磷脂Scramblase活动的基于荧光的测定法

摘要

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

摘要

Scramblases易位穿过膜双层磷脂双向在一个ATP无关的方式。第一scramblase被识别和生化核实被视蛋白，感光体的视紫红质的脱辅基蛋白。视紫红质是在它负责的光的感知的视网膜视杆圆盘膜局部的G蛋白偶合受体。视紫红质的scramblase活动并不取决于其配体11- 顺 -retinal， 即载脂蛋白视蛋白还积极为scramblase。虽然组成型和调节磷脂扰在细胞生理学中起重要作用，只有少数磷脂scramblases迄今已除了视蛋白鉴定。这里，我们描述视蛋白的scramblase活性的基于荧光的测定法。视蛋白被重组到磷脂酰胆碱，磷脂酰甘油和荧光NBD标记的PC（1-p的微量组成的大单层脂质体almitoyl -2- {6- [7-硝基2-1,3苯并恶-4-基）氨基]己酰基} - SN -glycero -3-磷酸胆碱）。 Scramblase活性通过测量到位于囊泡的内小叶NBD-PC分子能够访问外部小叶，他们的荧光化学由不能越过膜还原剂消除的程度来确定。我们描述的方法具有普遍的适用性，并可以用于鉴定和表征其他膜蛋白的scramblase活动。

引言

感光体视紫红质，一个典型的G蛋白偶联受体（参考文献¹中综述例如），要被识别的第一磷脂scramblase和生物化学验证^2,3。 Scramblases是磷脂转运会增加transbilayer磷脂运动的本质慢的速度在双向生理上适当水平，ATP无关的方式^4-6。他们的行动的实例可于内质网和细菌胞质膜，其中需要对膜稳态和生长构加扰，以及针对各种糖基化途径⁵中找到。扰码是需要调节磷脂以暴露凋亡细胞的表面上的磷脂酰丝氨酸（PS），其中它充当一个"吃我" -信号为巨噬细胞⁷和对活化血小板提供一种促凝表面以催化生产蛋白质因子的š所需血液凝固。在感光体光盘的膜，视紫红质的扰频活动已经提出以抵消由ATP依赖，单向脂质产生的双层的两个薄膜小叶之间的磷脂失调翻转酶ABCA4 ^{4,8,9 10-12。}

尽管scramblases的生理重要性，它们的身份仍然难以捉摸直到视紫红质被报告为在感光体圆盘一个scramblase ^2，TMEM16蛋白家族的成员被确定为钙^离子需要在质膜PS暴露依赖性scramblases（在参考审查^13），并作为脂类II scramblase所需肽合成¹⁴提出的细菌蛋白质FtsW。这些发现是基于纯化的蛋白质的脂质体中使用的方法describ重构和scramblase活性示范在所得脂蛋白体这里编。其他潜在scramblases ^15-21 -的MurJ和AMJ蛋白肽聚糖的生物合成牵连，WzxE和相关蛋白牵涉于扰O-抗原的前体，MPRF蛋白需要穿过细菌胞质膜易位氨基酰化磷脂，并且已经提出Xkr8家族成员以暴露的PS凋亡细胞的表面上 - 有待生化测试。这凸显了一个强大的分析的重要性，以确定和识别scramblase活动。

这里，我们描述了纯化的视蛋白的在使用基于荧光的测定法所得到的蛋白脂质体的重建，感光体的视紫红质的脱辅基蛋白，成大单层囊泡（的LUV）和scramblase活性随后的分析。有在文献中用于异源表达和视蛋白的纯化可用几个充分描述的协议，因此，我们将不描述它在这个协议;我们使用这产生FLAG标签，热稳定视蛋白在约100纳克在戈伦等 ³所述的协议/微升的0.1％（重量/体积）十二烷基麦芽糖（DDM）。

重构是通过使得它们溶胀但不溶于治疗与足够洗涤剂的LUV实现。在这些条件下，膜蛋白 - 蛋白质 - 去污剂胶束的形式提供 - 将整合入脂质体和成为重建成在洗涤剂除去脂质体膜，导致脂蛋白体。重构视蛋白（作为纯化蛋白得到的0.1％（重量/体积），DDM），的LUV由（1- POPC（1-棕榈酰-2-油酰- SN -glycero -3-磷酸胆碱）和POPG的混合物制备棕榈酰-2-油酰- SN -glycero -3- [磷酸外消旋- （1-甘油）]）和添加视蛋白和NBD-PC之前，用DDM饱和。洗涤剂然后通过用聚苯乙烯珠粒的样品中除去。

小姑娘="jove_content">的基于荧光的测定法的基本原理示于图1B。的LUV对称用NBD-PC或其他NBD标记的荧光磷脂记者（ 图1A）的微量重构。上加入连二亚硫酸盐，膜不通透性二价阴离子，在的LUV的外部小叶NBD-PC分子呈现非荧光作为硝基组NBD的被还原成非荧光氨基 - 基团。既不NBD-PC分子也不连二是能够在时间尺度的实验（<10分钟）的遍历膜，这导致荧光信号的减少50％。然而，如果脂质体与scramblase重构，在内小叶NBD-PC分子可以迅速加扰向外部在那里它们被降低。这导致荧光的在理想的情况下（ 图1C）的总损耗。

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图1:scramblase活性测定的示意图的测定使用荧光NBD标记的报告脂质; NBD-PC如图（A）。大单层囊泡重构与NBD-PC的痕量。重组产生对称囊泡，以在外部和内部小叶均匀分布NBD-PC。连二亚硫酸盐（S ₂ O ₄ ^2-）化学还原硝基组NBD到一个非荧光氨基-基团。用连二亚硫酸盐（B，上图）无蛋白质的脂质体处理引起，因为只有在该外部小叶的NBD-PC分子荧光的减少50％的降低:连二亚硫酸盐被带负电荷的，并且不能穿过膜与NBD-PC分子反应在内部小叶。含有视蛋白，脂蛋白（B，下），连二亚的治疗即 scramblase活性脂蛋白，导致的F 100％的损失luorescence如视蛋白促进内层和外层小叶之间的NBD-PC的移动。 （C）表示对治疗无蛋白质的脂质体和含有视蛋白-蛋白脂质体与连二亚得到理想化荧光痕迹。荧光损失率是在两种情况下，指示由连二亚化学还原NBD的是限速，并且加扰出现在比化学反应的速率等于或大于一个速率是相同的。从实际实验中获得痕迹如图3所示。 请点击此处查看该图的放大版本。

我们描述的方法可以被用来重建和测定等纯化的蛋白质，以及获得，例如，通过用洗涤剂²²提取微粒的膜蛋白的混合物。

研究方案

1.脂质体和蛋白脂质体的制备

1. 脂质体形成
   1. 用玻璃注射器，添加1435微升POPC（25毫克/毫升，在氯仿中）和160微升POPG（25毫克/毫升，在氯仿中）到一个圆底烧瓶中，以获得在POPC的摩尔比52.5微摩尔脂质:POPG = 9:1。
   2. 使用旋转蒸发器在145 rpm的转速（需要此体积的溶剂没有水浴）干燥30分钟的脂质，然后将烧瓶转移到真空干燥器为至少3小时，或过夜，在室温下（RT）。
   3. 水合干燥的脂质膜用10ml的50mM HEPES pH 7.4的，100毫摩尔NaCl的通过轻轻摇动烧瓶直至均匀，混浊悬浮液的结果（以下称为缓冲液A）;
      注:在此阶段的脂质浓度预期为5.25毫米，因为没有损失应该迄今发生。
   4. 超声处理水浴中的悬浮液10分钟，在室温下用一个频率ö˚F40千赫。该解决方案将看起来有点清晰。
   5. 使用挤出机，通过膜传递悬挂10次以400纳米的孔径，随后用4个道次挤出的第二循环通过具有200nm的孔尺寸的膜。
      注:将所得的LUV的平均直径为〜175纳米。如果需要的话，的LUV的大小和均匀性，可以通过动态光散射，根据制造商的说明检查。
   6. 量化LUV悬浮液的磷脂浓度为1.2节所述）。
      注意:由于挤压时的损失，该浓度通常是大约3.6毫米。
   7. 存储的LUV在4℃下约2周，如果不立即使用。
2. 量化磷脂
   注意:要确定用于重构的LUV悬浮液的磷脂浓度，以及该被最终生成的脂蛋白的，样品的等分试样是subje由高氯酸反恐执行氧化。此过程分解磷脂释放无机磷酸盐，然后由一比色测 ​​定中使用的标准²³比较定量。
   1. 制备在去离子蒸馏水磷酸钠的40mM的储备溶液（钠₂ HPO _4）。
   2. 稀释原液用去离子蒸馏水，得到4毫米和0.4毫米的工作的解决方案，将作为校准标准。
   3. 使用工作溶液，在13×100毫米²玻璃管从0到在50微升的最终体积80磷酸纳摩尔钠制备的标准。
   4. 采取10微升的每个LUV和脂蛋白体样本进行量化，并与在13×100毫米²玻璃管DDH ₂ O的40微升稀释。
      注:由于的LUV和蛋白脂质体的脂质浓度范围为2.5-5微米，在10微升样品的应含有25-50纳摩尔脂磷。
   5. 在145℃下在加热块添加300μl的高氯酸到每个标准品和样品并加热1小时。沽上管道弹珠防止蒸发。
   6. 让管冷却至室温，并加入1 ml的DDH ₂ O的
   7. 添加400μl的每个新鲜编写了12克/升钼酸铵和50g / L的抗坏血酸钠和涡流的混合。
   8. 热，在100℃10分钟以上的管的顶部大理石。从加热块中取出管，并让他们冷却到室温。
   9. 衡量用分光计空白（含有0纳摩尔磷酸钠标准样品）的样品的吸光度的797纳米的波长。
   10. 确定样品对校准标准曲线的磷酸盐含量。
3. 视蛋白的重建
   注:有必要确定用于重建最佳膨胀的条件，因为这些依赖于洗涤剂的性质，以及作为的LUV的脂质组成和浓度。如的LUV更改溶胀过程中的光散射性质可以通过测量由里戈和利维²⁴和​​Geertsma 等人 ²⁵审查吸光度（ 图2）来监测。
   1. 吸移管800微升的LUV（来自1.1部分;挤压后的脂质回收率为70％，的LUV的预期浓度是3.6毫磷脂）到2ml微量离心管中。
   2. 添加缓冲液A 5.3微升和34.7微升的10％（重量/体积）DDM溶解在缓冲液A
   3. 孵育在室温下与最终过端搅拌3小时。
   4. 同时准备聚苯乙烯珠粒:
      1. 使用400毫克的小珠每个样品并称量出来在玻璃烧杯中。
      2. 用甲醇与水用缓冲液A洗两次，三次和一次对于每个洗涤步骤使用溶于5ml液体并缓慢搅拌10分钟。
         注:建议准备聚苯乙烯对几个样品一次， 例如珠，称量6克小珠，并用75毫升的液体洗净。过量的珠子可以储存在冰箱中数天。
   5. 期间囊泡不稳定的最后30分钟，干燥在螺丝帽玻璃管NBD标记的磷脂（"重建玻璃管'）:每样品，9.5微升NBD-PC（1毫克/毫升的氯仿，得到0.4％（摩尔）总磷脂的）都是在氮气流中的玻璃管干燥，并随后溶解于0.1​​％的45微升（重量/体积）在缓冲液A DDM
   6. 后囊泡不稳定的3小时添加溶解-NBD标记的磷脂，所述的DDM溶解的蛋白质和缓冲液A，使得1毫升的最终体积中含有0.36％（重量/体积）， 即 ，7毫米，DDM。
      1. 因此，为了产生无蛋白质的脂质体（用作对照样品）添加45微升NBD-PC（溶解在0.1％DDM）的，60微升0.1％DDM和55微升缓冲液A;对于脂蛋白增加，对于考试PLE蛋白质的40微升（从〜110毫微克/微升的典型原液）0.1％DDM，45微升NBD-PC的（溶于0.1％DDM），0.1％DDM 20微升和55微升缓冲液A 。
         注:加入顺序应列出。
   7. 混合样品在室温下额外小时结束以上结束。
   8. 加80毫克的制备聚苯乙烯珠粒孵育与在RT 1小时结束过端混合的样品。
   9. 接下来，添加一个额外的160毫克的聚苯乙烯珠，并在室温再2小时结束了高端混合培养。
   10. 样品（离开废聚苯乙烯珠后面）转移到含有160毫克的新鲜聚苯乙烯珠的玻璃螺丝帽管中并在4℃混合过夜。
       注:以传输样品和避免吸干珠的最简单的方法是使用被压入到玻璃管的底部用少许正压巴斯德吸管。一旦吸管尖是牢固的管的底部，则该样品可容易地在不脱离珠粒干扰撤回。
   11. 第二天早上，将样品转移到离心管不结转珠置于冰上，准备scramblase活性测定。

2. Scramblase活性测定

注意:用缓冲液A稀释的脂质体或脂蛋白体的荧光强度随时间后在荧光光谱仪在加入连二的监测。为了获得稳定的起始强度，荧光是加入连二亚到一个不断搅拌样品前记录，至少为50秒（或直到一个稳定的信号时实现），然后接着进行至少500秒加入连二亚之后。

1. 添加1,950微升缓冲液A含迷你搅拌棒的塑料杯中。
2. 加入50μl准备PROTEO的（脂质体），并让在荧光分光样品平衡计在恒定搅拌下几秒钟。
3. 与此同时，在0.5M的缓冲三（ 例如，对于两个样品称出20毫克的连二亚硫酸盐在离心管中，并在114溶解准备1M的连二亚硫酸钠溶液微升冰冷的0.5M的Tris直接使用前保持在冰上下一个样品）。
   注:连二亚溶液必须是新制备的，并在制备后不应该使用多于20分钟如果许多测量是制成，连二亚硫酸盐的等分试样可以预先称出并在使用前右溶解。
4. 启动荧光检测（激发波长470，发射530纳米，狭缝宽度0.5纳米）。
5. 添加40微升的1M二亚溶液到试管50秒开始的荧光记录（使用隔膜中的反应杯腔室如果可能的盖子）后，继续记录荧光再400-600秒。
6. 如在第3节中所述分析数据。

3。数据分析

1. 扰动力学
   1. 通过定义初始荧光表征由scramblase活性测定得到的各样品的荧光微量， _的 F _i，之前加入连二亚硫酸盐，以及终点荧光，F到达后> 400秒。 _的 F _i是对每个样品荧光的用于加入连二亚硫酸盐之前的30秒期间的平均值来确定。
   2. 确定对应于荧光减少的程度，R = 100的结束点数据•F / _岛我们使用术语R _L为无蛋白质的脂质体和R _P代表含视蛋白-蛋白脂质体。
2. 确定功能复溶Scramblase的分子量
   1. 根据下列等式转换荧光减少数据:
      _{ρ（≥1scramblase）=（;} R _P - R _{L）/（R 最大} - R _L）（等式1）
      注意:当R _max为当足够的蛋白质复原，使得样品中的所有囊泡具有至少一个官能scramblase使得获得最大限度的降低，而p是一个重构样品中特定囊泡'scramblase活性"的概率， 即 ，它具有至少一个官能scramblase。对于R _L中的值通常为^45％3而读取_最大典型地^82.5％3，而不是预期的100％（R _最大可用于与> 1毫克/毫摩尔的PPR视蛋白脂蛋白体通过实验确定）。作为R _最大 <100％，假设囊泡的亚群是难治重建。对于R _最大值 = 82.5％，这是无法接受蛋白质囊泡的分数为0.35。
   2. 描述如下泊松统计P（≥1scramblase）和PPR（毫克蛋白/毫摩尔磷脂）之间的关系:
      P（≥1scramblase）= 1 - 电子 -m = 1 - EXP（-PPR /α）（式2）
      注:其中M =毫克蛋白质/毫摩尔磷脂个单位囊泡和α=单指数拟合常数scramblases的数量。
   3. 由于囊泡的分数并不即使在高PPR扰码（见讨论）贡献，修改公式:
      ρ（≥1scramblase）= 1 - EXP（-PPR * /α）（公式3）
      注:在哪里PPR * = PPR /（1 F），其中f是囊泡的耐火人口或，在这种情况下，PPR * = PPR / 0.65（等式4）。
      注:拟合常数α通过用单指数函数拟合P（≥1scramblase）与PPR *的曲线图确定的。如果视蛋白（分子量41.7 kDa）的功能重新构造成纳米直径175囊泡（各泡囊有28万磷脂^26），为单体，α= 0.187毫克毫摩尔^-1。如果视蛋白二聚化前复溶³产生scramblase活跃的囊泡，则α= 0.37毫克毫摩尔^-1。如果PPR而非PPR *分别被用于分析，那么相应的α值将是0.122和0.244毫克毫摩尔^-1。对于α这些预测值假设所有的视蛋白分子在功能上主管。如果仅分子的一小部分是主管加扰脂质，则α的对应值将更大。

结果

我们描述视蛋白的重建成的LUV使用基于荧光的测定法来表征其scramblase活性。我们分析结果，以放置在视蛋白介导的磷脂加扰的速率的下限，并确定在哪个视蛋白功能上重新构造成囊泡的寡聚状态。

以确定最佳的重组的条件下，有必要确定凭经验必须使用溶胀的LUV使它们接受蛋白质插入洗涤剂的量。这样的实验是在图2A

讨论

该scramblase活性测定，使我们原来确定的视蛋白具有磷脂scramblase活动^2。该测定法还允许我们通过测试特异性表征视蛋白的scramblase活性（我们采用了各种NBD标记的报告脂质如NBD-磷脂酰乙醇胺，如图所示为NBD-PC在图1A中，或在上的酰基链与NBD标记的首基，NBD-鞘磷脂或NBD-磷脂^2），囊泡脂质组合物（的效应， 例如 ，在不同量的作为囊泡组分胆固醇），和是否视蛋白?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850457C	POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids	840457C	POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	810130C	NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid	VWR Scientific	EM-5330	HEPES
NaCl	Sigma	S7653-1KG	NaCl
Dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310 5 GM	DDM
Fluorimeter cuvettes	sigma	C0918-100EA	cuvettes
Spectrofluorometer	Photon Technology International, Inc.	fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85%	Sigma	157953-5G	dithionite
GraphPad Prism 5 software			Prism
Tris Base	VWR	JTX171-3	Tris
LIPEX 10 ml extruder	Northern Lipids, Inc.		Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm	Sigma	28156-243	Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110607	400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110606	200 nm membrane
sodium phosphate	Sigma	S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm	VWR Scientific	47729-572	glass tubes
Perchloric acid	Sigma	30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Sigma	A-7302	ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate	Sigma	A7631-25G	sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents	Bio Rad	1523920	polystyrene beads
2.0 ml Microtubes clear	VWR Scientific	10011-742	Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube	VWR Scientific	53283-800	Reconstitution glass tubes
Zetasizer	Malvern		DLS