一个简单的方法来操作的动物行为观察溶解氧

摘要

本文介绍了一个简单的和可重复的协议来操作溶氧条件在实验室环境对动物行为的研究。该协议可能在教学和研究实验室的设置可用于评估在溶解氧浓度的变化无脊椎动物，鱼类，两栖类或生物体的反应。

摘要

操纵溶解氧（DO）在实验室环境的能力有显著应用调查若干生态和生物体的行为的问题。这里所描述的协议提供了一种简单的，可重复，并且控制方法来操纵DO来研究从低氧和缺氧条件下得到的水生生物的行为反应。在执行的水脱气用氮气在实验室设置常用生态（水生）应用没有明确的方法存在于文献中，并且该协议是第一个描述的协议以degasify水来观察生物体反应。这种技术和协议是为水生无脊椎动物直接应用开发;然而，小鱼类，两栖类，和其它水生脊椎动物可以很容易被取代。它允许从2毫克/升，以11毫克/升与稳定性DO水平的容易操纵长达5分钟的动物观察期。超过5分钟的观察期水温开始上升，并在10分钟DO水平变得太不稳定维护。该协议可扩展到研究有机体，重现性好，可靠，允许快速实施到入门教学实验室和高层次的研究应用。这种技术的预期的结果应与溶解氧改变生物体的行为反应。

引言

溶解氧（DO）是在调解一些水生生态系统中的生物和生态过程的重要关键生理参数。暴露于急性和慢性亚致死缺氧减少某些水生昆虫的生长率，降低暴露¹昆虫的生存。该协议的开发提供一个可控的方法来操纵溪水DO水平，观察动物行为的影响。由于所有的有氧水生生物的生存，为了生存和繁殖依赖于氧浓度，溶解氧浓度的变化往往反映在生物行为变化。更多的移动水生无脊椎动物和鱼类已观察到寻求语言环境具有较高的DO ^2,3低氧浓度（缺氧）响应。对于流动性较差的水生生物，行为适应增加DO的摄入量可能是唯一可行的选择。 PLEC的水生底栖动物秩序的OPTera（StoneFly的）已被指出以执行"上推"运动，以增加水中的氧的流量，和吸收，在其外部鳃^{4 - 6。}这些适应性行为已在自然的环境，并在实验室实验中观察到。

在水中溶解氧的实验室操作开辟了动物行为研究显著的机会，但在方法上部署显著存在差距。例如，一项研究使用的大型水族馆评估以下用氮气脱气大嘴低音的生理响应时间（ 加州鲈 ）缺氧的环境中，但很少详细给出的方法^7。使用氮气和多孔石将气体输送到水，减少水分⁸ DO描述上斑马鱼（ 斑马鱼 ）进行的另一项研究。对于基于化学的应用程序，对于溶剂的脱气方法使用专门的设备^{9 - 11}从溶剂除去氧气，但不会是适合动物行为的研究。虽然这些研究采用的方法来从水中除去氧气，没有描述的方法可以查明将允许对动物行为评价响应于DO变化。

下面描述这种方法是试图通过使用氮气充分描述了的水的DO操作的协议。此外，这种方法对观察StoneFly的行为（如俯卧撑）之间的关系发展，去做一些在大一级别的生物实验室使用。其中一个这种方法的主要好处是，它可以很容易地与常用玻璃器皿和大多数中等和高等教育机构可获得的材料在实验室内进行。该协议也很容易适应，允许个人扩展，以满足提出的研究或教学应用目标的过程。

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研究方案

注意:这个实验没有使用脊椎动物，因此没有需要由杰尼阿塔学院研究所的动物护理和使用委员会的批准。然而，对于个人适应与脊椎动物使用这种方法，IACUC批准，应寻求。

领域样品采集

1. 确定并收集，存储能力评估潜在的野外场地，运输石蝇迅速在1小时过境最大推荐时间减少在途时间。
2. 在选定的领域站点执行球网采样下列标准球网的程序足够的时间来收集至少35石蝇^12。
3. 收集50升流的水和岩石的与流2厘米的最大直径。
4. 放置水族馆中设定为数据流部位的温度的冰箱。在分发流现场收集到的岩石和水族馆，每水族馆4升溪水填补。将20每水族馆-30收集石蝇和放置连接到水族馆鼓泡到每个罐中鼓泡石和打开鼓泡向室内空气连续地添加到水中。
5. 允许石蝇调整到在水族馆的48小时期间新的环境。

图1.为溶解氧操作。（A）1）安装铜管男性软管倒钩2）塞密封的位置，以检查确保密封性好烧瓶中。 （B）1）2 L侧臂烧瓶装满1.9升水2）气体管和分别空气鼓泡器（蓝色），于氮气鼓泡和房间空气鼓泡使用，3）氮罐和衡量值4）2升烧瓶洋溢着0.4升的水与真空管淹没5）溶解氧测定仪。 请点击这里查看该图的放大版本。

2.实验设置

1. 上的台顶，一个标准的薄壁真空管连接到2L侧臂烧瓶的侧臂如图所示（ 图1B 1）。
2. 与3升的塑料容器保持收集流水在冰箱设置为12℃的1.9升流的水的填充烧瓶中。
3. 放在一个托盘大到足以容纳周围的侧臂瓶冰浴不遮挡烧瓶内部的看法和填充用冰托盘中的烧瓶和油管。
4. 钻两个直径3mm的孔的橡胶塞，以允许1）的铜管的通道，以输送气体到容器和2）的DO计， 如图1B中的探头插入2升侧臂烧瓶（1） 。
5. 使从塞子的边缘的横向切口的孔中的一个，以使DO探头的导线的座位到塞子。
6. 连接耦合器带有3毫米公软管倒钩（ 图1A 1）一块直径为2毫米铜管。确保该管足够长以10厘米烧瓶底部的内达到通过塞子到达时间。
7. 放置管具有耦合器虽然在止动件的第二孔，直到从止动件的底部的长度是足够到10cm烧瓶底部的内达到。
8. 连接0.75米长，薄壁聚乙烯燃气管的直径为3mm到管道上的耦合器。
9. 两者DO探头和铜管滑入烧瓶中并密封与止动烧瓶。
10. 检查塞子和烧瓶，以及管和塞子中的探针导线之间的紧密配合之间的安全密封。
11. 补的1L烧瓶加入0.4升的自来水，并放置相邻的冰浴，并在真空烧瓶中的托盘。
12. 淹没聚乙烯管从大保温瓶来进1升烧瓶中的水。固定用胶带管，使得其将通过实验保持浸没。
13. 从保温瓶3毫米直径的天然气管线连接到一个水族馆室内空气鼓泡。在水族馆起泡器，它引入了室内空气和氧气送到堵水开始泡在2升烧瓶上的水。
14. 监控溶解氧浓度及水分的温度与DO仪5分钟，或直至溶解氧的平衡在腔室内建立，使得在溶解氧很少改变正在发生。

3.测试实验装置的稳定性

1. 测试每个设置为之前除了石蝇的DO稳定性。
2. 添加三个或四个石头到2升瓶，使石蝇有基材利于俯卧撑。
3. 通过从鼓泡断开气体管，并将其附加到氮气行开始的DO的试用操作。
4. 开始在立方英尺每小时（CFH）20约40氮气鼓泡秒至1分钟。
5. 一旦溶解氧已0.5毫克/升的目标浓度的内下降到时，流程降低到15 CFH和允许的浓度降低到目标。
6. 立即停止氮气流下一旦达到目标浓度。
7. 使用水族馆室内空气鼓泡至浓度返回到目标浓度如果溶解氧减小低于目标。
8. 如果做一套行动的测试过程中是不稳定的再检查水量仍处于1.9 L和没有水已经起泡了，水温稳定，不改变，并在所有接头密封显得紧，密封。
9. 一旦三个试验已经完成，并实验者在控制DO的能力有信心，附加气体线起泡和气泡再平衡。
10. 泡到平衡通过附加3mm直径的气体管线的水族馆起泡和开始加入室内空气的到水中，直到浓度氧气在水中不增​​加或更改3分钟。
11. 一旦处于平衡状态，停止冒泡和启封烧瓶。

4. StoneFly的俯卧撑实验

1. 由观察员人数除以石蝇的总数确定试验来执行的数目。
2. 确定2和10毫克/升之间不同DO水平来评价石蝇的行为反应（俯卧撑的数量）。
3. 设置每试验一锥形瓶并添加石蝇的数目相等，因为有观察员至烧瓶（该设计内4石蝇），探针和管放回烧瓶，然后重新密封的橡胶塞的烧瓶中。
   注:初始DO为10mg / L浓度被选为第一个观察点，因为它是流从其中石蝇进行取样的溶解氧浓度。
4. 一旦水是在10毫克/升通过鼓泡以下步骤2.10-2.11，记录开始水温，并允许石蝇附加到烧瓶中的岩石基体。
5. 仅指派一名观察员观看一个StoneFly的保证俯卧撑的行为，这是由StoneFly的表现上下肢体动作计数准确。
6. 算并记录在3分钟的观察期的过程中观察到的俯卧撑的数目。
7. 操纵DO到下一个试验的DO水平，并重复3分钟的观察期，附加的实验水平。
   注意:在这个实验设计，三个不同的DO水平进行了评价。

5.统计分析

1. 向在一组为给定的DO试验执行在四个石蝇俯卧撑的统计分析使用平均数。
2. 使用免费的R统计计算软件¹²在俯卧撑和使用每个实验试的顺序DO浓度的数量进行方差分析的分析（DO级）和温度COVariates。分析DO作为单个因素的离散电平。
3. 使用残差的安德森-达林正态性检验，检查正常^13。
4. 通过绘制针对DO浓度俯卧撑的平均数对数据执行线性回归。

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结果

所描述的设置六个试验是由24新生本科生教学实验室环境进行量化石蝇响应不同的溶解氧浓度的水进行俯卧撑的数量。俯卧撑的DO水平内，每个试验中进行的平均数为汇集暗算溶解氧水平俯卧撑如图2所示 。方差分析进行最初利用溶解氧浓度，试验的顺序，温度，以及所有的变量之间的相互作用。结果显示，只有做浓度显著影响由石蝇进行俯卧撑的数量（R ...

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讨论

关键步骤
这个程序提供了一个简单而有效的方式来操作DO在实验室环境对水生生物进行行为研究。我们发现有以几个关键步骤/项意识到执行该实验是直接相关的结果时的感觉。在一个试验中，它是保持室压力，以避免在水上方的气体的分压的变化的关键，和随后的DO波动。按照协议的"试实验装置的稳定"小节中所列的步骤是关键的。检查与烧瓶塞子的密封，保证真空管的完全浸没到水的1升烧?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filter flask 2 L	Pyrex	5340
Rubber Stopper size 6	Sigma-Aldrich	Z164534
Nalgene 180 Clear Plastic Tubing	Thermo Scienfitic	8001-1216
Whisper 60 air pump	Tetra
Standard flexible Air line tubing	Penn Plax	ST25
0.25 inch Copper tubing	Lowes Home Improvement	23050
Male hose barb	Grainger	5LWH1
Female Connector	Grainger	20YZ22
Heavy Duty Dissolved Oxygen Meter	Extech	407510
Nitrogen gas	Matheson TRIGAS
Radnor AF150-580 Regulator	Airgas	RAD64003036