对于异位小鼠心脏移植技术的一种改进方法

摘要

A technique is demonstrated for the microsurgical procedure for heterotopic transplantation of hearts in mice, including simplified methods for donor harvesting and recipient vessel anastomosis.

摘要

老鼠经常被用来作为心脏移植供，受者在移植免疫学研究，由于大范围的转基因小鼠和试剂可用的。的困难，提出由于动物的体积小，参与心脏移植的显微外科的相当大的技术挑战。特别是，移植术后早期高企的技术故障可能导致收件人死亡和术后并发症，如后肢瘫痪或无跳动的心脏。在这里，完整的技术异位小鼠心脏移植证实，涉及收获捐赠的心脏而其随后植入到受体小鼠。供体心脏收获立即就地灌注在与升主动脉和肺动脉的冷肝素生理盐水和横断。接受者操作涉及制备腹主动脉和下腔静脉（IVC），其次是端 - 端吻合术使用一个单一的运行10-0 microsuture和捐助肺动脉与受体下腔静脉的吻合类似的捐助主动脉与受体主动脉。以下操作的动物被注射用0.6 ml生理盐水皮下注射和允许恢复在37℃下加热垫。从227小鼠心脏移植手术的结果总结，成功率在48小时的86.8％。在48小时的13.2％的失败，5（2.2％）出现后肢麻痹，10（4.4％）有因移植缺血性损伤和/或血栓形成非跳动的心脏，15（6.6％），48小时内死亡。

引言

器官移植的动物模型可以提供有价值的信息，以提高治疗的临床移植的患者。小鼠模型是研究器官移植排斥或接受免疫机制，由于大范围的转基因小鼠和具体的小鼠不适用于其他动物模型^1-3试剂特别有用。与移植小鼠模型的一个挑战是捐助者和受助人的需要相当的技术技能，以达到满意的结果的小尺寸。

一种技术是在大鼠⁴其后由科里等 ⁵适用于小鼠心脏移植首先描述了心中的异位移植。这项技术涉及的准备之前，供体手术接受者和无灌注供体心脏，这两者都可能损害心脏移植或t的生存他收件人。该过程已被广泛地用作最初描述检查移植排斥和耐受^6-8的机制。其他人已经适应了原有的大鼠心脏移植Ono和林赛的心脏移植在小鼠^9,10过程。最近，一种技术被发布给小鼠心脏移植是克服了与Corry 等人 ¹¹的方法相关联的问题。在这里描述的协议采用了修改，基于莫特拉姆等人 ¹²的方法，该方法包括： 在原位灌注冷肝素生理盐水开胸后立即和事先执行操作供体到受体手术，以减少接受者操作时间。此外，我们使用非创伤性小血管夹，而不是6-0真丝领带。虽然血管夹有采取更多的空间的缺点，他们更容易比的关系来控制，这不应该是太紧或太松并且是那么简单，除去比夹。我们的方法是使用一个单一的连续缝合为容器吻合，虽然在最初的学习阶段的替代方法是使用缝线留在近侧和远侧角，以确保缝合线的均匀性，因此该吻合的通畅。

研究方案

在此之前开始实验，获得规划批准的实验从相关机构的动物护理伦理委员会。在按照你的机构的要求，保持小鼠。下面的协议已获得悉尼大学，皇家阿尔弗雷德王子医院委员会。

在此之前开始手术，所有仪器应彻底清洗，并浸泡在80％酒精消毒。一些机构规定蒸压然而，这可以在长期内损害精细的显微外科器械。尽可能使用一次性无菌设备。

1，麻醉

1. 麻醉小鼠异氟醚在密闭容器内，然后将其放置在仰卧的工作板，快速连接麻醉鼻锥。麻醉捏后脚，以确保没有反射试验是否足够。
2. 剃的皮肤用手术刀片和消毒用80％的乙醇。另外，在70％异丙醇2％氯己定，可用于皮肤杀菌。在麻醉诱导的异氟醚浓度为3％，但减少到1-1.5％进行维护。作出轻微调整，这个浓度，以维持正常呼吸和心脏速率。维持动物的加热板上的温度。

2，供体手术

1. 使开胸通过切割胸部通过胸廓两侧从肋缘至腋下随后在剑突的水平横向切割，以形成胸壁皮瓣，露出心脏和血管。提起皮瓣头来旁边钉选到操作板。撕下心包，暴露心脏和血管。
2. 提起下腔静脉钳，一手通过下腔静脉其它注射1ml冷肝素生理盐水近端到心脏，然后把一小动脉夹上腔静脉，以防止措施的灌注液反向通过针孔吨流动。
3. 用纱布和棉签，收回心脏向下，显露升主动脉和肺动脉。通过一对microscissors中的一个叶片通过通道（横窦）后到主动脉和肺动脉束并切断主动脉和肺动脉一起尽可能远侧尽可能地确保足够的长度用于吻合术。
4. 领带和划分下腔静脉，右侧上腔静脉（SVC），用6-0丝线离开SVC和肺静脉。另配合下腔静脉和右SVC然后将一个线程后到心脏与肺静脉环绕左SVC在一起，配合它。通过切割血管远端的关系，然后将其在冷的无菌盐水中储存于4℃直至移植的供体部位收获心脏。这会导致供体放血死亡。

3，受体手术

1. 麻醉收件人如上面（第1节）。仔细剃腹部，以避免刺激，然后做一个通过剖腹手术从耻骨正中切口，以剑突和收回使用回形针弯曲形成拉钩。包裹肠在温暖的无菌生理盐水浸泡的纱布和缩回到腹部的右上方。
2. 揭露基础设施肾主动脉和下腔静脉，主动脉自由和下腔静脉从左侧肾动脉和静脉捆绑段至髂分叉使用烧灼设备从他们的腰椎血管分裂。注意使烧灼是在适当的温度和所用足够的时间来划分和密封该容器端部。
3. 应用无创小血管夹到主动脉和下腔静脉段远端和近端。由第一穿刺用30号针头的孔做一个切口在主动脉的前壁;然后切一个切口垂直microscissors相匹配的供体主动脉的大小。冲洗主动脉管腔与肝素生理盐水，以消除任何BLOOD血栓。
4. 在供体心脏带给受区覆盖着纱布浸泡在冷盐水，并将其放置到右侧腹部。确保供体主动脉定位在接受​​者主动脉与供体肺动脉位于旁边的收件人IVC旁切口。
5. 供体主动脉端 - 侧吻合首先使用运行10-0尼龙缝线从近侧转角和缝合沿左侧开始的收件人主动脉直到到达远端的角落，在该阶段的动物是通过180°的旋转。轻轻的供体心脏移动到腹部的左侧以暴露右侧的主动脉，并通过右侧从远端到近端主动脉壁的继续缝合。收盘前主动脉吻合，轻轻冲洗管腔与肝素生理盐水，以消除任何血块和空气。
6. 吻合供体肺动脉（PA）的端至端与接收方腔静脉。做一个切口版tically与下腔静脉在一个站点根据动脉吻合前壁microscissors。吻合的捐赠者PA到收件人IVC与运行从下腔静脉管腔内左侧壁的远端开始10-0尼龙缝线。在到达近端后，继续沿前右侧壁到前端的缝线来完成吻合术。在关闭吻合术，轻轻冲洗管腔以除去任何凝块和空气。
7. 释放前用棉签血管钳，地方明胶海绵块周围的吻合部位，并轻轻向下按压直到止血的实现。在再血管化的时候，先松开远侧钳，随后近侧钳。
8. 血运重建后，在37℃适用温生理盐水的移植外，协助其恢复。接枝通常会立即开始颤动，并自发地恢复为窦性心律在几分钟之内。注入0.6毫升温暖皮下注射生理盐水，以维持收件人的水合作用。手术前完成注入丁丙诺啡皮下镇痛
9. 关闭腹部伤口用一个5-0可吸收缝线运行两个图层。首先，完成内层和沿皮肤继续。

4，恢复和移植物监测

1. 注射氨苄青霉素感染的预防和放置在一个加热垫收件人在37℃进行恢复。大多数动物迅速恢复，通常喝，往往在3个小时吃。如果鼠标显示窘迫征象，仔细检查，以确定病因。如果没有明显的原因，治疗与丁丙诺啡和密切监测。请教兽医，如果症状严重或持续时间超过8小时，并考虑安乐死。如果有必要，继续给予丁丙诺啡12小时注射，直到症状消失。如果鼠标显示困难的症状8小时后，给予持续12丁丙诺啡每小时注射，直到他们解决。咨询兽医，如果症状持续时间超过48小时，如果需要安乐死。
2. 监测移植心脏的跳动直接腹部触诊，记录节拍的强度+ + + +为​​一个健康的移植到+为弱拍，由于先进的排斥反应及 - 由于完成的排斥移植的不跳动。每日监测小鼠在第10天，然后3次，每周为实验的持续时间。

结果

经过最初的培训期，227例小鼠异位心脏移植在我们的小组进行了分析。在最初24小时内，成功率为90.3％，并且在48小时是86.8％。 48小时内的30（13.2％）的故障，5（2.2％）出现后肢瘫痪，不得不被施以安乐死，10（4.4％）有非跳动的心脏，由于移植物缺血损伤和/或血栓形成，而15 （6.6％），48小时内死亡。一些实验接枝残余示于表1的各种应变的组合。同一供体和受体菌株之间的心脏移?...

讨论

小鼠心脏移植是需要相当大的手术技巧掌握一个具有挑战性的显微外科方法。最具挑战性的方面是小直径的血管。此外，有必要限制接收者操作时间和出血。该技术对小鼠心脏移植首先由Corry 等人所述。在1973年，后经莫特拉姆等人 ^12。我们的修改包括以下几点。首先，供体心脏冷肝素盐水下列开胸主动脉和肺动脉束灌注后不久和横断立即灌注防止热缺血期间收获。其次，从?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Operating microscope	Leica, Heerbrugg, Switzerland	M651	10-25X magnification
Anesthetic machine	Vet Quip Pty Ltd, Sydney, Australia	Vett3	Capable of delivering a mixture of isoflurane and oxygen in air
Operating board	Hardware store or office supplier		Dense cork or synthetic capable of taking pins
Heparinized saline (5 U/ml, 4 °C)	Pfizer, USA	FW25	In 1 ml syringe with 23 G needle on ice
Normal saline (37 °C)	AstraZeneca Pty Ltd, Australia	4538	In 1 ml syringe with 23 G needle on warm pad
Sutures 10- nylon, 5-0 Vicryl	Ethicon, Inc. NJ, USA	2870G/J421H
Buprenorphine (0.05 mg/kg in 0.1 ml saline)	Reckitt Benckiser, Sydney, Australia		In 1 ml syringe with 23 G needle on ice
Ampcillin (5 mg/kg in 0.1 ml saline)	Aspen, Sydney, Australia		In 1 ml syringe with 23 G needle on ice
Gel Foam	Pharmacia & Upjohn Co. USA	801289304	Cut into small pieces
High temperature cautery device	Medtronic, USA	8444000
Heating Pad/Right Temp	Kent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790
Microsurgery instruments:	Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.,
Microneedleholders	Shanghai, China	WT2020
Microscissors	"          "	WT1020
Microforceps (straight tip)	"          "	WA3010
Microforceps (curved tip)	"          "	WA3020
Micromosquito clamps (1 pair)	"          "	W40350
Microvessel atraumatic clamps (1 pair)	"          "	W40130/W40150