连基板。同样，轴突病变向细胞体中传播产生了一个局部的张力释放。因此，我们建议，测量等发布张力之间的病变沿轴突和胞体的位置，提供阻尼结果不受影响的焦点粘连的可能性进行评估。

我们校准所需的能量的光子通量的激光剥离器来控制的程度，造成了轴突damagE，完全横断局部病变。校准之后，我们重复部分病变几个分化的神经元的轴突和发展的协议的张力解除量化，从而得到一个量化参数估计的轴突到基板¹⁴的粘附。

在目前的工作中，我们详细描述了所开发的协议，即代表了精确的实验程序评估和比较与piconewton灵敏度的轴突对基材的附着力，在不同的实验条件下，如化学处理^14，或不同类型的细胞培养支持。

研究方案

1。光学设置

整个光学系统的前面描述的^15。简单地说，是根据光镊系统镱连续波（CW）光纤激光器1064 nm处（IPG激光GmbH公司）。空间光调制器（SLM）（LCOS-SLM模型X10468-07 - 滨松）传入的红外激光束来控制培养皿上由计算机生成的全息图捕获焦点的位置不同阶段。蓝镊子软件免费提供的（网页连结设备表）产生全息图投射在空间光调制器。武力干涉仪光谱测量，四象限光电二极管的（QPD，S5980与C5460SPL 6041板 - 滨松）和一个光电二极管（PD，PDA100A-EC - Thorlabs公司）的基础上。

激光剥离源是次纳秒脉冲UV Nd：YAG激光波长为355 nm，力晶（PNV-001525-040纳米紫外激光脉冲 - 天河城光电）。一个声光调制器（MQ110-A3-UV，355nm处的熔融石英-AA-光电），控制传递到样品的紫外激光的功率。

集成的全息光镊和激光微解剖上的变形的正立显微镜（BX51 - 奥林巴斯）配有60X，0.9 NA水浸渍显微镜objective.The阶段是由一个3轴直线直流电机微定位系统（M-126.CG1的，物理仪器）背着一个独立的3轴压电纳米定位的阶段（P-733.3DD的，物理仪器）相结合的样品粗动亚纳米分辨率的压电阶段。的显微镜载物台系统配备有两个控制循环协同作用捕集焦点维持在合适的位置，这取决于所选择的工作模式（位置或力钳，静态或动态的^）16。特别是，一个内部反馈回路作用于压电体的阶段，保持在胎圈，在一个专ED从陷阱中心的距离。其它外部回路控制利用跨越的区域更大范围内的面积的比其行程¹⁷由压电致动器的电动载物台的位置。当压电阶段达到在一个方向上的行程的限制，外部环路移动在相反的方向，从而在压电微阶段恢复朝向其中心位置，因为它是跟踪被困珠粘附到样品。当压电阶段达到其场范围的中心位置，微阶段停止。 ^16,17 Guiggiani 等报道了该系统的进一步的细节。

珀耳帖元件（的QE1电阻加热TC-344B双通道热水器控制器 - 华纳仪器）控制在显微镜下的细胞培养的温度（37°C）。在文化，pH值和湿度保持在生理条件下，通过曝气定制设计的聚二甲基硅氧烷（PDMS）的套筒（集成显微镜物镜）与加湿卡波金（95％O _{2，5％CO 2）。}

2。细胞培养制备

所有实验的协议是由意大利卫生部批准。原代培养小鼠海马（C57BL6J，查尔斯河）获得在胚胎18天（E18）。

1. 镀在玻璃底培养皿中的25000个细胞/ ml的浓度为（P35G-0-14-C - 公司MaTek）神经元。低浓度的培养的细胞是必要的，以避免形成致密的网络已经在第一天的体外 。上面的提到的细胞浓度，发现没有连接到其他细胞具有较长的神经突起的分离的细胞的可能性高得多。

3。珠涂层

1. 涂有聚聚合物微球（直径4微米，COOH终止刘海实验室的，产品代码PC05N/6700）-D-赖氨酸的polyLink蛋白偶联试剂盒（Polysciences的，产品代码19539）中描述的程序之后。珠子都涂有用于弥补文化的支持和青睐细胞粘附分子。

4。选择隔离神经元。分离珠文化基板，陷阱和移动下一步的神经

1. 文化培养皿放在显微镜舞台上。重点对样品阶段运动后，纠正设置科勒照明的照明目标冷凝器的位置。对齐的照明光学系统，设置Kolher照明条件是必要的，以改善亮场成像质量。利用这样的对应条件下，它也需要最大限度的红外激光的收集效率（通过客观冷凝器），从散射被困探针，来执行其干涉跟踪的QPD和PD。
2. 用移液管在几微升的包衣的微球原液培养皿。微将存款和坚持文化衬底。注入培养皿微升的数量依赖于微球浓度的储存溶液。理想的状况是有一至两微每成像视野。当过多的微球加入到培养皿中，它们已经可以随机附加的培养的神经元。
3. 在培养皿中四处移动，寻找一个孤立的神经元具有较长的神经轴突（轴突），在显微镜阶段保存的位置。
4. 走动，搜索珠坚持的文化支撑。
5. 打开IR俘获光上。在这个阶段，没有全息图投影（SLM）和红外激光光斑的位置与紫外激光的光点位置一致。设置红外现货2-3微米以上的文化支撑表面上，通过显微镜载物台运动的轴向位置。
6. 置紫外激光功率小于1μW传递到样品。该先前已校准的紫外激光剥离器^14：
   5-6μW被烧蚀玻璃支撑
   4μW神经元的连接完全解剖
   2.5μW部分病变神经突
   <1μW冲击波在培养皿中产生。光冲击波强大到足以分离珠玻璃支撑。
7. 开启紫外激光，而留下的红外激光，移动UV点以上坚持珠显微镜阶段运动。在胎圈从表面分离，并且被困住的红外激光。然后，关掉紫外激光。
8. 移动被困胎圈几微米以上的玻璃支撑（20-30微米）。起重珠到这个位置，防止它与其他细胞接触，而它正在走向先前选定的神经元。使珠先前保存的舞台上的地位。阶段速度设置为较低的值（10微米/秒），以便拖动流体的力不超过光阱平力。

5。移动陷阱的位置，就由计算机生成的全息激光剥离器现货和轴突位置，并校正光学镊子刚度

1. 将胎圈朝向玻璃支撑，以可视化的轴突。以上的细胞被保持在胎圈（约5μm以上的玻璃支承），以避免接触。
2. 移动显微镜载物台移动的UV轴突的宽度的中心的焦点。保存当前舞台上的地位。
3. 将IR的焦点位置由计算机生成的全息图。在此步骤中，在先前步骤中所选择的位置是停止的阶段。当投射在SLM的计算机生成的全息图，被困珠移动相对于轴突。移动IR激光光斑有被困珠神经突起的中心对齐，与UV激光点为中心的相同的神经突的太多。沿神经轴突的红外点，从而定位被困珠5-10微米远离UV点。我们的位置移动的红外光相对于突起的几何形状取决于UV点。的位置的情况下，光镊SLM的系统都没有配备，可以是多种多样的，通过倾斜的反射镜，或声光偏转器上的IR光路。 5-10微米的远红外激光光斑可能被定位从解剖梁与被困的探头，它可能会影响它的布朗运动和改变力显微镜的痕迹，以避免光学作用的UV点。
4. 在定义新的IR现货头寸UV点和轴突的位置，移动定位被困珠远离轴突和避免碰撞的舞台。被困胎圈的轴向位置移动到约2μm以上的玻璃盖。
5. QPD对准中心的干涉条纹：x和y QPD差分信号是零QPD中心时。收购5秒的布朗运动被困珠干涉米，在50 KHz采样率。获取刚度（PN /纳米）和灵敏度（V /纳米）的光陷阱功率谱方法^18。

6。将珠轴突。执行干切断同时测力

1. 提高被困珠约4微米以上的玻璃盖的位置，并将其移动到之前保存的舞台上的地位（见第3.2步）。
2. 将被困珠轴突向下延伸，直到它接触的神经轴突。被困的胎圈和轴突之间的碰撞情况是由在z QPD被困胎圈在轴向方向上的位移信号检测。
3. 等待10秒被困珠推反对的轴突有利于它的突起膜的附着力。
4. 移动微阶段位移轴突被困珠，从而验证其在细胞膜的粘附性。如果珠坚持，从光学陷阱逃脱。
5. 回迁激光陷阱粘附珠切换与受力情况等于零力钳循环。在这样的方式中，压电阶段重新定位的胎圈，连接到电池上的光陷阱中心。如果系统没有一个反馈环路控制激光陷阱的位置可以移动显微镜阶段中心上坚持的探头。陷阱的中心时达到QPD胎圈会被捕获，未粘附的细胞（x和y QPD信号等于零，则在z QPD信号给出了相同的电压的和四个象限的信号是相同的当被困住的胎圈从任何表面）。
6. 设置捕集激光定位在z轴上，稍为超过所述胎圈的中心（约100nm），以产生预张力附着的捕获探针上的力钳条件。光阱的位置的情况下，系统没有配备的力钳控制，可以在显微镜载物台的步长为25nm上升。在z QPD信号允许监控。因此，使用氏S信号来设置相对于附着的探针的位置的激光陷阱。这样的预张力所需的感测轴突损伤后的膜的应变，以及因此而减少附着的探针的布朗运动。已经提出了一种类似的方法测量的张力释放，在由视频成像¹⁹的膜系绳。
7. 开关关闭力钳反馈测量附着的探针上的力的位置钳条件（压电阶段被阻塞）。
8. 开始被困探头位置的同时记录通过干涉仪（20 KHz采样频率），细胞在激光切断后的时间推移明场成像（20赫兹帧速率）。
9. 开启紫外激光提供激光​​脉冲，直到病灶变成可见图像的轴突（一般需要200-400光脉冲，每个脉冲的能量：25新泽西），然后关掉紫外激光。
10. 约3英里干涉继续录制N，直到x，y和z QPD痕迹达到一个高原。

7。量化总张力释放

1. 转换录制的QPD的痕迹（以伏特为单位），由校准的灵敏度的光阱，在纳米取得各自的痕迹。
2. 过滤器的x，y和z位移的痕迹通过一个高通滤波器，带切断为10赫兹。
3. 计算的总方差占被困珠的布朗运动的过滤后的痕迹。方差计算步长在25毫秒，500毫秒（10,000个数据点^）20重叠的时间窗口。高通滤波的痕迹，排除了布朗运动的变化，由于膜的波动或皮层肌动蛋白的运动。在胎圈的布朗运动，在细胞膜上的的光学力和粘附力减少。当膜紧张由于张力的释放，增加其粘度，从而在胎圈的布朗运动，立即检测到采用干切断后，开始减少。
4. 定义T0：的布朗运动的方差减少的开始，在交货后的紫外激光能量。时刻t0表示膜应变的开始。
5. 定义T1：年底减少了布朗运动的方差（当它到达高原）。的时间瞬间t1表示结束膜应变。
6. 进行视频跟踪的碎片或刮盖玻片上的支持，来衡量任何样品漂移的测力。要跟踪的颗粒在玻璃上的支持，我们首先应用阈值的明视场图像，获取一个栈二进制图像的黑色背景上的白色颗粒。然后，我们跟踪的粒子的质量中心的亚像素精度（使用软件ImageJ软件）。
7. 中减去测得的漂移来自位移QPD的痕迹。由各 ​​自的光学校准刚度（K _X，K乘以漂移校正QPD痕迹 _{Y，K Z）获得FX，FY，FZ piconewtons的痕迹。}
8. 计算总兵力跟踪F _TOT =√（FX ² +风云² + FZ ^2）。
9. 计算总发行T0和T1之间的力F = F _{发布TOT（T1）} - F _{TOT（T0）。}要减去在t0测量的力，因为它是由于探头从陷阱中心的位移，在胎圈的神经突的附着。
10. 计算被困珠和紫外激光光斑位置突起之间的接触面积亮场图像测量长（L）和短（D）轴之间的神经轴突被困珠和紫外激光光斑位置。轴突接触面积A _轴突 =长x D.
11. 规范化_公布总释放的力F 轴突接触面积A _轴突 。

结果

细胞产生牵引力在基板上，其焦点粘连。细胞骨架元素产生的力处于平衡状态的培养基材的反作用力。激光诱导后的神经突的病变，有些紧张的细胞骨架电缆被破坏平衡的张力被释放，因为基板的附着力的反作用力消除。张力释放部分地分布于未受影响的粘着斑，胎圈附着在细胞膜上，保持在一个光阱，测量等释放的部分未抵消基板锚定细胞的细胞骨架元素（见示意图图1） 。

讨论

我们报告了这项工作的定量方法比较突起文化基板的附着力，同时执行力时的光谱测量激光诱导的细胞病变。测得的张力释放基板的细胞粘附的程度有关：细胞具有较高的粘着斑的数目应释放张力小。测量张力的释放在piconewtons方面提供的物理量评价轴突粘着培养支持在不同的实验条件下^14。

几个实验室与光镊系统集成的激光剥离，采用独特的光学设计^23。我?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated	Bangs laboratories	PC05N/6700
PolyLink Protein Coupling Kit	Polyscience	19539
EQUIPMENT
IR laser	IPG Laser GmbH	YLM-5-SC-LP	ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization
Spatial light modulator	Hamamatsu	LCOS-SLM 10468-07
Blue-tweezers software	Optics group, University of Glasgow	Free downloadable software	http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/
ImageJ	Hamamatsu	Free downloadable software	http://rsbweb.nih.gov/ij/
QPD	Thorlabs	S5980 with C5460SPL 6041 board	Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement
PD	Teem Photonics	PDA100A-EC	Photodiode to measure z trapped probe displacement
nano-Pulse UV laser	AA-optoelctronics	PNV-001525-040	Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps
Acoustic Optic Modulator	Olympus	MQ110-A3-UV, 355nm fused silica
Upright microscope	Andor	BX51	Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective
CCD	Warner Instruments	V887ECSUVB EMCCD
Peltier device	Physic Instruments	QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller
Microscope stage: micro+piezo stage	National Instruments	Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD
Daq		NI PCI-6229	Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage
Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine			Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop