DamID-SEQ:蛋白质-DNA相互作用的全基因组映射腺嘌呤甲基化的DNA片段通过高通量测序

摘要

我们描述这里的一个检测通过结合DNA腺嘌呤甲基识别（DamID），以高通量测序（DamID-SEQ）。这种改进的方法提供了更高的分辨率和更宽的动态范围，并允许在分析与其他高通量测序数据如芯片起，RNA测序等一起DamID-SEQ数据

摘要

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

引言

脱氧核糖核酸腺嘌呤甲基识别^{（DamID）1,2}是这样一种方法来检测体内蛋白-DNA相互作用，是一种可供选择的方法来染色质免疫沉淀^{（ChIP）3。}它采用的是相对低的细胞的量，并且不需要化学交联蛋白与DNA或高度特异性的抗体。后者是特别有用当靶蛋白是松散或间接地与DNA相关联。 DamID已成功地用于绘制的多种蛋白质，包括核包膜蛋白^4-10，相关联的染色质蛋白^11-13染色质修饰酶^14，转录因子和辅因子^15-18和RNAi机械¹⁹的结合位点。该方法适用于多种生物，包括S.酵母 ^13，S。酵母 ^7，C。线虫 ^9,17，D。黑 ^5,11,18，20，A。拟南芥 ^21,22以及小鼠和人的细胞系^{6,8,10,23,24。}

所述DamID测定的发展是基于在缺乏内源性腺嘌呤甲基化²的真核细胞腺嘌呤甲基化的DNA片段的特异性检测。表达的融合蛋白，包括利息和 E的DNA结合蛋白的大肠杆菌DNA腺嘌呤甲基（水坝），可以甲基化腺嘌呤碱中GATC序列是在空间接近性（最显著内1 kb和多达大约5kb的）的蛋白质的基因组中的²的结合位点。修饰的DNA片段可以特异性地扩增和杂交到微阵列检测感兴趣^1,25,26的蛋白质的基因组结合位点。这个原始DamID方法是由微阵列的可用性和预定探针的密度的限制。因此，我们集成了高通量测序到DamID ¹⁰和指定的方法DamID-起。读取从DamID-SEQ产生大量的短使蛋白质-DNA相互作用的全基因组的精确定位。我们发现，DamID-SEQ提供比DamID更高的分辨率和更宽的动态范围芯片用于研究基因组核纤层（NL）协会^10。这种改进的方法允许基因^结构 10内探测NL协会和便于与其它高通量测序数据，如芯片起和RNA-SEQ比较。

这里描述的DamID-SEQ协议最初开发用于映射基因组-NL协会^10。我们通过圈养小鼠或人类核纤层蛋白B1至E.产生的融合蛋白大肠杆菌DNA甲基腺嘌呤和测试协议中3T3小鼠胚胎成纤维细胞，C2C12小鼠成肌细胞¹⁰和IMR90人胚肺成纤维细胞（数据未公布）。在这个协议中，我们开始用Constructing载体和表达坝-拴系融合蛋白由慢病毒感染的哺乳动物细胞^24。接着，我们描述放大腺嘌呤甲基化的DNA片段，并准备测序文库，应该适用于其它生物体的详细方案。

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研究方案

1.产生和融合蛋白和自由大坝蛋白的表达

1. 感兴趣进入DamID载体克隆蛋白。
   1. 根据制造商的方案扩增使用所需的高保真DNA聚合酶的兴趣点（POI）的蛋白质和合适的引物的cDNA的。实验确定最佳扩增条件，以确保插入适当的放大。
   2. 运行一个琼脂糖凝胶并根据制造商的方案纯化的POI扩增的cDNA由凝胶提取试剂盒。
   3. 克隆的cDNA的POI成采用BP克隆酶II根据制造商的协议的pDONR201载体中。
   4. 根据制造商的方案从供体载体导入使用LR克隆酶II的pLGW-RFC1-V5-EcoDam目的载体或pLGW-EcoDam-V5-RFC1目的向量²⁷克隆的POI中的cDNA，这取决于熔融的POI的期望的方向到N末端或次大肠电子C-末端大肠杆菌DNA甲基腺嘌呤^{（EcoDam）27。}
   5. 验证通过测序，克隆的cDNA具有一个正确的顺序和形式框内融合到EcoDam。
2. 生成慢病毒股票。
   1. 生成慢的股票采用慢病毒表达系统表达大坝-V5-POI和V5-大坝（从pLGW-V5-EcoDam矢量^27）。根据制造商的方案使用正转染过程。
      1. 使用293T细胞和脂质转染根据制造商的方案进行转染，以产生慢病毒股票。
      2. 包括0.45微米的PVDF过滤步骤。
3. 感染细胞的慢病毒。
   1. 感染（0天）的前一天，使用相同生长培养基通过贴壁细胞在合适的生长培养基中培养该细胞类型向6孔组织培养板无抗生素到实现对感染当天50％汇合。位置细胞在37℃培养箱。
   2. 感染（第1天）的一天，从取出2冻存管两个大坝-V5-POI和V5-大坝慢病毒上清液-80℃冰箱，并装在一个37℃水浴解冻。
      1. 从细胞中除去生长培养基并用0.5ml新鲜的生长培养基替换不含抗生素。
      2. 加入1毫升的解冻慢病毒向每个孔（2井用V5-坝和2井用坝-V5-POI）。不含抗生素加入1毫升生长培养基向剩下的2孔中，这将作为阴性对照。轻轻晃动6孔板混匀，早在37℃培养箱O / N。
   3. 感染（第2天）后一天，从细胞中除去病毒悬浮液和用2ml生长介质代替不含抗生素。将细胞早在37℃的培养箱中培养48小时。
4. 隔离基因组DNA。
   1. 从每个孔和德抽吸媒体用250微升0.05％胰蛋白酶-EDTA转速细胞。在37℃下2分钟。
   2. 从每个孔1ml生长培养基和吸管细胞洗涤细胞脱盘入1.5ml微量离心管中。通过在200×g离心离心5分钟，在RT下沉淀细胞。
   3. 在200×g离心在RT 2分钟洗涤沉淀的细胞用500μl的PBS，离心。
   4. 重悬沉淀的细胞在200μlPBS中。
   5. 根据制造商的方案分离的gDNA通过血液和组织试剂盒。洗脱的gDNA在200μl缓冲液AE和确定通过使用分光光度计测量的OD ₂₆₀的浓度。
      注:基因组DNA未感染的或模拟感染的细胞可以分离作为阴性对照。沉淀的gDNA以用于长期存储更高的浓度。
      1. 添加3倍体积的100％乙醇和0.1体积的3M乙酸钠（pH 5.5），并通过反相管4-6次混合。
      2. 储存在-20°CO / N。
      3. 离心机在16,000xg下克15分钟，在4℃。
      4. 小心取出上清液。在4℃下进行5分钟，在16000×g离心洗粒料用70％（体积/体积）乙醇和离心机。
      5. 小心除去乙醇并允许粒料空气干燥3分钟，在室温。
      6. T中_{10 E} 0.1（pH值7.5）基因组DNA溶解到大约1微克/微升。池的gDNA从每个实验样品或阴性对照和测量的浓度。储存在-20℃。

2.扩增出腺嘌呤甲基化的DNA片段

1. 摘要基因组DNA与DPNI，只有切断腺嘌呤甲基化GATCs。
   1. 设置在冰上反应用2.5微克的gDNA，1微升10X缓冲液，0.5μl的DPNI（20U /微升）和用H _{2 O}充满至10微升的总体积。对于每一个基因组DNA样品，准备三种反应-一个没有DPNI（"无DPNI"，与0.5微升_H 2 O的替代DPNI）和2瓦特第i个DPNI（"与DPNI"）。
   2. 消化O / N在37℃和灭活DPNI在80℃下进行20分钟。
2. 结扎DamID适配器。
   1. 准备DamID适配器。
      1. 在_H 2 O的悬浮每两个DamID适配器寡聚²⁴到100微米的最终浓度。
      2. 结合两种DamID适配器寡聚物等体积混合，并放置在密闭的管中。密封用Parafilm管，坐在机架并置于在90℃充满水的烧杯中。保持所述管的盖下面的水平（以避免水进入管），但低聚混合物的表面上方。
      3. 让水冷却至室温，所以适配器退火缓慢。
      4. 分装退火适配器（50μM），并存储在-20℃。
   2. 设置在冰上进行反应。在从2.1.2各管中，加入6.2微升_H 2 0，2微升10X连接缓冲液，0.8微升50微米DamID广告aptors（ 在冰上解冻 ）和1μlT4DNA连接酶（5U /微升）。总体积为20微升。在这两个"与DPNI"管之一，用1微升_的 H 2 O（"无连接酶"）代替连接酶注意，每个基因组DNA样品具有两个阴性对照- "无DPNI"和"无连接酶"。
   3. 结扎O / N在16°C和灭活连接酶在65℃下10分钟。
3. 摘要DNA与DpnII销毁含有未甲基化GATCs片段。
   1. 设置在冰上进行反应。在从2.2.3各管中，加入24微升_H 2 O的，5微升10X DpnII缓冲液和1微升DpnII（10U /微升）。总体积为50微升。
   2. 消化在37℃进行2-3小时，并灭活DpnII在65℃下20分钟。
4. 放大腺嘌呤甲基化的DNA片段。
   1. 建立在冰上用5微升反应DpnII消化从2.3.2，5μ微升10x PCR缓冲液，12.5微升5微米DamID PCR引物^24，4微升10毫米的dNTP混合，1微升50X聚合酶混合物和22.5微升_H 2 O.总体积为50微升。
   2. 运行的PCR如下:68℃，10分钟; 94℃下1分钟，65℃5分钟，68℃15分钟; 4个循环的94℃下1分钟，65℃1分钟，68℃，10分钟; 1分钟，65℃1分钟，68℃2分钟，17个循环的94℃。
   3. 从在1％琼脂糖凝胶各反应分析5微升PCR产物。 PCR产物应显示为一个涂抹范围从0.2到2千字节（ 图2）。 "无DPNI"和"无连接酶"对照应该没有或明显较少的扩增。
   4. 如果从步骤2.4.3结果是满意的，重复步骤2.4.1-2.4.3具有两个或三个反应的实验样品和对于每两个阴性对照中的一个反应。
   5. 池和从相同的纯化的PCR产物使用PCR纯化试剂盒或固相可逆固定（SPRI）珠粒根据制造商的方案的实验样品。不要净化"不DPNI"或"无连接酶"的控制。 DNA洗脱缓冲液EB。
   6. 通过使用分光光度计，其应该在0.1微克/微升或更高测量的OD ₂₆₀测量纯化的DNA的浓度。收集至少10微克的DNA各样品。如果使用PCR纯化试剂盒，净化每50微升PCR产物有一列，洗脱在30微升缓冲EB，集中洗脱液。
5. 摘要DNA与DpnII防止DamID PCR引物被测序。
   1. 建立从2.4.6在冰上反应用5微克纯化的DNA，5微升10X DpnII缓冲液，1微升DpnII（10U /微升）和用H _{2 O}充满至50微升的总体积。准备两个或三个反应各样品。
   2. 消化在37℃进行2-3小时和灭活DpnII在65℃下20分钟。
   3. 池以及从与PCR纯化试剂盒或SPRI珠粒同一样品根据生产商的方案纯化消化物。 DNA洗脱缓冲液EB。
   4. 测量纯化的DNA的浓度应为约0.06微克/微升或更高。收集至少6微克的DNA各样品。如果使用PCR纯化试剂盒，净化每50有一列微升消化，洗脱在30微升缓冲EB，集中洗脱液。

3.文库制备的高通量测序

1. 片段DNA
   1. 实验确定适当的消化时间为每个新一批双链DNA Fragmentase的。由于酶的活性会降低随着时间的推移，执行新的实验前重复测试。要保存DNA从2.5.4实际的碎片，使用纯净甲基PCR产物2.4.6或以前的experime额外的DNA的nts在此步骤。
      1. 设置了主混合物与6微克的DNA，12微升10X Fragmentase缓冲器和用H _{2 O}充满至114微升的总体积。
      2. 涡Fragmentase股票小瓶3秒，加入6微升到主结构和涡主结构，持续3秒。总体积为120微升。
      3. 分装20微升的主结构，以每5个新管。孵育所有6的管在37℃进行5至55分钟，在10分钟的增量。添加5微升的0.5M EDTA停止反应。
      4. 分析12.5微升消化（0.5微克DNA），每个反应以及0.5微克琼脂糖凝胶上的DNA未消化（图3）。确定多数涂抹消化约0.2 kb的所需的最少时间（T _0.2kb）。选择（包括5分钟和T _0.2kb）与实际的碎片等额递增5分钟和T _0.2kb的6持续时间。
   2. 设置实际fragmenTATION在3.1.1.1-3.1.1.3所述。孵育反应在37℃下，在3.1.1.4所确定的持续时间。
   3. 池6的反应和纯化用PCR纯化试剂盒或根据制造商的方案SPRI珠粒的摘要。稀释成51微升缓冲EB DNA。最后的洗脱液〜50微升。
2. 零碎的DNA修复结束
   1. 设置了从3.1.3洗脱液，25微升H于冰上反应_{2 O，10}微升10X T4 DNA连接酶缓冲液，10毫摩尔ATP，4微升的10mM dNTP混合物，5微升T4 DNA聚合酶（3U /微升） ，1微升Klenow酶DNA聚合酶（5U /微升）和5微升T4多核苷酸激酶。总体积为100微升。用移液拌匀。避免泡沫和气泡。
   2. 孵育在20℃下30分钟。
   3. 净化用PCR纯化试剂盒或根据制造商的方案SPRI珠粒的DNA。稀释成33微升缓冲EB DNA。最后的洗脱液〜32＃181，L。
3. 加入"A"出挑
   1. 建立从3.2.3在冰上反应与洗脱液，5微升10×Klenow酶缓冲液，10微升1 10mM的dNTP，和3微升Klenow酶（3'→5'外切）（5U /微升）。总体积为50微升。用移液拌匀。避免泡沫和气泡。
   2. 在37℃下进行30分钟。
   3. 净化用PCR纯化试剂盒或根据制造商的方案SPRI珠粒的DNA。稀释成22微升缓冲EB DNA。最后的洗脱液〜21微升。
4. 结扎测序适配器
   1. 准备测序接头^28。
      1. 重悬每个适配器寡聚至100μM的在10mM Tris-Cl（上pH值7.8），0.1毫摩尔EDTA（pH8.0）中和50mM NaCl的浓度。
      2. 混合的通用适配器^28和索引适配器²⁸等体积。
      3. 退火适配器用下面的热循环仪程序:95℃，2分钟; 140个循环30秒开始在95℃和0.5℃的每个周期降低;保持在4℃。
      4. 分装适配器并储存在-20℃。
   2. 设置在冰上从3.4.1.4和2.5微升T4 DNA连接酶的反应从3.3.3洗脱液，25μl的2×连接缓冲液，1.5微升50μM的退火测序接头（在冰上解冻）。用移液拌匀。避免泡沫和气泡。如果多重测序需要，使用不同的索引适配器每个样品。
   3. 在室温下孵育1小时。
   4. 净化用PCR纯化试剂盒或根据制造商的方案SPRI珠粒的DNA。稀释成24微升缓冲EB DNA。最后的洗脱液〜23微​​升。
5. 转换Y形适配器双链DNA，以便准确地确定DNA片段大小²⁸
   1. 设置在冰上的反应与3.4.4洗脱液，12.5微升_H 2 O的，1微升25μM的引物1 ^28，1微升25μM的引物2 ²⁸ 1.5微升的10mM的dNTP，10微升5×PCR缓冲液和1μl的DNA聚合酶（1U /微升）。
   2. 运行的PCR如下:95℃，3分钟; 5个循环的98℃15秒，63℃，30秒，72℃30秒; 72℃，1分钟; 4℃搁置。
   3. 净化用PCR纯化试剂盒或根据制造商的方案SPRI珠粒的DNA。稀释成11微升缓冲EB DNA。最后的洗脱液〜10微升。
6. 大小选择库
   1. 制备用1×TAE缓冲液的2％琼脂糖凝胶。加入溴化乙锭（ 小心！），以500纳克/毫升的最终浓度时熔化TAE琼脂糖溶液冷却，以避免溴化乙锭的吸入。确保有足够的通道对所有样品，DNA梯和空车道。
   2. 从3.5.3添加8微升6X样染料的洗出液。
   <李>混合1 kb的DNA加梯（1.0微克/微升），6X样染料和H _{2 O}以1:2的比例制备DNA梯:1:4。
   3. 负载6微升DNA梯，从3.6.2在一个单独的车道，并与相邻的采样/梯子至少一个空巷的样本和另外6微升DNA阶梯，每一个。
   4. 运行在120伏的凝胶60分钟。
   5. 查看紫外透射凝胶（最小化的曝光时间，以UV）的。戴安全防护眼镜和面罩。确保该DNA梯中的至少一个具有适当间隔（足够用于切除3凝胶切片）300 bp和400bp的条带之间良好运行。窄间距增大切除多个凝胶切片的困难，而宽的间隔增大切凝胶切片的体积。
   6. 使用新的手术刀或刀片用于每个通道。消费300和从每个车道的400bp之间的三个薄凝胶切片（图4），并将其放置在每一个微量离心管中。保持每个胶S的量虱尽可能低（<100微升）。
   7. 测量每个凝胶片（1微升凝胶重量约为1毫克）的量，加QG缓冲区6X体积和孵化在50℃。
   8. VORTEX的QG-凝胶混合物每2-3分钟，直到凝胶条完全溶解。加入异丙醇2倍凝胶体积和混合。
   9. 从这个步骤，遵循凝胶提取试剂盒的协议。稀释成51微升缓冲EB DNA。最后的洗脱液〜50微升。
7. 丰富测序衔接修饰的DNA片段
   1. 优化PCR循环^29的数目。
      1. 设置了从10年6月3日1微升洗脱液，1微升25μM的引物1 ^28，1微升25μM的引物2 ²⁸ 7微升_的 H 2 O和10微升的SYBR Green超在冰上进行反应。总体积为20微升。
      2. 运行的qPCR如下:95℃，3分钟; 20个循环的95℃，30秒，63℃30秒，72℃，30秒，读板。
      3. 分析用的qPCR分析软件数据，并确定所述定量循环（CQ）或阈值循环数（Ct）使用制造商的协议的每个样品。继续与具有Cq的/ CT≤14.使用样品的最大的Cq（Cq的_0）减去1（上舍入到下一个较高的整数）作为最终的PCR循环数目（N _PCR）。
      4. 调整的DNA模板的量，使不同的样品将在运行的PCR循环数相同之后被放大到近似等量。使用8微升模板具有最高的Cq（Cq的_0）的样品，并计算其它样品用以下公式的模板量:
         _第一卷 = 8×1.8 ^{的Cq _我 -cq ₀}
   2. 设置PCR反应在冰上用从3.7.1.4计算出的模板卷:1微升25μM的引物1 ^28，1微升25μM的引物2 ²⁸ 1.5微升的10mM的dNTP，10微升5×缓冲液，1μl的DNA聚合酶（1U /微升）和用H _{2 O}充满至50微升的总体积。
   3. 运行的PCR如下:95℃45秒; _ÑPCR循环 98℃（在3.7.1.3确定），15秒，63℃，30秒，72℃30秒; 72℃，1分钟; 4℃搁置。
   4. 在2％琼脂糖凝胶（图5A）分析5μl的PCR产物。一个明显的"单一"带表明扩增的DNA片段是一个窄的长度范围内，并且该DNA库可以进行进一步的分析。
   5. 重复一反应对选定的样品和从同一样品池扩增的DNA文库。
   6. 净化测序选择的DNA库。
      1. 如果引物/二聚体适配器是不可见的3.7.4，净化用PCR纯化试剂盒或根据制造商的方案SPRI珠粒的DNA文库。稀释成21微升缓冲EB DNA。该最后的洗脱液〜20微升。如果用户的测序设施对洗脱缓冲液中，最终体积等的具体说明，相应的准备样品。
      2. 如果底漆/适配器二聚体都清晰可见3.7.4，净化库如下。
         1. 从3.7.5负载DNA和DNA的阶梯在2％的预制琼脂糖凝胶。如3.7.6.1中所述，以减少体积或可以装入多个井的样品可被纯化。将琼脂糖凝胶在适当的电源系统。使凝胶运行15分钟。
         2. 使用适当的透射，切出的期望的频带用干净的解剖刀/剃刀每个样品，然后将凝胶切片在1.5ml微量离心管中。
         3. 根据制造商的方案用两个修饰使用凝胶提取试剂盒分离DNA:在一个热混合器孵育缓冲QG-凝胶混合物在37℃和1000转进行30分钟，并添加异丙醇2×凝胶卷。
8. 提交纯化的DNA库，测序设施。遵循所有设施的准则。
   注意:由生物分析仪（图5B）一个质量分析，以确定确切的尺寸范围和DNA文库的浓度应进行测序之前。

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结果

大坝-V5-LmnB1融合蛋白被确认已共定位与内源拉明乙蛋白通过免疫荧光染色（ 图1）。

腺嘌呤甲基化DNA片段的成功的PCR扩增为DamID-SEQ的关键步骤。实验样品应扩增的0.2污迹- 2 kb的，而阴性对照（无DPNI，没有连接酶或不含PCR模板）应导致无或明显较少的扩增（ 图2）。

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讨论

Whether Dam-tagged proteins retain the functions of endogenous proteins should be examined before a DamID-seq experiment. The subcellular localization of Dam-tagged nuclear envelope proteins should always be determined and compared with that of the endogenous proteins. For studying transcription factors, it is suggested to examine whether the Dam-fusion protein can rescue the functions of the endogenous protein in regulating gene expression. This functional test can be performed in organisms in which knockout mutants of ...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ViraPower Lentiviral Expression Systems	Life Technologies	K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20, and K371-20
Gateway BP Clonase II Enzyme Mix	Life Technologies	11789-020
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix	Life Technologies	11791-020
DNeasy Blood & Tissue Kit (250)	QIAGEN	69506 or 69504
Gateway pDONR 201	Life Technologies	11798-014
293T cells	American Type Culture Collection	CRL-11268
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Life Technologies	25300-054
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995-065
Fetal Bovine Serum	Sigma	F4135
Tris			brand not critical
EDTA			brand not critical
200 Proof EtOH			brand not critical
Isopropanol			brand not critical
Sodium Acetate			brand not critical
DpnI	New England Biolabs	R0176	supplied with buffer
DamID adaptors "AdRt" and "AdRb"	Integrated DNA Technologies		sequences available in ref. 24; no phosphorylation of the 5' or 3' end to prevent self-ligation.
T4 DNA Ligase	Roche Life Science	10481220001	supplied with buffer
DpnII	New England Biolabs	R0543	supplied with buffer
DamID PCR primer "AdR_PCR"	Integrated DNA Technologies		sequences available in ref. 24
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	New England Biolabs	N0446	100 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP
Advantage 2  Polymerase Mix	Clontech	639201	supplied with buffer
1Kb Plus DNA Ladder	Life Technologies	10787018	1.0 µg/µl
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104 or 28106
MinElute PCR Purification Kit	QIAGEN	28004 or 28006	for an elution volume of less than 30 µl
SPRI beads / Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63880	apply extra mixing and more elution time if less than 40 µl elution buffer is used
Buffer EB	QIAGEN	19086
NEBNext dsDNA Fragmentase	New England Biolabs	M0348	supplied with buffer
T4 DNA Ligase Reaction Buffer	New England Biolabs	B0202
T4 DNA Polymerase	New England Biolabs	M0203
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment	New England Biolabs	M0210
T4 Polynuleotide Kinase	New England Biolabs	M0201
Klenow Fragment (3’ → 5’ exo-)	New England Biolabs	M0212	supplied with buffer
sequencing adaptors	Integrated DNA Technologies		sequences available in ref. 28
Quick Ligation Kit	New England Biolabs	M2200	used in 3.4.3; supplied with Quick Ligation Reaction Buffer and Quick T4 DNA Ligase
sequencing primer 1 and 2	Integrated DNA Technologies		sequences available in ref. 28
KAPA HiFi PCR Kit	Kapa Biosystems	KK2101 or KK2102	supplied with KAPA HiFi DNA Polymerase, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer and 10 mM dNTP mix
agarose	Sigma Aldrich	A4679
ethidium bromide	Sigma Aldrich	E1510-10ML	10 mg/ml
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28704 or 28706
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories	1725121 or 1725122
Spectrophotometer			brand not critical
0.45 μm PVDF Filter			brand not critical
25 ml Seringe			brand not critical
10 cm Tissue Culture Plates			brand not critical
6-well Tissue Culture Plates			brand not critical
S1000 Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories		for qPCR
Vortex Mixer			brand not critical
Dry Block Heater or Thermomixer			brand not critical
Microcentrifuge			brand not critical
Gel electrophoresis system with power supply			brand not critical
Magnet stand			for purification of DNA with SPRI beads; should hold 1.5-2 ml tubes; brand not critical
UV transilluminator			brand not critical
E-gel electrophoresis system	Life Technologies	G6400, G6500, G6512ST