神经干细胞和祖细胞在小鼠脑开发基因毒性应激后的评估细胞周期进程

摘要

胸苷两个类似物管理，埃杜和BrdU，在孕鼠允许在神经细胞和祖细胞在胚胎小鼠大脑细胞周期进程的分析。这个方法是有用的，以确定基因毒性应激，包括电离辐射，脑发育过程中的作用。

摘要

从不同类型的神经干细胞和祖细胞（NS​​PC），它形成一个假复层上皮衬里胚胎脑的侧脑室脑发育过程中产生的大脑皮层神经元。遗传毒性压力，如电离辐射，对发育中的大脑与NSPC的高灵敏度非常有害的影响。所涉及的细胞和分子机制的阐明依赖于这些特定类型的细胞中，DNA损伤反应，需要一个准确的方法通过细胞周期来确定受损组织NSPC进展的表征。这里显示的基础上的EdU和BrdU对孕鼠和进一步检测在胚胎大脑冠状切片这两个胸腺嘧啶核苷类似物的连续腹腔注射的方法。的EdU和BrdU都在复制细胞的DNA在S期注册成立，并通过两种不同的方法（叠氮化物或检测的特异性抗体，分别），这有利于它们的同时检测。的EdU和BrdU染色，然后在其从心室率在背端脑的标准区域距离的函数确定每个NSPC核。因此，这种双标记技术允许区分细胞，通过细胞周期进展从那些在DNA损伤反应已经激活细胞周期检查点，导致细胞周期阻滞。

实验的一个例子给出，其中的EdU被照射和BrdU前后立即注入和分析的4小时内下照射进行。这个协议提供了NSPC在细胞周期在它们已经被照射的相位的函数的急性DNA损伤反应的精确分析。这种方法是很容易的转座到许多其他系统，以确定在生物体组织上的细胞周期进展的特定治疗的影响。

引言

在胚胎脑发育，在脑室区产生的大脑皮层的投射神经元中，假复层上皮的不同类型的神经干细胞和祖细胞（NS​​PC）所组成的行侧脑室。其中NSPC，径向胶质细胞（RGC），其作为神经干细胞，经过interkinetic核迁移（INM）:它们在心室和心室区的基极限的S-相的表面进行有丝分裂（VZ） ^1，2,3。它们可分为两种对称地产生两个RGC或不对称，以生成一个RGC和一个神经元或中间祖细胞（IPC）的^4，5。工控机迁移到上覆的增殖层称为脑室下区（SVZ），其中最后一个对称分裂后，便产生两个不成熟的投射神经元^6-8。相反，研资局，IPC不进行^INM（9审查）。新生成的神经元MIGR吃了径向沿径向纤维通过中间区（IZ）到达其 ​​最终目的地，皮质板^{（CP）10，8。}所有这些事件的最佳时机是正确的皮质发育至关重要。例如从扩散切换到神经祖细胞群分化是由G1期持续时间^11，12控制。 G1期的延长，细胞分化从而关联。

基因毒性应激，如电离辐射，严重危害大脑的发育^（13审阅）。我们和其他人已经表明，NSPC是极易受辐射诱导的细胞凋亡^{14，15,16。}电离辐射诱导DNA双链断裂是对增殖细胞的最严重的损害。 DNA损伤反应（DDR）的循环细胞的一个重要组成部分是细胞周期检查点在G1 / S期或G2 / M期的转换或S在激活相（内S检测点^）17-21。他们阻断细胞周期进程，为DNA损伤修复或消除过于受损细胞的提供时间。因此，细胞的死亡，以及延迟细胞周期进程可能改变大脑发育响应于电离辐射曝光^22-24。因此，这是有趣的，开发一种方法，以评估在NSPC细胞周期检查点在被照射的小鼠胚胎脑的活化。

在细胞周期的进展是经常随后使用的胸苷类似物，5 - 溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）标记的掺入。在细胞周期中，当DNA被复制的S期的BrdU掺入。使用针对的BrdU抗体，该抗体的允许细胞，是在S期的BrdU的脉冲期间的随后的检测。

一种新颖的胸苷类似物，5 - 乙炔基-2'-脱氧尿苷（EDU）由叠氮化物的荧光检测。不同的方法来检测的EdU和乙 RDU不交叉反应的^25，使同时检测两个胸腺嘧啶的类似物，它是细胞周期进程的研究是有用的。通常细胞却先脉冲用EdU，然后用脉冲的BrdU，其中两个法团之间的时间持续两小时^25，26。在含有的EdU培养基另外的BrdU导致优先掺入的BrdU到DNA用EdU的排除，而同时加入的EdU ²⁵与等摩尔或等摩尔的一半的BrdU向媒体结果中只BrdU掺入^27。这简化了通过消除通常须从培养基中取出的第一个标签之前加入第二标记物的洗涤步骤的双标记方法。这也就是， 在体内研究中，在洗涤步骤是不可能的，以确定进入S期或细胞群体的出口处的准确定时的特别的兴趣。

吨">最近，已开发了在使用的EdU和BrdU ^23，24,22胚胎小鼠大脑的双脉冲标记的方法来分析细胞周期进程和NSPC的INM后在子宫内的辐射，而且它已被证明的是，在S期，小鼠细胞首先复制常染色质区域，然后在臂间异染色质^28,29,30。有趣的是，聚集在interphasic核不同染色体臂间异染色质形成异染色质灶也被称为chromocenters和DAPI染色不易察觉的亮灶。因此，常染色质和chromocenters的差的EdU和BrdU染色有助于我们分析更精确地NSPC S期的进展。

这种方法允许的明显缺乏G1 / S期检查点在NSCP ^22-24，这是相当令人惊讶，因为这个检查站被认为是对基因组稳定性的关键示范。几个EXP基于对的EdU和BrdU脉冲的各种组合erimental设计已经用于分析细胞周期进程中的腹侧和背侧端脑。这里，我们给协议允许NSPC 在 E14.5小鼠胚胎的子宫内的辐照后的急性DNA损伤的前4个小时内的学习的例子。

研究方案

1，动物规程

该协议已经被设计符合欧共体理事会指令11月24日，1986（86/609/EEC），并已通过了动物福利（CETEA-CEA DSV IDF）机构委员会。

1. 注射用EdU /的BrdU和E14.5孕鼠照射（ 图2A）。
   1. 制备的EdU的溶液在1毫克/毫升和BrdU在5 mg / ml的PBS中。执行腹腔注射100微升的溶液的EdU使用25号针头成孕鼠（IP）。 1.5小时后，照射小鼠（全身照射），在0戈瑞或2戈瑞（0.6格雷/分钟）。紧接在后，用25号针头进入孕鼠注射（IP）的200微升的BrdU溶液。
2. 制备胚胎的大脑冠状切片。
   1. 在1小时或4小时照射后，通过二氧化碳安乐死的孕鼠。
   2. 打开腹腔CAVITY超过用剪刀3厘米。通过切片角的两个末端从子宫的其余部分分开的两个子宫角。转移子宫角到含有PBS 0.6％葡萄糖的培养皿中。为了分离胚胎打开子宫角用钳子。删除使用镊子每个胚胎的羊膜囊。
   3. 解剖胚胎头与钳和4％多聚甲醛（PFA，pH值= 7.4）O / N修复它们浸泡在4°C。
   4. 在4℃下冲洗胚胎头在PBS中的至少一个夜头可以保持在PBS中数天。
   5. 使用真空浸润处理器 ，如表1所示在石蜡中嵌入的头。头嵌入也可以根据化学罩在一个65℃的烘箱中的石蜡浴进行乙醇和xylen浴，然后。
   6. 准备5微米厚的冠状切片，用切片机。
   7. 安装到多聚赖氨酸包被的载玻片。
   8. 幻灯片可以保持在室温（RT）下持续数月。

2，教育/的BrdU染色

1. 脱蜡和抗原修复
   1. 通过幻灯片浸泡在甲苯5分钟的3浴Deparaffinize石蜡包埋脑切片。
   2. 补充水分在2浴室降低乙醇浓度的各溶液中3分钟，如以下:乙醇100％，95％乙醇，70％乙醇和5分钟的H ₂ O。幻灯片可以保持在去离子水中几个小时。
   3. 煮沸的切片中的柠檬酸溶液（10mM，pH为6）10分钟，然后孵育在去离子水中5分钟。
2. 染色的EdU
   1. 根据制造商的方案进行的EdU检测。透化的细胞用0.5％的Triton X-100的PBS中为10分钟。
   2. 通过稀释于去离子水中的10倍的溶液制备1X的EdU缓冲添加剂。此溶液应新鲜制作，并于同达使用年。
   3. 准备的EdU反应的鸡尾酒，包括的EdU的Alexa Fluor 488叠氮化物。添加的成分如下表2中所列的顺序，否则该反应将不会进行优化是非常重要的。内准备15分钟用埃杜反应鸡尾酒。
   4. 除去透化缓冲液（步骤2.1.1），然后用PBS洗两次。
   5. 添加150微升的EdU反应混合物，把盖玻片，并温育在黑暗中在室温下30分钟。
   6. 删除埃杜反应鸡尾酒，然后用PBS洗一次。
3. 的BrdU染色
   1. 制备饱和缓冲液含7.5％山羊血清和PBS中的7.5％的胎牛血清。加入150μl的饱和缓冲液对脑切片，放盖玻片，孵育1小时在室温阻断非特异性抗体结合。
   2. 取出盖玻片。加入150μl稀释在饱和缓冲液1/300鼠抗BrdU一抗，把盖玻片和孵化的O /n在4°C。
   3. 取出盖玻片，然后在PBS中洗涤3次。
   4. 加入150μl在饱和缓冲液中稀释为1/400的山羊抗小鼠Alexa594第二抗体，将一个盖玻片，并孵育1小时，在室温下。
   5. 取出盖玻片，然后洗一次在PBS。
   6. 核染色:加150微升4'，6 - 二脒基-2 - 苯基吲哚（DAPI）在1微克/毫升的PBS中，把盖玻片并孵育在室温下2分钟。
   7. 在安装介质安装滑轨。

3。分析

1. 检查脑切片用20X物镜或激光共聚焦显微镜，荧光显微镜下，在3个通道（488纳米，594纳米和UV）获得的图像作为分开的文件。
2. 堆栈用Photoshop软件映像。
3. 在背内侧脑壁的标准部门分析脑切片。这个扇区是100微米的在其内侧 - 外侧尺寸和被分成10μ18箱（或更多）使用叠加在图像的网格（ 图1），在其径向尺寸米高度先前描述^31。
   1. 网格对齐诸如第一bin是否在心室表面，其平行于心室边界长轴。然后按数字标记EDU，的BrdU和/或细胞核固缩（对应于凋亡细胞）在每个箱。号位于在当中载有其较大的部分，或者在较低的垃圾桶，当原子核占据了两个垃圾桶内相等面积的bin两个垃圾桶的边界上的核心。
4. 统计分析。

分析每个胚胎的至少两个皮质切片。对来自不同窝的至少3个胚胎重复实验。结果应以平均值（SEM）的平均值±标准误差。统计分析与GRAPHPAD棱镜采用双因素方差分析和Bonferroni多重比较进行事后检验进行。

结果

在图2中描述的实验中，埃杜给药1.5小时照射和BrdU刚照射后前。四种类型的细胞，然后在1或4小时后照射制备的皮质切片区别，根据任一的EdU或的BrdU，双方或无的掺入（ 图2A和2B）。重要的是，既没有的EdU也不BrdU掺入改变辐射诱导的细胞凋亡（数据未示出）的电平。此外，该染色方法允许在S-期DNA复制过程中EDU和BrdU的唯一的检测中，而没有相应的灵敏度来检?...

讨论

这里所描述的基础上的EdU 1.5小时掺入实验设计照射前和BrdU的掺入允许照射后立即NSPCs能够激活S期和G2 / M期检查点，但第¹小时过程中没有在G1 / S检查点之后的一个示范基因毒性应激在胎鼠大脑。我们进行了在其中的EdU已经注入在不同时间照射和BrdU后，才刚刚1小时小鼠牺牲其他的实验中，让我们特别欣赏进入S期的速度。这些实验表明，NSPC不激活G1 / S期阻滞在体内 ^22,23基因?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
EdU	Life Technologies	A10044	1 mg/ml
BrdU	Life Technologies	B5002	5 mg/ml
IBL 637	CIS BIO International
Tissu Tek VIP	Leica
Microtome	Leica	RM 2125 RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	93443
Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit	Life Technologies	C10083
Anti-BrdU	GE Healthcare	RPN202	1/300
Goat anti mouse-Alex594	Life Technologies	A11001	1/400
Fluoromount	SouthernBiotech	0100-01
Polysine slide	Thermo scientific	J2800AMNZ
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
PBS	Life Technologies	20012-068
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Microscope BX51	Olympus
Confocal microscope SPE	Leica
Prism software	Graphpad		Version 5.0c
Photoshop software	Adobe