一种方法来提高背根神经节的对齐和髓鞘

摘要

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

摘要

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

引言

在神经损伤，近端和远端神经断端经常由神经束的直接调整防止由于病灶部位^1-2。通常情况下，轴突束是由轴突高度有序的排列和捆绑，形成连通的复杂网络。然而，神经再生是由于缺乏组织轴突^3-4对准一个混乱的过程。因此，为了产生足够数量的再生该桥接病灶部位的轴突，有必要以诱导良好的组织轴突对齐。此外，伴随脱髓鞘由于在损伤部位的髓鞘细胞的死亡神经损伤。由于脱髓鞘强烈损害神经轴突尚存的导电能力，靶向治疗脱髓鞘或促进髓鞘是神经损伤后⁵功能恢复显著。因此，这个协议的目的是为了说明工程方法，解决这两个问题神经再生。

面各向异性，当沿着不同的轴测量，在材料的物理或机械性能被定义为一个差，已经应用影响细胞对准，生长和迁移^6-7。除了地形，还有其他的方法来诱导各向异性。先前，我们研究了通过聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜的机械静态预拉伸诱导的表面的各向异性。 "强加于大小变形超级"的理论预测，将细胞在拉伸方向感测有效刚度与垂直方向不同，并且在有效刚度这种差异是由于表面各向异性^8。间充质干细胞（MSC）上的预拉伸的PDMS膜培养能够通过积极地拉动面，其结果，以感测的各向异性，在预拉伸方向⁹对齐。同样地，各向异性表面芳从一个机械预拉伸的表面伊辛影响对准，以及生长和髓鞘形成背根神经节的（DRG）轴突^10。在这里，我们提供了一个静态预拉伸PDMS基板上诱导表面各向异性以增强轴突再生¹⁰的协议。

为了激发轴突对齐，用需要的模式拓扑特征，通过报道排列的纤维和渠道^6,11-12提供联系指导，被证明有利于轴突排列^11,13。但是，报道了通过拓扑特征，如纤维，频道和图案化诱导轴突对准技术，无法延长并增加轴突的厚度。与此相反，逐步机械拉伸导致更长和更厚的轴突与该拉伸¹⁴的幅度增大拉伸方向轴突对齐。然而， 在体内的结合有动力的电机装置不可行。与此相反，静态预拉伸引起的各向异性是不太复杂，并且可以更容易地并入未来支架设计用于体内应用。

在这个协议中，静态预拉伸细胞培养系统用于诱导表面各向异性无拓扑特征。预拉伸培养系统由PDMS膜，可拉伸帧和拉伸阶段，随后该膜被固定到框架和预定的拉伸幅度施加在拉伸阶段。预拉伸表面上培养了21天新鲜分离的DRG神经元中轴突对准和厚度进行监测。接着，雪旺细​​胞（SC）上的对准轴突为髓鞘监测共培养。通过采用预拉伸诱导表面各向异性，我们能够提高MSC和背根神经节^9-10，分别对准细胞分化和轴突对齐增长。

研究方案

对于细胞的分离所有的程序是由机构动物护理和使用委员会在密歇根州立大学获得批准。

1.预拉伸各向异性表面的制备

1. 混合10:基和固化剂的1溶液，将混合物倒入一个组织培养皿（直径12cm）。用4900毫克碱和490毫克的固化剂的总交联混合物。
2. 保持在真空下的凝胶混合物20分钟以除去气泡。
3. 放置在烘箱中的凝胶混合物过夜固化在60℃下。
4. 的PDMS膜固化之后，使用等离子体清洁/刻蚀系统在165毫托3分钟和O ₂的65sccm的流处理表面用氧等离子体。
5. 切下一块从盘矩形薄膜（5×3.5厘米），而被认识到是哪一方氧处理，确保氧治疗面朝上，并固定到拉伸框架。放置在一个框架拉伸阶段并通过在阶段转动旋钮直到它达到10％伸长均匀伸展​​;在较长轴^9（或某些其他预定拉伸伸长率可以从拉伸阶段被直接读出）。拧紧框架上的螺钉固定伸展。
6. 取下阶段框架。确保膜表面是干燥，无粉尘，然后将硅氧烷室在膜允许腔室的粘性侧紧紧附至膜。
   注:硅胶室提供了一个良好的保持在PDMS膜细胞培养基。该装置的设计示于图1。
7. 消毒用UV表面10分钟。
8. 加入1 ml聚-L-赖氨酸（PLL）（在磷酸盐缓冲盐水0.01％），以在腔室中与PDMS表面，等离子处理的6小时内，在37℃下孵育2小时以播种DRG神经元之前。这增强细胞附着。

DRG乐"> 2。隔离

1. 准备标准生长培养基的DRG神经元。
2. 之前的隔离，高压灭菌的隔离设备和过滤器的试剂。添加5毫升隔离缓冲成一个6孔板的一个孔中，并将板在冰上。通过加入1毫升的胶原酶A（500U /毫升）至9毫升0.05％胰蛋白酶-EDTA（1毫克/毫升）制备出10毫升离解培养基中，筛选用0.22微米的过滤器，并置于冰上的解决方案。
3. 使用十到十二5 - 天的Sprague-Dawley大鼠7为隔离。喷用75％异丙醇的幼仔，并且通过断头牺牲。
4. 切去皮肤覆盖从背面脊髓和移除脊柱周围的任何多余的组织。在手术放大镜手术射灯上，从颈部做切口第一，然后沿两边用剪刀脊柱一截。从分离幼仔的尸体脊柱和去除多余的肌肉。然后，用剪刀沿经度切脊椎和使用镊子克轴完全打开脊椎和吸管抽取脊髓cord.Remove尖端创建用于隔离缓冲病种付费转移到无菌的15毫升管一个更大的开口。
5. 用细镊子，取出骨口袋里的神经节，并收集大约10 - 双方16 DRG。修剪神经根和神经节转移到冰冷的分离缓冲液。
6. 从吸管取出提示创建用于隔离缓冲病种付费转移到无菌的15毫升管一个更大的开口。化学解离后，离心神经节在900 XG和4℃5分钟。
7. 让组织沉降到试管底部并轻轻取出顶部的隔离缓冲器和加入10 mL离解培养基进入管。
8. 孵育在解离介质的解剖组织在一个37℃的水浴中1小时，同时摇动管每5 - 10分钟。
9. 后化学离解，离心机在900 XG的神经节和4℃5分钟。
10. 除去上清液并重新悬浮在10ml的标准生长培养基和涡流沉淀。
11. 离心离解的细胞作为第2.9指示一次。
12. 除去上清液，再暂停于12ml标准培养基和旋涡的沉淀。

3. DRG的文化对预拉伸面

1. 之前接种细胞，从室移除PLL方案，并用无菌水和空气干燥冲洗PDMS表面。
2. 重新悬浮细胞后，让1的悬浮液组 - 2分钟，以允许碎屑沉降到管底部。添加1.5毫升细胞悬浮液到各伸展腔，并在37℃下孵育5％的CO _2。
3. 为了消除神经胶质细胞，在第1天在体外 （DIV），加入10微升（或15微升）氟脱氧2尿苷和尿苷（FDU-U）股票soluti混合物上（见材料数据表 ）至各孔中。 7小时后，更换新鲜标准生长培养基这种介质和放置预拉伸培养装置在37℃培养箱，用5％ _的 CO _2。
4. 在细胞培养期间（2 - 3周），通过用新鲜培养基置换一半的用过的培养基改变媒体每两天。注意:培养2周拉伸未拉伸的表面上后，纯化的SC被添加到腔室和一个星期（步骤4.7）中培养。

4.预拉伸表面雪旺细胞（SCS）与DRG神经元共培养

1. 由坎帕纳博士的研究小组先前描述的¹⁵种姓隔离。
   1. 简单地说，从1日龄的小狗隔离旺。收集和分离坐骨神经在化学（胰蛋白酶EDTA和胶原酶A）和机械（18号针头/ 10 ml注射器^）15。
   2. 种子离解的细胞分化成多聚-D-赖氨酸（PDL）共ated T25烧瓶中，并培养在37℃，5％ _的 CO _2。在第5天，用抗Thy 1.1抗体和兔补体纯化通过抗体选择的细胞，并传代培养纯化的细胞通路2 - 4含Dulbecco氏改良的Eagle培养基（DMEM），10％胎牛血清使用培养基（FBS）的，1％青霉素/链霉素（佩恩/链霉素），21微克/ ml牛垂体提取物（BPE），和4μM的毛喉素。
2. 取下的SC培养基，加入5 ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA到烧瓶中。孵育所述细胞在37℃在5％CO ₂的2 - 3分钟。
3. 检查用10X物镜，看他们是否从烧瓶抬起，然后加入5毫升培养培养基中，并与在烧瓶中的细胞混合在光学显微镜下观察细胞。
4. 将细胞悬浮液添加到15ml离心管中并离心，在200 xg离心和20℃5分钟。
5. 去除上清，悬浮颗粒的7ml标准DRG增长MEDIA。
6. 取10微升细胞悬液到0.5 ml离心管，用10微升台盼蓝的混合，再算上用使用10X物镜光学显微镜下血球细胞数。通过加入DRG生长培养基稀释细胞悬浮液，以每毫升5,000个细胞。
7. 从DRG文化在拉伸室中取出0.5毫升培养基中，将0.5ml SC悬浮于DRG文化。
8. 培养在37℃和5％的CO _2。更改细胞1周媒体每两天通过用DRG新鲜标准生长培养基替换一半的用过的培养基。 1周共培养后，过程中的细胞通过免疫组织化学^10。

结果

预拉伸的细胞培养系统促进DRG轴突对准^10。 DRG神经元中培养到预拉伸和未拉伸的表面12天。轴突染色为β-III微管蛋白，以证明其对准。 图2轴突取向后培养12天的预拉伸和未拉伸的PDMS基底进行比较。背根神经节轴突对齐平行于拉伸方向的，而他们表现出随机取向并形成未拉伸的PDMS衬底上的互连网络。

除了?...

讨论

为了诱导对预拉伸的表面轴突对准，存在两个关键步骤:1）的PDMS膜必须是平坦的和均匀的厚度;和2）的神经胶质细胞，必须从DRG中移除。混合的PDMS和交联剂并在烘箱中固化后，交联的PDMS凝胶应保持在平坦的工作台上，并仔细处理，以免任何倾斜。的PDMS膜的氧等离子处理之后，应当锁相环涂层6小时内，由于表面的等离子体处理后的亲水性（细胞附着必需）衰减随时间。因为在等离子体处理被施加?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Medium 1x	GibcoBRL	21103-049
B27 Supplement 50x	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100x	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillin-streptomycin	GibcoBRL	15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysine	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolation Buffer
Type I Collagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Silicone chamber	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standard growth medium			For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml).
FDU Uridine stock solution			FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC.