Nanopodia - 薄，易碎膜预测与细胞运动和细胞间的相互作用角色

摘要

Nanopodia很瘦但很脆弱的膜通道，向​​上延伸至100微米的细胞的领先的前面或后面尾随和检测的细胞环境。直接固定在较高的Triton X-100浓度为37℃，轻柔洗涤，并避免如乙醇，甲醇，丙酮或有机溶剂，并须遵守这些细胞结构。

摘要

贴壁培养细胞保持极化状态，支持移动和细胞间的相互作用。 Nanopodia是薄的，细长的，主要是丝状肌动蛋白阴性的内皮细胞和癌细胞膜突起，可以通过TM4SF1（跨膜-4-L-6家族-1）的免疫荧光染色进行可视化。 TM4SF1集群在100-300微米直径TMED（TM 4SF1Énriched微Ðomains）含有3到多达14个独立的TM4SF1分子。 TMED间歇地沿着nanopodia以1至3％μ米TMED并牢固地固定到nanopodia矩阵具有规则间距。这使得nanopodia从偏振内皮细胞或肿瘤细胞的前前或后后方延伸超过100μm，且使膜的残基上MATR被留下九时电池移开。 TMED和nanopodia被忽视了，因为他们的极端脆弱性和敏感性，以温度。常规洗涤和固定破坏的结构。 Nanopodia被直接固定在多聚甲醛（PFA）在37℃下保存，然后短暂暴露于0.01％的Triton X-100的染色之前。 Nanopodia在细胞生物学中打开新的局面：他们承诺将重塑我们的细胞如何感知他们的环境的认识，检测和识别其他细胞的距离，启动细胞间相互作用的密切联系，以及参与运动，增殖的信号传导机制，以及细胞细胞通讯。被用于研究TM4SF1衍生nanopodia开发的方法可以是用于通过经典四旋蛋白，特别是广泛表达CD9，CD81，和CD151的机构​​形成在其它类型的细胞nanopodia的研究是有用的。

引言

在极化运动，动物细胞延长了多种从它们的表面活力，细胞膜突起，其中包括丝状伪足，伪足，回缩纤维，和褶边^1。最近加入到这个名单是nanopodia，一个新认识的类型的薄（100-300微米，直径），伸长（可达50〜100微米长）投影膜提供的膜通道的F-肌动蛋白的结构，如丝状伪足的延伸和回缩纤维，而且染色水平与TM4SF1（跨膜-4-L-6家族-1）中培养的内皮细胞和肿瘤细胞^2,3。

TM4SF1是用四旋状的拓扑结构，最初被称为发现，即该分子是内皮细胞的生物标记物中起着内皮细胞增殖和迁移^2,3必不可少的作用前的肿瘤细胞抗原⁴的蛋白质。免疫荧光染色发现TM4SF1被定位于perinuc利尔囊泡和到质膜，并富含TM 4SF1ënriched微ðomains（TMED）。 TMED锚nanopodia到矩阵和存在于nanopodia 1-3 TMED /微米长度的规则排列的条带状花纹。 Nanopodia通常是从一个细胞的前领先，并延长电池的极化为移动中尾随后面。由于TMED的牢固附着的性质，nanopodia无法缩回到细胞，因为它移动远离;弃nanopodia残基从而描绘出蜂窝移动路径。 Nanopodia提供的膜通道的F-肌动蛋白的扩展和回缩，且细胞间的相互作用和通信^2,3的网站。这些特点意味着nanopodia提供研究细胞分化，对环境的感知细胞，测定细胞运动的路径和方向，和细胞间的相互作用过程中的F-肌动蛋白装​​配背后的机制一个独特的机会，一个ND通信。

由于TMED的高度疏水性质和nanopodia的薄和脆弱的膜性质，需要特别注意采取以保存TMED和nanopodia。 nanopodia和去除TMED由共同的实验室方法的破坏是一个可能的原因，只有63出版物自1986年¹它的首次发现和完全缺乏TM4SF1富集在100-300微米微区上的知识出现在TM4SF1细胞表面，直到TM4SF1的内皮细胞在2009年²报告。

常规的免疫染色方法通常使用像乙醇，甲醇，丙酮或有机溶剂来修复细胞，并使用0.1％或更高的Triton X-100浓度通透细胞^5。这里所描述的研究实现了三个重大变化，以常规方法揭示TMED和nanopodia：（i）使用37℃的4％PFA和修复细胞的3776，C培养箱，（ⅱ）申请温和室温下PBS中洗涤，并且（iii）使用低于0.03％的Triton X-100只简要地通透细胞除第一抗体之前，如曲通X-100 0.03％更高将提取TM4SF1。

所有四旋蛋白形成细胞膜上的⁶微区和在内皮细胞和肿瘤细胞中某些^2,3共定位与TMED。如像CD9，CD81，和CD151四旋蛋白被广泛表达，在这里所描述的染色方案可以扩展到那些缺乏TM4SF1对nanopodia功能的研究很多不同的细胞类型。

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研究方案

1。胶原镀膜玻璃磁盘细胞培养

1. 这里的玻璃盘（直径12毫米）在一个玻璃瓶（4盎司）和高压釜灭菌的光盘。
2. 把25毫升70％乙醇在50毫升猎鹰管，并将其放置在细胞培养罩。此溶液可以重复使用多次，直至该溶液的液面下降至20ml。
3. 用它来处理的玻璃盘前放置一个锋利的钳用极细点在70％乙醇5分钟。
4. 小心取出钳出管，盖上，然后轻轻将乙醇处理钳在管顶空气干燥2分钟。不要让镊子尖在引擎盖碰任何东西。
5. 用无菌镊子抢单无菌玻璃盘出来的玻璃瓶，并将其放置在24孔细胞培养板的孔中。重复，直到井所需数量已经填充了光盘。
6. 把500微升的牛胶原蛋白溶液（50纳克/毫升）到每一个包含一个玻璃盘，并将其放置在37℃，5％CO ₂的细胞培养箱中培养至少30分钟很好。有一个较长的潜伏期没有坏处。
7. 收获HUVEC（人脐静脉内皮细胞）或PC3（前列腺肿瘤细胞）已经长大150 MM细胞培养板，通过胰蛋白酶消化并利用其完整的培养基阻止胰蛋白酶的活性。收集细胞入15ml Falcon管中。
8. 计数细胞数量，并确保生存能力大于90％。
9. 通过在200×g离心10分钟，离心在4℃下沉淀细胞除去上清液。
10. 用培养基稀释细胞以10 ⁵细胞/ ml。放置在冰上的细胞。
11. 吸出胶原蛋白在细胞培养罩和轻轻地放在500μl的细胞悬浮液以每孔中，其中玻璃圆盘预先涂有胶原蛋白。 5×10 ⁴个细胞/孔在24孔板会给60％置信luency的HUVEC和30％汇合为PC3细胞。注：添加更多的细胞悬液更高的细胞密度。
12. 培养的细胞在37℃，5％CO ₂培养箱中培养1小时，2小时，4小时，6小时，或24小时来跟踪nanopodia活动和细胞传代。通常情况下，细胞会附着在玻璃盘里的前30分钟，然后开始分化和迁移中的第一个小时，并在下列时间进行细胞间的相互作用和细胞分裂。

2。细胞固定

1. 每个孔将需要500微升4％PFA（多聚甲醛）固定细胞。可商生产的或新鲜的4％PFA中都可以使用。计算需要的基础上制备的井的数量煤灰的量，然后将PFA中15毫升Falcon管中。注意：多聚甲醛是一种可疑的致癌物质。
2. 把猎鹰管的聚苯乙烯泡沫塑料的立场，已经到位的37℃培养箱中培养。离开管在孵化器30分钟战m，最高的煤灰至37°C。
3. 放置一个加热垫在培养罩并打开它。
4. 取出24孔细胞培养板和所述预热的PFA出培养箱，并将其放置在所述加热垫的顶部。
5. 用一只手来从井吸出培养基，紧接着用另一只手轻轻滑动，加入500μl的PFA入井通过井边缘。为了更方便地吸出，倾斜培养板在45°左右，倚靠在聚苯乙烯泡沫塑料的立场，使其稳定在那个角度。这将有利于愿望和添加PFA解决良好，没有文化干扰细胞。这是为了保持细胞活动的原来的细胞结构中最关键的步骤。
6. 重复上述过程，直到所有的井用玻璃盘已经收到煤灰。注意：需要改变的还有预现有的解决方案中的所有步骤将适用同样的愿望手续。
7. 将板在37℃下5分钟。
8. 就拿板回文化引擎盖和倾斜对泡沫塑料按照步骤2.5中所述。用一只手从井里轻轻地转移到煤灰收集管;用另一只手来之后立即放置至少500μl的室温PBS中的井。之后所有的孔都被冲走，返回和在每一个重复的PBS洗涤一次好。清空收集的煤灰成为危险废物的容器。
9. 通过加入2％胎牛血清的PBS来制备ICC封闭缓冲液。 0.04％的叠氮化钠（20％原液稀释）加入作为防腐剂。注意：叠氮化钠是一种有毒化合物。缓冲器可以存储在4℃的很长一段时间没有细菌污染。
10. 随着文化板块仍偏向反对立场，再次循环通过每个孔抽吸去除PBS中，随即加入500微升的ICC封闭液。细胞现在已经准备好进行免疫荧光染色。如果需要的话，固定的细胞可以被存储在4℃的冰箱中一周不显著损失TM4SF1蛋白质。

3。 Nanopodia的TM4SF1免疫荧光染色

1. 在各孔中，替换500μl的ICC封闭缓冲液与含有0.01％的Triton X-100的一种新的封闭缓冲液，并让它在室温下静置1小时。不要使用比0.03％的Triton X-100更高，因为它会从细胞膜中删除TM4SF1。 PBS洗涤细胞从步骤2.10，可直接移动到包含海卫一的封闭液，如果染色准备马上开始。
2. 稀释初级抗TM4SF1（或抗CD9）抗体以0.5微克/毫升在ICC封闭缓冲液。
3. 在每个孔中，取出ICC/0.01％的Triton缓冲液，并用300微升的反TM4SF1-抗体溶液替换。孵育2小时，在室温或离开过夜，在4°C。
4. 每个不小于500微升PBS洗好。重复3次;每次给于乐AST 5分钟的孵育时间。
5. 备中的第二抗体和鬼笔环肽溶液ICC封闭缓冲液中，用1000倍稀释的Alexa 488标记的驴抗小鼠二抗（2μg/ ml的终浓度）和1,000×稀释的鬼笔环肽（50纳克/毫升最终浓度）。
6. 除去PBS中，并加入300微升的二级抗体和鬼笔环肽溶液的各孔中，孵育2小时或离开它过夜，在4°C。
7. 重复PBS洗涤步骤与至少一个每次洗涤5分钟温育。在最后一次洗涤，每孔在PBS中1小时离开。
8. 降防褪色安装媒体上的载玻片一滴（约10微升）。
9. 弯曲的针头90°19 G 1½通过在坚硬的表面轻轻按压笔尖。用一只手握住弯曲的针，轻轻抬起玻璃盘从井里，并用另一只手用锋利的钳抓住光盘。
10. 把玻璃盘＆＃160;面朝下让于载玻片上的细胞相接触的安装介质。轻轻地放在玻璃盘，让它在室温下暗处干通宵。
11. 继续执行图像免疫荧光染色nanopodia，或存放在一个幻灯片框的幻灯片在-20°C。该幻灯片将在-20°C保持可见数个月

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结果

对于第1步：

如果细胞（如内皮细胞，并在本研究中使用PC3）都能够正常生长，细胞会附着在30分钟内的胶原蛋白涂层的光盘后，他们是种子，分化，成为移动不久之后，排在他们的道路的延伸nanopodia运动。 图1A和1B分别显示了极化和脐静脉内皮细胞的增殖。 图2A显示极化PC3细胞在移动状态。

对第2步：

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讨论

Nanopodia薄细胞膜通道，牢牢附着基质通过TMED，可以从一个极化移动细胞感知环境并介导细胞间的相互作用^2,3延伸超过100微米。 Nanopodia坚持以矩阵如此坚定地认为残留物留下的细胞移开（ 图1和图2）。 Nanopodia从而使我们能够研究细胞如何感知他们的环境，并确定细胞运动的路径，基因表达或药物治疗是如何变化的运动。然而，由于这些薄（100-300微米宽度）膜结?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass disks	Fisher Scientific	12-545-82	12 mm diameter
Glass jar	Fisher Scientific	02-912-310	Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz
Glass slide	Fisher Scientific	12-544-1	Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides
50 ml Falcon tube	BD Falcon	352070	50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile.
15 ml Falcon tube with Styrofoam rack	Corning	430790	Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes
Sharp forceps	Fisher Scientific	13-812-42	Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps
24-well Cell culture plate	BD Bioscience	353047	24-well Cell Culture Plate
150 mm Cell culture plate	BD Bioscience	353025	150 mm cell culture plate
19 G 1 ½ Syringe needle	BD Bioscience	309635	19 G 1 ½
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	2701	Decon's Pure Ethanol 200 Proof
Collagen solution	BD Bioscience	354249	Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg
Trypsin/EDTA	Cellgro	25-053-CI	0.25% Trypsin-EDTA 1x
DMEM	Life Technologies	11965-092	DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate
10x PBS	Affymetrix	75889 5 LT	PBS, 10x Solution, pH 7.4
PFA (paraformaldehyde)	Affymetrix	19943 1 LT	4% in PBS
FBS	Sigma-Aldrich	F4135-500ML	Fetal Bovine Serum
EGM2-MV	Lonza	CC-3162	EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%.
Mouse anti-human TM4SF1 antibody	Millipore	MAB3127	Epitope is located in extracellular domain
Mouse anti-human CD9 antibody	BD Bioscience	555370	Epitope is located in extracellular domain
Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody	Life Technologies	A-21202	Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)
Phalloidin	Chemicon	90324	Rhodamine-conjugated Phalloidin
Anti-fade mounting media	Life Technologies	P-36931	ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI
70% Ethanol			17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water
10x PBS (make 200 ml)			20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water
20% Triton X-100 (make 20 ml)			4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water
4% NaN3 (make 25 ml)			1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water
50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml)			Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS
ICC Blocking Buffer (50 ml)			49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3)
ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml)			50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100
HUVEC	Lonza	C2517A	www.lonza.com
PC3	ATCC	CRL-1435	www.atcc.org
Cell culture hood	NuAIRE	Nu-425-600	NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet
37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator	CellStar	QWJ300DABA	Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator
Heating pad	K&H Manufacturing	1020	K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com)
Centrifuge	Sorvall	T6000B	Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line Hemocytometer