JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

摘要

解脂耶氏是一种非致病的，二相性和严格的有氧酵母物种。由于其独特的生理功能和代谢特征，这非常规酵母不仅对真菌分化的基本性质的研究的良好模型，但也用于生化生产和各种生物技术应用，其需要大量的基因操作一个有希望的微生物的平台。不过，Y的遗传操作解脂一直有限由于缺少一种有效的和稳定的遗传转化系统以及可主要归因于KU70基因的非同源重组率很高。在这里，我们报告一个简单而快速的协议为高效遗传转化并为Y.基因缺失解脂 Po1g。首先，外源DNA的高效转化为Y.协议解脂 Po1g成立。山高次，以达到增强的双交换同源重组速率为靶基因的进一步缺失，所述KU70基因通过转化中断箱运送1kb的同源臂删除。第三，以展示KU70基因的缺失后增强的基因缺失的效率，我们单独删除11编码上使用KU70淘汰赛平台菌株的相同程序乙醇脱氢酶和醇氧化酶的靶基因。据观察，精确的同源重组的速率从低于0.5％大幅增加为删除 在Po1g的KU70基因到33％-71％，为单基因缺失Po1g KU70Δ11靶基因。复制型质粒携带潮霉素B抗性标记和酶Cre / loxP系统构建，并最终被Cre重组酶表达去除酵母基因敲除菌株的选择标记基因便于多轮圆盾的特德遗传操作。所得单基因缺失突变体具有在生物燃料和生化生产的应用潜力。

引言

不像酿酒酵母 ， 解脂耶氏，一个非常规酵母，可以响应于环境条件1,2-变化在酵母或菌丝的形式生长。因此，这种二形酵母可用作真菌分化，形态发生和分类​​3,4,5的研究的良好模型。它通常被认为是安全的（GRAS）的酵母物种，它被广泛用于生产各种食品添加剂如有机酸，多元醇，芳香化合物，乳化剂和表面活性剂6,7,8,9这样。它是专性需氧菌和能够以高含量自然积累脂质的公知的含油酵母， 即高达细胞干重10的70％。它也可以利用碳源的广泛增长，其中包括浪费资源的养分11,12,13不同种类的残留物。所有这些独特的功能使Y.为解脂非常有吸引力各种生物技术应用。

虽然Y的全基因组序列解脂已发表​​14,15，这种非常规酵母的基因操作比其它酵母种更加复杂。第一，该酵母物种的转化是有效的要少得多，由于不存在稳定高效的遗传转化系统16,17的。第二，线性表达盒的费力的基因组整合通常用于感兴趣基因的表达，因为没有天然游离质粒系统已经在该酵母18被发现。第三，代遗传敲奏和敲造访受到限制，因为该基因通过准确同源重组在该酵母靶向效率是低的，并通过非同源末端连接（NHEJ）19最积分事件发生。

在这项研究中，我们报道了Y.优化改造协议解脂 Po1g应变，这是很容易，快速，高效和可重复的。以提高精确同源重组的频率，我们删除KU70基因，其编码在NHEJ途径的关键酶。通过使用优化的改造方案和改造含有侧翼的1 kb的同源地区，Y的KU70基因的敲除线性磁带解脂 Po1g被成功删除。这种基因缺失的方法的稳健性然后通过在Po1g KU70Δ应变靶向乙醇脱氢酶和醇氧化酶基因的证明。据观察，在KU70缺失菌株表现出同源重组介导的基因的一个相当高的效率比野生型Po1g应变的定位。此外，携带潮霉素B抗性标记的复制的Cre表达质粒构建以执行标记救援。标记救援促进多轮基因在针对第Ë获得的基因缺失突变体。除了 ​​基因缺失，我们对这里描述的遗传转化和基因缺失协议可应用到插入基因的具体位点，并引入位点特异性突变引入Y.解脂基因组。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

1.新一代的Y的解脂 KU70删除应变

  1. 中断盒建设
    注:请参阅表1为聚合酶链反应（PCR）扩增使用的所有引物。
    1. 设计的引物20进行PCR扩增LEU2表达盒（ 见表1）从一个Y.和一个长的反向引物（＃2; 表1）分别; 解脂表达载体并引入LoxP位点到5'和3'LEU2启动盒与长正向引物（ 表1＃1）结束。引入用于克隆过程的后续步骤的额外限制性位点，加在引物＃1的巴姆 HI限制性位点。
    2. 使用高保真DNA聚合酶如表2中详述的进行PCR。
    3. 使用PCR purificatio纯化PCR产物loxP的启动子 - LEU2 - 终止-LoxP位盒根据制造商的说明Ñ套件。根据制造商的说明21 ...添加3'-A突出的纯化的PCR产物。使用T4 DNA连接酶结扎A-尾PCR产物入TA克隆载体，产生质粒T-LEU2按表3。
    4. 用PCR引物＃3/4＃从Y.扩增基因KU70的1 kb的5'上游序列解脂 Po1g按表2的基因组DNA 22。纯化使用根据制造商的说明一个PCR纯化试剂盒将PCR产物。
      1. 双重消化两个纯化的PCR产物和T-LEU2质粒用Sac II和BamHⅠ酶按表4。使用PCR纯化试剂盒按照制造商的说明纯化消化混合物。使用T4 DNA连接酶，以结扎纯化和消化的PCR产物的囊 II / T-LEU2的巴姆 HI位点，得到质粒T-LEU2-5E按表3。
    5. 使用引物＃5 /＃6从Y.扩增KU70基因的1kb的3'下游序列解脂 Po1g按表2的基因组DNA 22。纯化使用根据制造商的说明一个PCR纯化试剂盒将PCR产物。双重消化两个纯化的PCR产物和用Not I和的Nde I酶按表4的T-LEU2-5E质粒。
      1. 纯化使用PCR纯化试剂盒按照制造商的说明将消化混合物。然后，结扎纯化和消化的PCR产物的未 I / 的Nde I位点的T-LEU2-5E的，得到使用T4DNA连接酶按表3质粒的T-KO。
    6. 消化质粒T-KO用Sac II和NDE我酶按表4，产生中断盒（ 图1 的）。纯化使用PCR纯化试剂盒按照制造商的说明将消化的DNA片段。
  2. 感受态细胞制备和Y改造解脂 Po1g应变
    1. 感受态细胞制备
      1. 接种Y.的殖民地从在10ml YPD培养基（1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖和50mM柠檬酸盐缓冲液pH 4.0）中的100毫升烧瓶中新鲜酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）板解脂 Po1g菌株。孵育在30℃振荡培养箱中于225rpm下20小时，直到饱和度（的OD为约15 600，使用分光光度计测量）。
      2. 通过在室温下以5000 xg离心离心5分钟沉淀细胞。清洗细胞用20ml的Tris-EDTA（TE）缓冲液（10mM的Tris，1mM EDTA中，pH值7.5），并如在步骤1.2.1.2所述细胞沉淀。重悬在1ml的0.1M乙酸锂（pH值6.0，用乙酸调节）的细胞中，并孵育在室温坦佩10分钟叉涂抹。
      3. 分装感受态细胞（100微升）进入无菌1.5毫升管。进行到转化步骤下面马上或在-80℃下长期贮存添加甘油至25％的终浓度（体积/体积），并存储。
    2. 转型
      1. 轻轻10微升变性的鲑精子DNA（10毫克/毫升）和1-5微克纯化的破坏盒的与100微升的感受态细胞混合在一起，并在30℃下孵育15分钟。
      2. 加入700微升40％聚乙二醇（PEG）-4000（溶于0.1M醋酸锂pH值为6.0）中，拌匀，并在225转速在30℃摇床孵育60分钟。
        注意:使用的PEG 4000平均分子量，代替PEG-3350（典型地在常规的酵母的转化中使用）是重要的。
      3. 热火通过将管在39℃水浴60分钟震荡转化混合物。
      4. 加入1 ml YPD中，恢复为在30℃下2小时，225转。离心机以9000rpm的XG在室温下1分钟，除去上清液和重悬沉淀在1ml TE缓冲液中。
      5. Repellet通过离心将细胞以9000rpm的XG的在室温下1分钟，并弃去上清液。重悬在100μlTE缓冲液中的沉淀和板到选择平板（ 例如 ，亮氨酸缺陷型板），并在30°C孵育2-3天。
      6. 选择4至10个单菌落，并分别接种入2ml YPD培养基。在225rpm下在30℃振荡培养箱中孵育过夜。从转化22识别由基因组DNA的PCR分析阳性菌落按使用两组引物＃55 /＃56和＃56 /＃57 表5中 ，分别。
        注意: 未 I线性pYLEX1载体转化到Y.解脂 Po1g感受态细胞，以便通过计数的数目来确定转化效率每微克质粒的菌落形成单位（cfu）的DNA用于23。

2.标记救援

  1. 华创表达载体的构建
    1. pYLEX1-CRE和pYLEX1-HPH建设
      1. 设计的引物20进行PCR扩增CRE和HPH的开放阅读框。添加额外的腺嘌呤核苷酸的起始密码子上游的正向引物＃82和＃84，和插入在反向引物＃83和＃85的终止密码子的下游的PCR扩增CRE的开放读框的KpnI限制性位点和从pSH69（登录号HQ412578）24 HPH按表2。
      2. 净化既CRE和使用根据制造商的说明一个PCR纯化试剂盒HPH片段。既消化酶我按照TABL与KPN纯化的综合招聘考试及HPH片段E 4。双酶切与PML和KpnI酶按表4中的pYLEX1质粒。用PCR纯化试剂盒按照制造商的说明纯化消化混合物。
      3. 使用T4 DNA连接酶按表3结扎纯化和消化CRE和HPH片段至Y的PML的I / 的KpnI位点解脂表达载体，产生pYLEX1-CRE和pYLEX1-HPH分别。
    2. pSL16-CRE-HPH建设
      1. 使用引物＃86放大来自pYLEX1-CRE CRE的启动子-基因-终止子盒/＃87侧翼萨尔的I /PstⅠ限制位点按表2中 。根据制造商的说明纯化使用PCR纯化试剂盒将PCR产物。
        1. 双重消化两个纯化的PCR产物和pSL16-CEN1-1（227）的质粒25用Sal I和的PstⅠ酶按表4。纯化使用PCR纯化试剂盒按照制造商的说明将消化混合物。然后，在相应的位点结扎纯化和消化的PCR产品放入pSL16-CEN1-1（227），使用T4 DNA连接酶按表3来创建pSL16-CRE。
      2. PCR使用引物扩增来自pYLEX1-HPH HPH的启动子-基因-终止子盒＃88 /＃89侧翼Xho I 位 /BglⅡ位限制性位点按表2中 。使用PCR纯化试剂盒根据制造商的说明纯化PCR产物。
        1. 双重消化两个纯化的PCR产物和用Xho I和BglⅡ酶切酶按表4 pSL16-CRE质粒。用PCR纯化试剂盒按照制造商的说明纯化消化混合物。然后，结扎纯化和消化的PCR产品放入pSL16-CRE在相应​​的网站使用T4DNA连接酶按表3，以产生pSL16-CRE-HPH。
          注意:将所得的Cre表达的质粒，pSL16-CRE-HPH，怀有可选择潮霉素B的标记，是着丝粒和附加型复制载体（ 图2）。
      3. 验证所有通过消化适当的限制性内切酶（ 例如 ， 萨尔我/ PST我，切除从载体插入）按表4的结构。
  2. Cre重组酶介导的标记救援
    1. 变换pSL16-CRE-HPH进入淘汰赛KU70菌株的感受态细胞按照上述第1.2节所述的改造方案。板转化细胞到YPD加潮霉素B（YPDH）板（含有400微克/毫升潮霉素B），并孵育在30℃下2-3天。
    2. 进行菌落PCR按表5中使用引物＃84/85＃识别正面含改造后pSL16-CRE-HPH质粒的菌落。
      注意:正向引物＃84和反向引物＃85位于潮霉素基因（ 表1）的编码区内部。只阳性克隆产生在PCR反应的特定PCR产物。
    3. 挑选阳性克隆，接种于2ml YPDH培养基中，并在225rpm下在30℃振荡培养箱中孵育过夜饱和。测量用分光光度计细胞OD 600。收获细胞以约15的OD 600。离心机在5000 xg离心在室温下5分钟，并用2毫升无菌水中洗一次。
    4. 再接种细胞于2ml YPD培养基具有初始OD为0.1 600和允许细胞在30℃振荡培养箱中于225rpm下生长过夜。条纹过夜细胞培养到YPD平板分离单菌落23。复制品板菌落到YPD，YPDH和亮氨酸缺陷型板23 。
      注:已经失去了LEU2标记，pSL16-CRE-HPH质粒只能生长在YPD平板（ 图3）菌落。

3.乙醇脱氢酶和醇氧化酶基因的缺失

  1. 执行对Y.搜索使用基本局部比对搜索工具（BLAST）来识别要删除的26基因的候选解脂基因组数据库。输入S的蛋白质序列酵母的乙醇脱氢酶我到BLAST搜索工具（http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa）。
    注:BLAST搜索工具将返回最相似的蛋白质序列中的Y.解脂基因组数据库。
  2. 构建通过PCR缺失盒用引物＃7至＃56（ 表1），并执行酶切，并使用上文第1.1节描述的相同的方法连接反应。
  3. 预备是KU70敲除菌株的感受态细胞，进行转化和进行PCR通过以下在上述1.2节中描述的协议用 ​​引物＃55，＃58〜＃81（ 表1），以确定阳性菌落。
    注意:作为一个例子，对于YALI0E17787g基因缺失的方法在图4和5进行说明。报告的1 kb和2 kb的同源区域同源重组率的影响。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

线性Y.解脂表达载体插入到PBR对接平台在Y的基因组解脂 Po1g应变通过执行一个交叉重组27。通过使用本研究建立的快速化学转化过程中，线性Y.解脂表达载体在> 100个/微克DNA的转化效率被成功转化到野生型Po1g菌株。由1kb的同源序列侧接敲除盒转化到Po1g菌株和KU70基因被成功删除（ 图1）。这里，正向引物＃56退火到位?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

我们对这项研究的目的是来实现快速，高效的新一代靶向基因敲除在Y.解脂 Po1g应变。有好几个因素需要加以解决，以实现这一目标。首先，需要一个高转化效率。因此，高效，便捷的化学转化协议为Y.解脂 Po1g菌株在本研究中所描述。使用的PEG-4000的是该菌株的成功转化的关键因素。用PEG-3350时（为酿酒酵母的转化）代替PEG-4000质粒转化获得没有转化体。此外，需要使用?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

披露声明

The authors have nothing to disclose.

致谢

我们非常感谢来自新加坡（ETRP 1201102）的国家环境局的资金支持，新加坡国立研究基金会（NRF-CRP5-2009-03），该机构对新加坡科学技术研究的竞争研究计划（ 1324004108），全球R＆D项目计划，知识经济部，韩国（N0000677），国防威胁降低局（DTRA，HDTRA1-13-1-0037）和合成生物学新加坡国立大学倡议（ DPRT / 943/09/14）。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent/Material
Oligonucleotide primersIntegrated DNA Technologies25 nmole DNA oligos
Y. lipolytica strain Po1gYeastern Biotechleucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1Yeastern BiotechFYY203-5MGY. lipolytica expression vector
E. coli TOP10InvitrogenFor cloning and propagation of plasmids
pGEM-T vector PromegaA3600TA cloning vector
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106For plasmid isolation
Wizard SV Gel and
PCR Clean-Up System		PromegaA9282Extract DNA fragments from agarose gels
and purify PCR products from an amplification reaction
The iProof high-fidelity
DNA polymerase		Bio-Rad172-5302High-fidelity DNA polymerase
BamHI New England BiolabsR0136SRestriction enzyme
BglII New England BiolabsR0144LRestriction enzyme
KpnINew England BiolabsR0142SRestriction enzyme
NdeI New England BiolabsR0111SRestriction enzyme
NotINew England BiolabsR0189LRestriction enzyme
PmlINew England BiolabsR0532SRestriction enzyme
PstI New England BiolabsR0140SRestriction enzyme
SacIINew England BiolabsR0157SRestriction enzyme
SalINew England BiolabsR0138SRestriction enzyme
XhoINew England BiolabsR0146LRestriction enzyme
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202L
Taq DNA polymerase Bio-RadM0267L
AmpicillinGibco-Life Technologies11593-027Antibiotics
Hygromycin BPAAP21-014Antibiotics
GeneRuler 1 kb DNA ladderThermo ScientificSM03121 kb DNA ladder
PEG4000Sigma95904-F
TrisPromegaH5135
EDTABio-Rad161-0729
Salmon Sperm DNAInvitrogen15-632-011
Lithium AcetateSigma
Acetic acidSigma
Glass beads (425-600 µm)SigmaG8772
RNAse AThermo ScientificEN0531
DNA Loading DyeThermo ScientificR0611
Bacto Yeast ExtractBD212750
Bacto PeptoneBD211677
D-Glucose1st BaseBIO-1101
YNB without amino acidsSigmaY0626
DO Supplement-LeuClontech630414
GlycerolSigmaG5516
Difco LB BrothBD244620
Difco LB AgarBD244520
Bacto AgarBD214010
Equipment
PCR machineBioradT100 Thermal Cycler
Water bathMemmertWNB 14
Stationary/Shaking IncubatorYihderLM-570RD
Thermo-shakerAllshengMS-100
Micro centrifugeEppendorf5424R
CentrifugeEppendorf5810R
SpectrophotometerEppendorf BioPhotometer plus
Gel imagerGEAmersham Imager 600

参考文献

  1. Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).
  2. Coelho, M., Amaral, P., Belo, I. Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. Méndez-Vilas, A. , 930-940 (2010).
  3. Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790(2013).
  4. Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
  5. Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
  6. Domìnguez, Á, et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
  7. Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
  8. Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
  9. Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
  10. Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
  11. Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
  12. Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
  13. Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
  14. Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
  15. Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
  16. Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
  17. Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
  18. Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
  19. Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
  20. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).
  21. Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
  22. JoVE Science Education Database. Isolating Nucleic Acids from Yeast. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast (2016).
  23. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064(2012).
  24. Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
  25. Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
  26. McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
  27. Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
  28. Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

115 KU70

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。