对于皮肤伤人方法和测定的伤口响应<em&gt;温度。线虫</em

摘要

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

摘要

C.将线虫表皮角质层，并形成一个既简单又复杂的皮肤层，它可以修复由伤人造成局部损坏。伤口反应和修复中该模型的研究已经照亮了细胞骨架和基因组响应组织损伤的理解。两种最常用的方法，以卷绕在C.线虫成人皮肤都刺有注射针头，和当地的激光照射。针伤人局部破坏角质层，表皮，和相关的细胞外基质，并且还可能会损坏内部组织。激光照射导致更多的局部损坏。伤人触发容易测定应答，包括升高的表皮的Ca ^2+（秒分钟），形成与含有肌动蛋白环在伤口部位（1-2小时），升高的转录的抗微生物肽基因的闭合连续（2-24小时），和瘢痕形成。基本上所有的野生型成年动物生存伤人，在那里作为突变体缺陷的创面修复或其他答复表明存活率降低。对针和激光伤人检测的定量和伤口反应和修复过程（钙动力学，肌动蛋白，抗菌肽的诱导和生存）的可视化的详细协议，并介绍了。

引言

皮肤伤口愈合机制是基本生物学的兴趣和相关的人体健康。在脊椎动物和哺乳动物伤口愈合包括一系列复杂的多种组织和信令¹协调反应。许多简单的遗传模型有机体也能愈合皮肤伤口^2。因此，感兴趣的分析的皮肤伤口修复基因易于处理的模型。我们和其他人已经开始使用线虫作为皮肤创伤新型治疗^3,4。该协议的目的是使一组研究人员使用C的更广泛的线虫作为工具来调查表皮伤口愈合的分子和细胞机制。

C.将线虫皮肤包括表皮（也称为皮下组织）和细胞外角质层^5。成人表皮是从少数多核合胞体，其中最大的是在合胞体形成的ķnown为hyp7。表皮是一个简单的上皮细胞分泌在其顶端表面的角质层。皮肤能够积极抵御皮肤穿透病原体和修复小伤口^4。 C.在创伤修复线虫的皮肤是强大的，因为几乎所有的野生型动物生存才能生存造成的针，或因激光照射局部皮肤损伤小刺伤。C.线虫皮肤伤人引发一系列的反应，包括表皮先天免疫反应，伤口愈合和瘢痕形成^4。成人表皮是有丝分裂后，和伤口愈合涉及相对于表皮增殖或细胞迁移的地方的细胞反应。我们已经表明，皮肤创伤触发大量持续增加表皮的Ca ^2+，要求该膜TRPM通道GTL-2和内部的Ca ²⁺商店^3。表皮^钙离子信号所需的形成和封闭F-肌动蛋白环的WOUND网站。伤人也诱导了激活抗菌肽如NLP-29的转录先天免疫反应。抗菌肽的伤人诱导的转录依赖于TIR-1 / PMK-1的p38 MAP激酶级联在表皮⁴作主。在任一所述的Ca ²⁺信号传导途径，或在先天免疫应答缺陷将导致较低的生存后伤人。在C的相对简单的结构线虫表皮，其遗传易处理性和优点用于体内成像使其成为出色的系统来研究的伤口修复的多个方面。

在这里，我们提出的协议伤人的两种常用方法:针伤人和伤人的激光。针伤人不需要专门的设备（比针拔出器等），并与经验，可以在数百每天蠕虫来执行。针伤人的是，动物在琼脂平板上生长进行。与此相反，激光伤人的是ANES执行thetized动物装在琼脂焊盘下盖玻片，并适合于所述细胞反应的损害实时成像。

研究方案

以下协议描述为C.详细过程线虫皮肤伤人和测定伤口响应。

1.针伤人^3,4

1. 健康成长unstarved蠕虫标准NGM（线虫生长培养基）板的E.大肠杆菌 OP50细菌作为食物，保持在20℃的培养箱中培养。
   注:方法NGM琼脂平板和常规栽培的C.线虫可以在www.wormbook.org ⁶找到。
2. 在20°CO / N伤人及培养前挑选25 L4阶段蠕虫新鲜种子板块1天。
3. 前伤人，拉针使用针拉马毛细血管。在伤人使用的针是相同的用于C的显微注射线虫 。
4. 确保所有的蠕虫是在年轻的成年阶段。放置在冰虫的板约30分钟。冷却导致动物不振，促进针伤人。
   注意:在5分钟去除冰，蠕虫将开始正常运行。这是可能的，但具有挑战性的伤口移动蠕虫。随着经验的积累，5分钟是足够的时间来绕25蠕虫。固定药物，如左旋咪唑（如用于激光伤人，见下文），但动物会需要更长的时间来恢复。
5. 取出琼脂平板从冰到解剖体视显微镜。使用蠕虫挑，将25蠕虫到琼脂板的中心。
6. 将针头插入100微升枪头更容易持针。穿刺与针蠕虫的主体的前部或后部，避免了性腺。在一般情况下，试图将卷绕后咽和前性腺之间，或介于后部性腺和直肠。重复使用针管多次，直到他们分手。
   注:确保伤口破洞的角质层和皮肤短暂的，温柔的刺，穿透〜5-10微米到动物。针头应该进入阿尼姆人在大约直角的皮肤。伤口不应该造成明显损害内部器官，或身体的即时断裂。观察到少量细胞质渗出的伤口后，几秒钟的;但是，如果细胞内容物泄漏出​​来过长时间的动物将无法生存。为获得最佳成像，卷绕在外侧表皮的合胞体（hyp7）或横向接缝。
   注:此过程包括使用玻璃针。
7. 允许蠕虫恢复室温，然后在培养20℃。判断针伤人通过许多如下所述测定法的成功。后在年轻的成年阶段针伤人大于95％的野生型动物的存活24小时。伤人的幼虫或老年人的影响尚未得到广泛的分析。

2.激光伤人³

用飞秒激光照射（800纳米），以进行更精确的伤人。

1. 准备琼脂P广告上融化的2％琼脂⁷载玻片。确保垫类似于用于C的实时成像琼脂垫线虫 。
2. 转让10年轻的成虫与上挑的蠕虫琼脂糖垫，并增加12毫米左旋咪唑溶液2微升下降。涵盖的动物和用盖玻片液体。等待1-2分钟的蠕虫瘫痪。
3. 放置载玻片到一个旋转盘共聚焦显微镜。移动舞台，找到蠕虫和注重横向前或后合胞体表皮具有100X的目标（NA 1.4-1.46）。
4. 设置飞秒激光至140毫瓦的功率（目标之前测得）。使用飞秒激光以80兆赫的重复率。
   注:两个脉冲的每个200毫秒（20毫秒分隔）足以伤人在我们手中。
5. 着眼于表皮细胞的顶端表面和伤口表皮。观察细胞质（气泡）的地方破裂，或局部脱色Ø˚F使用任何荧光标记。
   注:按照适当的激光安全程序，使用飞秒激光的时候。使用飞秒激光器线或点扫描，如在双光子显微镜应该用于激光伤人提供足够的功率。
   注意:尽管我们没有使用其它激光器的直接经验，原则伤人应使用常规的UV激光器（如用于线虫细胞消融）是可能的。或者，使用荧光漂白恢复（FRAP）模块上旋转盘共聚焦伤口表皮（N.普霍尔，个人通讯）之后。

3.可视化的表皮^钙响应伤人

1. 使用转基因C.线虫菌株表达的Ca ²⁺传感器（如那些GCaMP系列）在表皮，成人表皮特异性启动COL-19（ 图1A的控制之下;转基因列于表1）。使用表达红色荧光蛋白的转基因，如tdTomato作为用于转基因表达水平的内部对照。
   注意:我们已经使用tdTomato作为用于转基因表达的内部对照表皮tdTomato荧光是相对稳定的，并且不与GCaMP成像干涉。
2. 两个针和激光伤人触发^钙升高表皮。然而，由于针伤人不能容易地在一个旋转盘共聚焦进行的，激光伤人是优选的^钙离子反应（ 图1）的定量分析。
3. 收购使用旋转盘共聚焦与100X的目标（NA 1.4-1.46）和适当的过滤器设置多维采集模式（时间间隔2秒，114毫秒激发激光曝光）时间推移图像（GFP过滤器将工作GCaMP3）。
   注:采集时间推移图像，每30秒约2小时检查^钙 RESPONSE伤人在一个较长的时间过程。
4. 使用图像分析软件测量中的感兴趣区域（ROI）10等效区域，其中五个集中于在背景中的表皮细胞胞质溶胶和5的平均GCaMP荧光。
5. 通过平均荧光5投资回报在表皮，然后减去5投资回报平均在后台受伤前获得的基线荧光（F _0）。表达在荧光ΔF的变化的变化相对于所述基线_[（F T -F _0）/ F _0]的比值。

4.可视化F-肌动蛋白伤人后的

1. 注意:在响应于针伤人，观察肌动蛋白环在伤口部位伤口周围逐渐关闭。该协议部分检测通过测量肌动蛋白环直径伤口闭合。
2. 生成表达一种F-肌动蛋白标记物，例如稠合到果蝇膜突蛋白的肌动蛋白结合结构域的转基因蠕虫绿色荧光蛋白，表达表皮特异性启动子的控制下，如COL-19（ 图2A）（转基因juIs352）。
   注意:我们已经获得使用其它的肌动蛋白结合结构域标记如Lifeact或F-tractin（未发表的结果）相似的结果。
3. 伤人的P COL-19- GFP-膜突蛋白的转基因蠕虫进行针。针伤人后，观察周围的伤口部位的GFP-膜突蛋白的由〜5分钟的环。肌动蛋白环变得在直径小，并最终关闭2-3小时交伤人，在野生型动物（ 图2A）。
4. 制备2％琼脂板在载玻片上，并在2微升12毫左旋咪唑溶液转移10蠕虫到垫。使用传统的共聚焦显微镜伤人后，图像的GFP-膜突环1小时。
   注:使用共焦显微镜伤人后1小时获得肌动蛋白环Z-栈（13×0.5微米）。
5. 伤人后，测量肌动蛋白环的直径。定量表皮摹FP-膜突蛋白，首先使Z堆栈的最大强度投影，然后得出4线扫描（在45°至对方）通过GFP-膜突环。环直径被定义为平均峰至4行扫描（ 图2B）的峰值距离。对于已经关闭的环，该直径被定义为0微米。
   注:F-肌动蛋白环方便地测定1小时后的伤人，因为这是通过在野生型的伤口闭合过程大约一半。 F-肌动蛋白环也可以在多个时间点测量来推导伤口闭合的时间过程。可以用左旋咪唑，固定蠕虫和旋转磁盘共聚焦显微镜获得的伤口闭合时间推移电影。

表皮抗菌肽5.分析感应

注:伤人也触发了C.先天免疫反应线虫的皮肤。基因编码抗菌肽（安培）的转录INDuced在表皮。在NLP-29（神经肽样蛋白），AMP被打伤⁴强烈诱导。为了测定表皮如何控制伤人后AMP表达，可以使用转基因记者或实时PCR来检测个体的AMP的转录水平。

1. 对于伤人⁴先天免疫反应的转基因记者分析。
2. 执行针伤人（如在方案1）在成年动物表达转基因报告frIs7，其含有P NLP-29- GFP 和P COL -12- DsRed的作为内部对照。观察未受伤的成年动物的GFP长通滤波器为暗红色或橙色。
   注:伤人野生型虫会诱发P NLP-29-GFP表达，但不会影响P COL-12 -dsRed，导致下的GFP长传照明出现橙，黄，绿或蠕虫。基因在P38 MAPK通路，如PMK-1或功能丧失NSY-1将阻止NLP-29-GFP伤人后^，4诱导。 P NLP-29- GFP高表达水平在幼虫阶段
3. 在年轻的成年动物进行AMP诱导测定。确保未受伤的控制动物有GFP的低水平。
   注:P NLP-29- GFP表达也诱导渗透胁迫^8，并可能对其他环境胁迫敏感。
4. 伤人后6小时，得分具有P NLP-29-GFP诱导（ 图^3）9使用荧光解剖范围用GFP长通滤波器的蠕虫的数量。
   注:在1小时后伤人P NLP-29- GFP有明显诱导，达到了约6个小时后伤人峰，然后剩余升高至24小时后的创伤。通过量化打分的视觉表达^4,9。可替代地，量化使用荧光激活蜗杆分拣⁴表达水平。对于蠕虫分拣机，至少50动物需要被打伤。
5. 对于QUA实时PCR检测ntitating的各个AMP的基因的转录水平。测定的转录水平为几个基因:NLP-29，NLP-30，CNC-1，和CNC-5。
6. 执行针头伤人的野生型或突变蠕虫（见协议1）
7. 收集50受伤蠕虫和50未受伤的蠕虫在所需时间（ 如 3，6，24小时）后伤人。
8. 使用商业试剂盒按照制造商的说明提取RNA。
9. 执行反转录使用商业逆转录酶试剂盒获得总共20微升的cDNA。
10. 用于RT-PCR中，使用0.2微升的cDNA（1/40）从每个样品中组合，带Green超用荧光素和0.2μM的引物。比较RNA的质量，使用AMA-1或SNB-1的RT-PCR作为参考;通过规范化的内部控制（AMA-1或SNB-1）比较AMP相对表达水平，或（在受伤的蠕虫/未受伤的蠕虫AMP感应）通过比较规范的诱导倍数后伤人alizing内部控制。
    注:CNC-1和CNC-5 caenacin家庭抗菌肽的转录被炸伤¹⁰激活。典型地，针伤人诱导表达（〜500倍用于CNC-1）经4小时¹⁰的时间过程。在公开的工作中使用的引物列于表2中 。

6.试验后生存伤人

1. 注:伤人活化至少两个独立的信号传导途径在表皮:所述的Ca ²⁺依赖的伤口修复途径和先天免疫应答的途径。两个途径都需要无菌伤人的充分的存活。为了测试突变或RNAi治疗是否会影响伤口愈合，测量生存在24-48小时后伤人。任选地，使用常规寿命测定法来确定伤人对长寿^4,9的效果。
2. 年轻的成人（L4 + 24小时）蠕虫执行针头伤人（50蠕虫，重复塞弗拉尔次）按照上述方案1。维持未受伤蠕虫作为对照的相同数目。
3. 检查成活率，每24小时（转移伤员蠕虫到一个新的琼脂平板上，每24小时）。伤人的突变体有缺陷的创面修复，如GTL-2或TIR-1，归时，未受伤的对照组动物后观察〜50％存活24小时。死亡被定义为缺乏运动反应由蠕虫挑去触摸。

结果

激光或针伤人将触发快速和持续升高表皮钙水平，作为可视化与钙传感器，诸如GCaMPs（ 图1）。钙高程发生在几秒钟内，并持续升高几十分钟。针伤人再现地导致形成F-肌动蛋白环中的伤口位点（ 图2）;这些出现在几分钟之内，并逐渐接近过1-2小时后伤人。肌动蛋白环更精确的激光伤人后较少形成。两个针和激光伤人诱导表皮抗菌肽（AMPS）如NLP-29，与转录记者（

讨论

这里介绍的针和激光伤人的方法提供互补的方法来评估的表皮上皮细胞修复损伤的能力。激光伤人是相对局部和（取决于激光构造）可以被限制在表皮，而针伤人破坏表皮，角质层，并有可能内部基底膜。针头伤人可能更准确地类似于伤口病原体或机械损伤自然环境造成的。作为一项规则，针伤人需要更多的实践来实现精确的伤口与动物存活兼容。该细胞对针和激光伤人显示许多相似之处。然而?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Denville Scientific	CA3510-8
Plastic Petri plate	Tritech Research	T3308	60 mm
Levamisole	Sigma	L9756	12 mM
Borosilicate glass capillary	World Precision Instruments	1B100F-4
Needle puller	Sutter Instrument	P-2000
Worm pick (platinum wire)	Tritech Research	PT-9010
M9 solution	Home-made		3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving
Trizol	Invitrogen	15596026	Use 500 ml for 50 worms
iQ SYBR Green	Bio-Rad	1708882
SuperScript III	Invitrogen	18080-051
PCR machine	Bio-Rad	C1000/CFX96
96-well PCR tubes	Bio-Rad	MLL9601
Image analysis software	Molecular Devices	Metamorph