结合近红外荧光成像和微计算机断层扫描直接可视化脑血栓

摘要

本协议描述相结合近红外荧光（NIRF）成像和微计算机断层扫描（显微）的可视化脑血栓中的应用。这种技术允许的血栓负担和演化的量化。该NIRF成像技术可视化荧光标记在切除脑血栓，而显微技术，可视化使用金的纳米粒子的生活里面的动物血栓。

摘要

直接血栓成像可视化血栓梗塞的根本原因。如果能够像血栓允许直接行程不是依靠间接测量的更好的调查，将是一个强有力的和强大的血管的研究工具。我们使用标签与分子成像血栓血栓标记的光学成像方法 - 该凝块的成熟过程中被共价连接至由活化的凝血因子的ⅩⅢa的血纤维蛋白交联的酶作用的血栓的纤维蛋白丝一经Cy5.5近红外线荧光（NIRF）探针。的微型计算机断层扫描（显微）基的方法是使用官能化以靶向凝块的主要成分血栓求金粒子（AuNPs）:纤维蛋白。本文描述了组合的体内显微和栓塞性中风的小鼠模型血栓栓塞的体外 NIRF成像的详细协议。我们表明， 在体内</ em>的显微和纤维蛋白靶向乙二醇壳聚糖纳米金（FIB-GC-金纳米粒子）可同时用于原位血栓和脑栓塞血栓可视化。我们还描述了使用在体内基于Micro-直接血栓成像以串行监控组织纤溶酶原激活介导的溶栓治疗效果。最后成像会议之后，我们证明通过体外 NIRF成像的程度和残留血栓栓塞的在脑中的分布。最后，我们描述了显微及成像NIRF数据定量分析图像。直接血栓成像的组合技术允许血栓可视的两个独立的方法来进行比较:血栓有关的荧光信号对区域体外 NIRF成像与高密度显微血栓体内的体积。

引言

在一个6人将在其一生某个时候中风。缺血性中风是迄今为止最常见的中风类型，占所有中风病例的80％。因为血栓引起广大这些缺血性中风，存在直接血栓成像的兴趣日益增加。

据估计，约200万脑细胞大脑中动脉闭塞¹的每一分钟期间死亡，导致的口号"时间就是大脑"。计算机断层扫描（CT）的研究可以快速完成，并且被广泛使用;因为这个原因，CT仍首选初始诊断和治疗超急性缺血性中风的成像。 CT是用于通知重要的早期决定特别有价值的:溶栓施用组织纤维蛋白溶酶原激活剂（tPA）和/或归类（triaging）到血管内凝块检索^2。当前的CT-基于血栓成像，但是，不能连续跟踪大脑体内升血栓栓塞，因为它使用间接方法来证明血栓:由碘化造影血池的混浊后，血栓被表现为在容器填充的缺陷。有与碘造影剂的重复给药相关的剂量限值和风险，排除重复的血栓成像用这种方式。

因此，为直接成像方法在中风患者脑血栓迫切需要，允许更快和更好的治疗决定作出。我们提出通过增强的CT，目前使用的前线成像模态对行程的值，与使用血栓寻求纳米粒分子成像剂来实现这一点。

我们已经利用显微计算机断层摄影术（显微），高分辨率的离体或在体内 （小动物）的CT成像版本，允许快速的数据采集<展示了使用本剂的SUP> 3,4。即使有可供小动物显微（比从人类大小的扫描仪差很多）相对较差的软组织对比度，成像剂是能够寻求和使他们对CT，通过分子加强了"密集的血管征"高密度标记血栓成像。

补充CT技术，我们集团之前开发利用经Cy5.5近红外荧光（NIRF）探针可视化脑血栓负担⁵光学直接血栓成像技术。这是验尸大脑的体外技术，但高度敏感，并提供在研究环境体内数据确认。

拥有CT和NIRF都基于血栓寻求成像技术使我们能够比较和对比这些技术来实现对血栓和血栓成像在缺血性中风的发展进程中的作用非常翔实的数据。

HERE，我们描述了在体内的显微和体外成像NIRF的组合技术的详细协议直接看到血栓栓塞的栓塞性中风的小鼠模型。这些简单的和鲁棒的方法是通过在治疗期间在体内使在血栓负荷/分布和动态血栓演化的表征体内评估准确迅速和定量方式推进我们血栓性疾病的理解是有用的，其次是提供体外数据作为体内成像结果的确认对照和参考标准。

研究方案

在这个协议证明了所有的动物程序已经审查并东国大学一山医院动物护理和使用委员会批准，并按照NIH的指南中列出的照顾和动物使用的原则和程序进行的。

1.外源性形成凝块的制备荧光标记标记（图1）

1. 在用3％异氟烷，用30％的氧气（1.5L /分钟100％的氧气）混合感应腔麻醉的小鼠。通过观察肌张力，并确认不存在脚趾捏反射确保麻醉深度足够。
2. 放置在俯卧位的无菌披盖的动物，并使用吸入面罩和2％异氟醚，用30％的氧气混合，保持麻醉下。通过执行无菌技术和无菌衣/口罩/手套/仪器下面的步骤。保持通过清洗和前一消毒用70％酒精实验区在无菌条件第二手续后。
3. 心脏穿刺后⁶收集约300〜1000微升动脉血。混合70微升的全血用30微升C15探针^5（20微摩尔/ L的浓度），一个经Cy5.5荧光探针来活化因子XIII（FXIIIA）凝血酶的血纤维蛋白交联的活性敏感，要荧光标记凝块（ 图1A ）。使用3毫升注射器（23号针）到一个20cm长的聚乙烯管（PE-50，ID0.58毫米）注入该混合血液。聚乙烯管道必须被消毒（或认证的由制造商无菌）和血块必须在组织培养罩无菌制备。
4. 通过观察呼吸不足和心脏脉搏的检查动物的死亡。
5. 留在室温下将血液装管2小时，然后在4℃下22小时，并执行下列步骤，如先前报道^7。
6. 切含血栓管进入1.5厘米长的小段。使用3毫升注射器填充有磷酸盐缓冲盐水（PBS），通过轻轻注入PBS成每片管的驱逐血栓到含PBS-6孔板中。用PBS（ 图1B）洗血栓三次。
7. 通过仔细地绘制洗涤血栓，同时避免气泡，用生理盐水填充1ml注射器用30用1.5厘米长的血栓装载有15厘米长的PE-10管（ID0.28毫米）的前端部被插入到该管的近端号针头。
8. 血栓加载PE-10管连接与修改，以具有锥形端部（ID 200微米）一个3厘米长的PE-50管（ID0.58毫米），这将被放置在大脑中动脉（MCA） - 大脑前在栓塞性中风的小鼠模型（ 图1C）颈内动脉（ICA）的动脉（ACA）的分叉区域。

2.造型血栓栓塞性中风的小鼠模型（图2）

1. Anesthetiz如先前在用3％异氟烷，用30％的氧气（1.5升/分钟）混合感应室报告⁷被抚摸EA不同的鼠标。美洛昔康注射（5毫克/公斤）皮下注射，以减轻术后疼痛。通过观察肌张力，并确认不存在脚趾捏反射确保麻醉深度足够。
2. 适用兽医软膏少量每只眼睛，以防止麻醉期间干燥。通过执行无菌技术和无菌衣/口罩/手套/仪器下面的外科手术。保持通过在清洗之前，用70％的酒精消毒手术区，无菌条件下，并在手术后。
3. 将鼠标移动到手术台。放置在俯卧位的无菌披盖的动物，并使用吸入面罩和2％异氟烷保持麻醉下。然后，使用具有反馈的恒温毯从直肠温度计夹住体温在36.5℃。
4. surgi后校准制备具有优碘和70％的酒精，通过使用在左耳和眼睛之间的头皮手术刀使1cm的垂直切口。胶光纤激光多普勒流量计到暴露的左颞骨表面的远端（1 Mm左和来自前囟低于4毫米）。然后，开始多普勒血流监测（ 图2A）。
5. 放下动物。通过拉动与附连到销的字符串上门牙拉直颈部和剃颈部区域。然后，使3厘米的垂直正中切口，传播它开放，通过解剖周围的血管软组织暴露左侧颈动脉球区。要小心，不要伤害迷走神经。
6. 结扎用消毒6-0黑丝线缝合左侧近端颈总动脉（CCA），以及结扎左ICA和使用无菌7-0黑丝线缝合左侧翼腭动脉（PPA）。
7. 烧灼左甲状腺动脉，这是左外颈动脉USI的一个分支NG单极电烧灼，结扎和左近端颈外动脉（ECA）松散和紧密用无菌7-0黑丝线缝合更远端站点。
8. 用微型剪刀，进行ECA的连接点之间的小孔（直径约0.2〜0.25微米）。
9. 将含血栓导管插入在ECA孔同时放松近端结扎ECA。推进导管进入CCA为了以收紧导管到位后，重新拧紧近端结扎ECA。
10. 烧灼切割ECA远端部分，也就是远离远端结扎部位，并旋转自由近端ECA顺时针它对齐到ICA的方向同时取出从CCA导管。然后，将导管大约9mm到MCA - 远端ICA的ACA分支区域松开ICA结扎后立即生效。然后，拧紧结扎ICA。
11. 放置血栓进入分叉区轻轻按压注射器1毫升注射血栓。检查多普勒脑血流量（CBF），这应该由30％或更低的降低与基线相比，如果血栓成功闭塞血管（ 图2B）的下降。
12. 取出导管，并立即紧紧地结扎ECA近端部位。此外，unligate共同国家评估和PPA。
13. 关闭用6-0丝线缝合切口部位。继续进行多普勒监测过的所需时间跨度（在此，为血栓注射后30分钟）后，停止麻醉。返回鼠标在一个空笼子，并保持温暖，取暖灯。直到它已获得了足够的意识，以保持胸骨斜卧不要离开鼠标无人值守。

3. 在脑血栓的体内显微成像（图3）

1. 重新麻醉作为在预先指定的时间点在步骤2.1中所述，用2％异氟醚的小鼠（在此，1小时）的发作以下栓塞性中风的因血栓，在脑动脉的位置。通过确认不存在脚趾捏反射确保麻醉足够深度。适用兽医软膏少量每只眼睛，以防止麻醉期间干燥。
2. 在在10mM PBS中的10毫克的Au / ml的浓度重新悬浮的血纤维蛋白靶向金纳米颗粒（FIB-GC-金纳米粒子^4），超声处理的血栓成像剂为30分钟，以确保纳米粒子的溶解和分散。注入300μl的FIB-GC-金纳米粒子（10毫克/毫升）插入阴茎静脉。
3. 放置在显微机的床中的动物，并且通过拉动与连接到一个销，以减少运动伪影的字符串上门牙拉直颈部。
4. 在FIB-GC-金纳米粒子的注射后5分钟，开始获取脑的显微图像。对于这里所描述的实验，请使用以下的成像参数:65 kVp的，60μA，观点26.7点¯x26.7点¯x27.9毫米³场，0.053点¯x0.053×0.054毫米³像素大小，每帧100毫秒，1平均，360视图，512×512的重建矩阵，600片，64秒的扫描时间。
5. 返回鼠标在一个空笼子，并保持温暖，取暖灯。直到它已获得了足够的意识，以保持胸骨斜卧不要离开鼠标无人值守。
6. 使用安装在显微扫描仪的一个软件包的" 重建 "面板的" 开始 "命令变换医学（DICOM）格式的原始图像数据转换成数字成像和通信。
7. 为图像（在步骤6）的定量分析，通过根据制造商的说明使用市售软件包变换DICOM数据转换成TIFF格式。
8. 定性分析和定量在一个更简单和更快速的方式进行分析，使用的软件包和原始0.054毫米厚图像以DICOM格式，用于产生一组新的呈现具有1或2毫米（这里，2mm）的厚度，如下轴向和冠状图像。
   1. 选择在" 数据源 "树中的DICOM文件夹，单击鼠标右键，并将该文件夹导入到"MasterDB'或'PrivateDB"。
   2. 点击"MasterDB'或'PrivateDB"中的"数据源"树，然后选择导入文件夹。点击最左边的面板中的"3D"选项卡后，当"加载选项"窗口弹出时，按下" 确定 "导入图像序列中的文件夹作为一个堆栈英寸
   3. 通过点击在轴向和冠状图像窗口单词' 的MRP'和选择弹出菜单上'MIP'改变图像表示以最大强度投影（MIP）格式。在同一个窗口:然后，点击'0毫米] TH'后的图像厚度更改为2毫米。
   4. 使用2mm宽的3D娜vigator栏，允许探索的图像堆栈，并在适当的角度和位置，它切片，与威利斯（COW）的圆形，其中港口血栓的全覆盖制备2mm厚的轴向截面图像。点击" 输出 "面板上的拍摄按钮（相机图标）。保存为TIFF格式的图像。
9. 然后，准备五个双毫米，而且从额叶小脑连续覆盖厚冠状切面图像。
   1. ACA血栓 - 首先，由轴向图像上仔细对齐导航栏，以便日冕图像最能直观马华准备第二片。
   2. 接着，在连续方式制备其他四片。点击" 输出 "面板上的拍摄按钮（相机图标）。 TIFF格式保存图像。

4.溶栓及在脑血栓的体内显微成像（图3）

1. 准备100厘米长的PE-10管与在一端上有30号针头，而在另一端的1ml注射器。填用盐水（600微升）或tPA的（在此，24毫克/千克，600微升），同时避免气泡管。
2. 如在步骤2.1中所述重新麻醉小鼠。插入动物的阴茎静脉内针尖。小心地将动物到显微机的床。然后，固定并通过将其编带至床稳定导管系统的静脉内注射的一部分。
3. 执行后续成像会议前处理基线。然后，通过按压针筒柱塞到导管系统注入或60微升生理盐水或tPA的。在推注后，开始注入在一段时间（在此为30分钟）余下的溶液（540微升）。
4. 在预先指定的时间点获得使用相同的参数如在步骤3.4显微图像:在这里，在推注后3和24小时。要执行以下体外血栓NIRF大脑的总线成像，通过颈脱位安乐死麻醉下的动物。

5. 离体 NIRF血栓影像与三苯四唑氯化物（TTC）的脑组织的染色（图4）

1. 断头后，取出头皮并通过与从枕骨大孔达向矢状缝剪刀剪头骨。通过仔细地提升用剪刀，同时避免伤害到下面的大脑颅骨切开的边缘，从而一语道破半球删除颅腔。
2. 切出视神经在大脑基底尽可能接近到脑表面，因为它们可以与威利斯动脉的圆，应该在NIRF成像可视化重叠。然后，为了清楚地可视化的Y形"MCA / ACA /远端ICA'为NIRF血栓成像，之后轻轻压缩小脑基，以暴露第切出的远端的ICAs尽可能给脑表面Ë切割点（ 图4A）。
3. 执行NIRF成像（激发/发射675 / 690nm下1秒的曝光）及其碱朝上（ 图4B，C），其中可视化的荧光标记的血栓在COW的动脉去除的脑组织（ 图4D） 。然后，用脑朝上，该可视化皮质血栓栓塞的顶点执行附加成像。通过将盐水几滴在组织避免大脑的干燥。
4. 使用根据制造商的说明脑矩阵器件，快速地准备冠2mm厚的脑切片:6片2mm厚片（2.3，0.3，-1.7，-3.7，从前囟-5.7毫米）。通过使用盐水液滴避免大脑切片干燥，并执行前和各部分的背面两者的NIRF成像。
5. 放入2％三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液中的大脑切片20分钟，同时避免暴露到二极管灯吨。然后，将切片在4％甲醛溶液在4℃下，同时避免暴露于光。

采用显微图像和ImageJ的（1.49d）软件6.血栓面积的定量（图5）

1. 打开图像（ 图5A）。
   1. 打开图像序列文件选择" 文件>导入>图像序列 "或" 文件>打开 "创建堆栈文件。通过使用" 图像>类型> 8位 "将图像转换为8位灰度。
2. 转换英寸该股毫米（ 图5A）。
   1. 当CT图像文件中的一个像素对应于0.053毫米，可以使用"分析>设置缩放'进入'1'，'0.053"，并为" 距离像素 '毫米'，' 已知距离 "，和长度的 ' 单元 '， 分别。
   2. 当（只）比例尺是可用的，使用"直线"工具绘制与它的长度等于标尺条的一条线。然后，使用" 分析>设置规模 "，进入毫米的比例尺的长度。
3. 背景减法（ 图5B）
   1. 通过使用" 编辑>选项>指定'的地方对脑实质的领域的兴趣（ROI）圆形或矩形区域无血栓或骨相关的高密度地区。因为指定的投资回报率适用于堆栈的每一个切片检查，以确保如果没有在每个片高密度的区域重叠。
   2. 选择"插件>投资回报率>从投资回报率BG减法'，为'从平均标准偏差数"进入2.0。
4. 血栓栓塞相关病变高密度分割（ 图5C）
   1. 选择" 图像>调整>阈值"，然后输入罗"的价值观WER门限电平"和"上限程度"分别为22和255。选择"上/下"，以显示在下方的蓝色灰度，阈值像素下限阈值像素，并且像素绿色上限阈值以上。
   2. 使用"写意选择工具"绘制围绕血栓相关的高密度灶，而不包括骨性领域的投资回报。在绘图过程中，按住要么[SHIFT]或[ALT]添加或删除一个区域，分别为。
      注意:如果高密度血栓栓塞病灶从骨结构遥远，而不是'手绘选择工具"，"棒工具"可以安全地在不改变它的"容差"电平使用。
5. 该分段病变的定量分析（ 图5D）
   1. 使用"分析>设置测量'选择'区'，'平均灰度值"和"集成密度（区X平均值）9 ;.检查下列选项:"限价至阈值"和"显示标签"。使用"分析>测量"来获取量化数据。然后，将结果保存为一个"的.xls"文件。
   2. TIFF格式存储堆栈文件。此外，使用" 分析>工具>投资回报率经理保存的ROI。

结果

基线显微图像， 在体内得到施用FIB-GC-金纳米粒子（10毫克/毫升，300微升）以栓塞性中风后1小时，明显地显现在MCA脑血栓后-远端颈内动脉ACA分叉区（ 图6 ）。后续显微成像显示，用生理盐水治疗血栓COW没有变化。然而，tPA的治疗显示COW血栓的逐渐溶解（ 图6中的蓝色箭头）。这一发现表明，显微血栓成像可以允许溶栓治疗监测。有一个在24?...

讨论

我们展示了使用两个互补的分子成像技术用于在栓塞性中风的实验模型直接血栓成像:血纤维蛋白靶向金纳米颗粒（FIB-GC-金纳米粒子），用于在体内基于Micro-成像和一个FXIIIA针对前光学成像探针体内荧光成像。

FIB-GC-金纳米粒子的静脉内给药后，血栓成为可见的CT为致密的结构，后浓度的梯度引起的颗粒变得由纤维蛋白 - 靶向肽的作用（该颗粒的表面上）?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Machines
microCT	NanoFocusRay, JeonJu, Korea	NFR Polaris-G90
NIRF imaging system	Roper-scientific,Tucson, AZ	coolsnap-Ez
Laser Doppler flowmeter	Perimed, Stockholm, Sweden	PeriFlux System 5000
Surgical microscope	Leica Microsystems, Seoul, Korea	EZ4HD
Inhalation anesthesia machine	PerkinElmer, Massachusetts, USA	XGI-8
Software
NFR control	NanoFocusRay, JeonJu, Korea	NFR Polaris-G90	microCT control software
Lucion	Infinitt, Seoul, Korea	Lucion	3D render imaging software
Lab chart 7	ADInstruments, Colorado, USA	Lab chart 7	rCBF
ImageJ software	Wanye Rasband, NIH, USA	1.49d	imaging analysis
Devices/Instruments
Infusion pump	Harvard, Massachusetts, USA	pump 22(55-2226)
Homeothermic blanket	Panlab, Barcelona, Spain	HB101
Pocket cautery	Daejong, Seoul, Korea	DJE-39
Brain matrice	Ted pella, CA, USA	15003	coronal section
PE-50 tubing	Natsume, Tokyo, Japan	SP-45(PE-50)	I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm
PE-10 tubing	Natsume, Tokyo, Japan	SP-10(PE-10)	I.D. 0.28 mm O.D. 0.61 mm
30 gauge needle	sungshim-medical, Seoul, Korea
Syringe	CPL-medical, Ansan, Korea		1 & 3 cc
Gauze	Panamedic, Cheonan, Korea
Tape	Scotch, Seoul, Korea	3M-810
Micro forceps	Fine Science Tools, Vancouver, Canada	11253-27	Dumont #L5
Micro scissor	Fine Science Tools, Vancouver, Canada	15000-03	Vannas spring
Scissor	Fine Science Tools, Vancouver, Canada	14084-08	8.5 cm
Black silk suture	Ailee, Busan, Korea	SK6071, SK728	6-0 and 7-0
Reagents
meloxicam	Yuhan, Seoul, Korea
vet ointment	Novartis, Basel, Swiss
10% Povidone-iodine (betadine)	Firson, Cheon-an, Korea
FeCl3	Sigma, Missouri, United States	157740-5G
TTC	Amresco, Ohio, USA	0765-100g
Isoflurane	Hana-Pham, Gyeonggi, Korea	Ifran	100 ml
PBS	Welgene, Daegu, Korea	LB001-02	500 ml
Gold nanoparticles			Synthesis
C15 optical agent			Synthesis
Tissue plasminogen activator	Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany	rtPA(actilyse)	20 mg
Normal saline	Daihan Pham, Seoul, Korea	48N3AF3	20 ml