用奔放的整体体积描记测量呼吸功能的影响

摘要

呼吸生理的评估方法时，需要克制的动物或镇静历来依赖。无节制的全身体积描记法，然而，提供了在动物模型中的呼吸生理学的精确，非侵入性，定量分析。此外，该技术允许重复小鼠允许纵向研究的呼吸系统评估。

摘要

呼吸功能障碍的发病率和死亡率在世界上领先的原因和死亡的发生率持续上升的。肺功能的啮齿动物模型定量评估是未来疗法的发展的一个重要工具。常用的技术评估呼吸功能，包括侵入式体积描记法及强迫振动。尽管这些技术提供了有价值的信息，数据集合可以是充满了伪像和实验变异性，因为需要对麻醉和/或动物的侵入性仪器。与此相反，无节制的全身体积描记法（UWBP）提供了一个精确的，非侵入性，定量由此来分析呼吸参数的方式。该技术避免了使用麻醉和限制的，这是常见的传统的体积描记技术。这部影片将展示UWBP程序包括设备安装，校准和肺功能记录。它将解释如何分析收集到的数据，以及确定实验离群和文物而导致的动物的运动。使用这种技术获得的呼吸参数包括潮气量，每分钟通气量，吸气占空比，吸气流量和吸气时间到期时间的比值。 UWBP不依赖于专门的技能和价廉来执行。 UWBP的一个关键特征，并且最吸引潜在的用户，是在同一个动物进行肺功能的重复测量的能力。

引言

肺功能障碍是发病率和死亡率在世界上领先的原因之一。该条件的特点是不充分的氧气交换，等同于咳嗽，胸痛和呼吸困难。呼吸系统疾病占死亡率的全球^{1％〜10％。}根据世界卫生组织，死亡率都将上升，由于长期吸烟，环境污染和职业的刺激。 UWBP是一个有益的补充学习肺的生理，有力地恭维传统的生化和组织学分析^2。其他程序用于肺癌的评估不提供相同的优点UWBP。侵入体积描记法是一种常用的技术，需要对动物进行anesthetised ^3,4，因此，导致呼吸测量不一定是反射的自然状态。此外，机械通气和化学挑战要求排除未来测量^3,4。收集的呼吸数据的另一种方法是通过强迫振荡，这是更敏感的微细化改变呼吸参数相比UWBP ^5。强迫振荡，然而，一种侵入性的技术，并且需要动物终止数据收集^5-7。

UWBP包括将动物的专业室内。在吸气过程中，潮气的空气被加热和肺部增加水蒸气压力范 ​​围内的加湿，并使气体⁸的热膨胀。这种效应导致的净变化在空气体积产生的体积描记器室⁸内的压力增加。过期创建从动物呼吸波形期间发生相反。波形分析，然后用从呼吸迹测量:呼吸率（次/ min），总呼吸周期时间（秒），吸气/呼气时间（钛/碲，秒），由于各潮气量的压力变化（P _T）。 图1显示了每个测量起源于呼吸的痕迹。这些测量是简单的计算和多种呼吸参数可以从这些测量得到的。这些参数包括:潮气量（空气的体积的正常吸气和呼气之间的移动），每分钟通气量（气体从每分钟肺部吸入的体积），吸气占空比（吸气时间与总呼吸周期的持续时间的百分比），并吸气流量（空气的启发在一个给定的时间量）。

UWBP提供了在动物模型中的呼吸生理学的精确，非侵入性，定量分析，并且可以用于测量呼吸性疾病和肺功能^6,9的进展。相反，其他体积描记技术，UWBP避免使用麻醉，限制和产生的文物和实验变异^6,9侵入性操作的。麻醉可以抑制呼吸，改变心脏速率，并且可以是具有挑战性的调节^10。限制导致增加呼吸因额外的压力，通过皮质酮和肾上腺素释放出^11,13。 UWBP的主要特点是反复的生理评估，使之适合于纵向研究。 UWBP强烈建议肺生理的纵向评估，并提供了一​​个宝贵的技能为未来的呼吸药物评估。

博来霉素，卵清蛋白，和缺氧已被用于诱导呼吸道挑战在几个研究和UWBP已经成功地测量准确肺生理评估^7,9,13-16。中描述的协议被设计为标准成人实验小鼠。然而，UWBP已适应其他动物，如大鼠，豚鼠，以及非人类灵长类^17-20。 UWBP并不限于只以评估肺功能障碍，但也被用于为肺成熟³的评估。UWBP的多功能性，简洁性和可重复性已经建立起了一支优秀的技术评估动物肺功能。各种软件（见材料和​​设备表）将被要求执行此过程。一个有经验的科学家将能够在1小时内执行该协议与鼠标。

研究方案

注:以下实验步骤是由动物伦理委员会在莫纳什大学批准，并按照惯例动物的护理和使用用于科学目的（2006年），澳大利亚守则进行。用于产生代表结果成年雌性C57BL / 6小鼠购自莫纳什动物服务获得。小鼠饲养在无特定病原体，温度和湿度控制的房间有12小时明暗周期。这些老鼠都可以免费获得食物和水。

1，初始设置

1. 连接笔记本/台式机到数据采集设备通过USB电缆录制。
2. 通过BNC电缆从"输出1"的连接桥放大器"输入1"的数据采集机。
3. 将压力转换成"通道1"的八桥放大器的。把数据采集的机器上，并打开分析软件。本应自动软件matically检测设备安装（见材料和​​设备表）。
4. 在软件的设置工具栏中找到明渠设置。改变信道的数目被记录到1。
5. 成立晴雨表测量室压力和水柱设备校准桥式放大器。水柱装置包括通过塑料管连接两个5毫升血清注射器吸液管。
6. 填充柱，用水和确保水水平是用尺子均衡。连接一块塑料管向每个移液管的顶部， 图2示出了水柱成立。

2，桥式放大器校准

注意:要校准桥式放大器注射空气进入水体，需要建立1厘米的H _{2 O}的偏转。这将发生在一组条件，并取决于用户的设备时。为了澄清这些步骤demonstrate该实验室将如何进行校准。

1. 撤销1毫升注射器300微升;连接注射器的活塞在上水柱的右手侧的管子的端部。注意:请确保活塞是开放的注射器和水柱，并关闭室内空气。如果水位在这一点上不均衡，旋转活栓，以便它是开放的室内空气和水柱，这将平衡的水。在水柱的左手侧的管道应该被连接到所述压力换能器来测量引起的切入注射器中的压力变化。
2. 附上从水柱管在左手侧上的压力换能器（换能器的顶圈）的连接器。
3. 选择发现旁边通道1在主屏幕上的软件的右侧，然后选择"桥接放大器"（见材料和​​设备表）的下拉菜单。
4. 输入设置为5 mV时，20 Hz的低通，选中"反相"复选框，然后单击"零"。点击"零"设置跟踪在〜0毫伏。减少窗口大小为4:1，方便观看。
5. 一切设置，按下1ml注射器的，离开它，持续3秒。这将显示在该软件的突然飙升，因为压力已经改变了。当加入300μl被压下的压力将1厘米移动的水的水柱。这个已知值将有助于校正桥式放大器。
   注意:在该腔室由于300μl的抑郁压力的增加对应于用于以后计算为P _K值。
6. 选择"输入设备"上桥放大器窗口的左下角找到。
7. 突出"后台跟踪"也被称为"零区域"秒杀之前。
   1. 点击旁边的箭头"1点"，这将产生BAC的-0.002毫伏0.002毫伏的范围内kground信号（该值永远不会恰好在0毫伏）。
   2. 在窗口中输入"0"相邻的背景信号窗口。
8. 从当注射器按下突出"的曲线上升压力区域"。点击旁边的箭头指向2和值应在0.9-1.2的范围内毫伏。
   1. 在旁边的"压力增大"窗口中的窗口中输入"1"。有关步骤2.7和2.8的可视澄清请参见图规定可能表明损坏八桥放大器的范围外发现3的值。
9. 转到"定义单位的窗口右上角找到并选择" _水柱 "。如果此选项不可用，也可以手动输入。单击确定。
10. 返回到"桥放大器"菜单（参见2.1）。选择1 mV和设置放大器为"零";这将完成的校准和水柱可以安全地取出。

3，记录肺功能

1. 称取鼠标（G）。注:一个星期前的生理评估引入鼠标的体积描记室环境。这将有助于驯化和执行时，这个程序在日后减少压力。为一个整体的概略展示UWBP设置，请参考图4。
2. 测量体温与直肠体温计。润滑与插入之前凡士林的温度计。记录的温度读数，用80％（V / V）乙醇清洗润滑剂关闭。如果用非常小的动物，如新生乳鼠中，平均体温值可以用一个红外温度计，而不是确定的。
3. 将温度/相对湿度探头上的体积描记术室的一孔端。记录温度，湿度和barometrIC压力之前，将鼠标内的体积描记箱内。
4. 鼠标放置在该体积描记室，微微覆盖的开口端。这让鼠标适应环境。关闭室。
5. 用在体积描记腔与孔的侧面插入的温度/湿度传感器，现在插入的换能器和注射器在另一侧的两个孔。
6. 按软件程序和记录约15-45秒"开始"。录制5-10秒的数据，其中的动物是不动的。移动会改变动物的基本呼吸生理学，并提供效果差。呼吸应以振荡在节目的线性路径。这些都是有用的数据。注意:排尿或排便可以导致增加的温度和湿度的体积描记腔室内部。这将在分析过程中掩盖的结果。在排尿或排便的情况，应立即停止记录和清洁PLethysmography室用80％（V / V）乙醇。请参考图6为次优的结果，其中数据应被拒绝的视觉表示。
7. 记录为45秒，按"停止"的软件后（见材料和​​设备表）程序。从体积描记室取出小鼠，并立即记录该室的温度和湿度。不要连续超过45秒的记录，因为这可能会强调动物。
8. 返回鼠标笼子，喷雾和用80％（V / V）乙醇擦拭该室。
9. 允许该腔室至干，在进行到下一个鼠标之前返回基线的温度和湿度。重复步骤3.1至3.9为后续的动物。注意:如果多个动物正在研究中，确保室内的温度和湿度返回至接近基线值的每个新的动物之前被放置在腔室中。

4，体积描记分析

无TE:计算呼吸参数，例如潮气量（V _T）和分钟量以下变量需要被测定:呼吸率（次/ min），总呼吸周期时间（秒），吸气/呼气时间（钛/碲，秒）和压力的变化，由于各潮气量（P _T）， 图1示出了可以从一个跟踪被测量的变量。下面的步骤使用的软件（见材料和​​设备表）来测量这些变量。在分析，避免含嗅或运动轨迹的地区。为可再现的结果，至少5秒钟的良好呼吸迹是必需的。对于不同呼吸痕迹，例如参见图5和图6。

1. 打开屏幕以全屏，设置视图以1:1和选择5秒可利用的数据。这方面的一个有代表性的快照显示在图5。
2. 在打开的亲顶部发现的迷你数据焊盘窗口克在DataPad标签。选择通道1，选择"循环测量"的左栏和"循环平均身高"的右栏。
   1. 选择"选项"，然后设置规模最小峰值检测到1（毫秒）。这将允许检出每一个峰值，并使用产生小幅度摆动的小动物时，就显得极为重要。
   2. 点击"确定"。这将显示"压力变形，由于每个潮气量'（P _T）测量。
3. 在迷你资料片，选择"循环测试"之后"事件计数"，然后点击"确定"。这将显示"频率"（f）的测量。
   1. 频率需要被转换为次/ min。这是通过由60秒相乘的值并除以回答由记录（分钟）的总时间内完成。
4. 在迷你资料片，选择"CY骑士测量'后面'时期"，然后单击"确定"。这将显示"共呼吸循环时间"（T _TOT，秒）测量。
5. 接下来的步骤是用来创建一个宏指令产生峰值吸气和呼气的时间值。确保光标是直接在高峰/低谷的最大和添加注释9连续的波峰和波谷。与振荡的峰值开始， 如图5。
6. 随后，选择窗口:数据盘和1列在出现点击左栏"持续时间"在右栏"选择信息"，然后点击"确定"窗口。
7. 选择宏在程序的顶部发现了，然后开始录制。现在选择命令:"查找"，"去"，"开始的文件"，然后点击"查找"。
8. 选择命令:"查找"和"查找评论"。键入相同的短语输入中提供的"含"框中的评论框。选择"选择要上点"选项卡，"查找"。
9. 选择命令:"添加到资料片"。接下来，选择宏:宏命令，并开始重复。出现的重复计数窗应设置为9。
10. 选择命令:"查找下一个"。选择命令:"添加到资料片"。最后选择宏命令和结束再说。
    1. 现在选择的宏观和停止录制。保存并命名的动物数量后宏。注:设置为每个动物的宏允许用于纵向研究宏观和节省时间。
11. 宏现在可以运行，以获得每个评论的启示_{（T I）}和到期（T _E）的时间。这些数据将出现在datapad的通道1。呼气和吸气时连续的数据将​​出现在这个顺序。
    1. 这些数据需要手动分成吸气和呼气值。平均每个参数的四个数据值来获得的平均_{T I}和_Tê。
12. 一旦初级数值已经获得的潮气量（V _T，毫升）可以计算出来。为了获得潮气量Drorbaugh和芬恩⁸的公式用于:
    V _T（毫升_{）=（P T} / _pk信息）×（V _{K）×（（T CORE（P} B - P _{C））/（T CORE（P} B - P _C） - T _C（P B _- P _{CORE）））}
    
    在哪里
    V _T:潮气量
    _pk信息 :压力偏转由于每次注射1毫升（参见步骤2.5）
    牛逼_的核心 :每个动物的核心温度
    P _C:在茶室内温度过高X相对湿度水汽压MBER
    T _C:温度在动物室
    P _芯 :压力在体温下（在体温下的水蒸气压力×1.0）
    P _T:压力偏转，由于每个潮气量
    V _k为容量注射剂用于校准
    P _B:气压
    
13. 一旦潮气量已经计算下列参数也可以被确定:
    • 分钟通气量（毫升/分钟）= _V T XF
    • 分钟通气量（毫升/分钟/公斤_）=（V T XF）/体重（千克）
    • V _T（毫升/千克）= V _T（毫升）/体重（千克）
    • 吸气占空比（％）= T _I / T _TOT
    • 吸气流量（ml /秒）= V _T / _T I
    • 吸气时间比到期时间为T _I / _TË
    • 总周期时间​​（sEC）=吸气时间（秒）+到期时间（秒）

结果

在此过程中一直遵循正确的，一致的摆动轨迹上的数据分析软件创建的。该程序提供了一个几分钟内呼吸一丝设置了简单的计算计算后确定上市的呼吸参数。 图5表示适当的呼吸跟踪从控制（健康的）鼠标。适当的摆动数据时产生的动物没有积极地移动。

UWBP是控制和肺纤维化的队列之间肺功能的一个非常有用的和可靠的评估。 图7展示了一个鼠标用?...

讨论

这里描述的技术是奔放和麻醉的小鼠呼吸参数评估一种非侵入性的方法。该协议的优势包括它的简单性和精确性纵向测量肺功能以最少的人工制品。有，然而，一些局限性和关键步骤要注意有关的过程。首先，最重要的是，鼠标必须留室至少五秒钟内平静。增加的压力会破坏鼠标的呼吸模式，从而提供不同的结果（ 图6a）。这种缺点可能会保持和处于倍于预期。但是，更换鼠标在其?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
LabChart 7 software (for Macintosh)	ADINSTRUMENTS	MLU60/7	used in protocol step 4
PowerLab 8/30 (model ML870)	ADINSTRUMENTS	PL3508
Octal Bridge Amp (model ML228)	ADINSTRUMENTS	FE228
Black BNC to BNC cable (1 m)	ADINSTRUMENTS	MLAC01
Macintosh OS	Apple Inc.		Mac OS X 10.4 or later
Surgipack Digital Rectal Thermometer	Vega Technologies	MT-918
Grass volumeteric pressure transducer PT5A	Grass Instruments Co.	Model number PT5A; serial No. L302P4.
1 ml Syringe	Becton Dickinson (BD)	309628
5 ml Serological syringe pipettes	Greiner Bio One	606160	Connected via plastic tubing
Balance/Scales	VWR International, Pty Ltd	SHIMAUW220D	Any weighing balance with of 0.1 gram resolution
HM40 Humidity & temperature meter	Vaisala	HM40A1AB
Barometer	Barometer World	1586
Laboratory tubing	Dow Corning	508-101	Used to connect water column to the syringe and pressure transducer
Cylindrical Perspex Chamber	Dynalab Corp.		Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50 mm(w) x 1,500 mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80 mm(l) x 80 mm(w). Each lid has a 60 mm wide circular hole cut on the face of the lid 50 mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5 mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25 mm in diameter.
80% Ethanol (4 L)	VWR International, Pty Ltd	BDH1162-4LP