静脉介入型号:研究旁路移植通畅一个合适的模型

摘要

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

摘要

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

引言

冠状动脉疾病及其并发症是世界范围内死亡的主要原因之一。当前的治疗策略集中在重新建立血流，或者通过扩张变窄容器或通过创建旁路。使用自体静脉冠状动脉旁路移植术（CABG）于1968年首次描述，并不断得到完善，多年来。除了左前的血运重建降支动脉，隐静脉导管是最常用的^1。然而，移植通畅仍然隐静脉移植（SVG）的致命弱点。手术一年后，通畅率85％，下降幅度为61％，十年后^2,3。因此揭幕SVG通畅损失的病理生理机制和原因的一项重要任务。

本视频演示了大鼠静脉插入模型，探讨静脉移植物损失。这种方法的总体目标是发掘潜在的病理生物学并在疾病进展和-physiological流程，制定药物或治疗方法测试一个合适的模型。通过移植的腹壁浅静脉进入动脉系统，这种模式密切模仿冠状动脉旁路移植术的临床设置。手术创伤，局部缺血，和壁应力是病理血管变化重要触发器和在所述的模型模仿。

不同型号和种类都可以探讨静脉移植通畅的损失。大动物模型，如猪^4，羊^5，狗⁶和猴^7，类似于人类血管和解剖结构，从而使复杂的治疗策略，如旁路支架或新的外科技术，待测试^8。然而，需要特殊的房屋，设备，人员和工作人员。此外，高的成本和手术过程中需要额外的麻醉师阻碍其更广泛的应用。钐所有的动物，包括老鼠，很容易处理，不需要特殊的住房，并有管理的成本。相比于小鼠模型^9,10，大鼠模型具有较好的可操作性的成果优势，从而减少可变性。老鼠是生理和基因更类似于人类比老鼠^11,12。此外，大多数的野生型小鼠仅开发有限myointima ^13，其使小鼠模型容易发生II型误差。主小鼠静脉，如下腔静脉的组织学，只由几个细胞层的并呈现早期评估困难^13。另一个缺点是可用于接枝恢复之后的后续分析的组织的量小。

在此视频描述的模型是可重复的，价格低廉，且容易执行，并且它可以快速而可靠地建立。它特别适合用于评估昂贵的实验治疗剂，如病毒载体用于基因疗法，以经济的方式。

研究方案

动物遵照指南实验动物的原则，通过实验动物资源研究所编制和美国国立卫生研究院公布收到的人文关怀。所有动物方案是由主管地方当局（"献给金额UND GESUNDHEIT Verbraucherschutz，Hansestadt（办公室健康与消费者保护）汉堡"）的批准。

1.动物护理

1. 获取Lewis大鼠（LEW / CRL）大鼠和ROSA /荧光素酶LEW转基因大鼠实验动物研究所体重300-350克
2. 保持常规条件下的老鼠在通风柜和养活他们的标准大鼠饲料和蒸压水随意。
3. 执行使用ROSA /荧光素酶LEW转基因大鼠作为捐助者和同系LEW / CRL大鼠作为收件人移植术。

2.捐助者大鼠的制备

1. 使用吸纳离子腔麻醉异氟烷（2.5-3％）的老鼠。
2. 放置在它的后面的大鼠和保持与覆盖嘴和鼻子的面罩的麻醉。按捏后脚和验证的情况下反射的检查麻醉足够的深度。涂一些药膏兽医的眼睛，以防止干燥，而在麻醉下。
3. 传播后腿和用胶布固定自己的位置。
4. 剃腹股沟头发与头发剪，并使用聚维酮碘，随后通过80％乙醇消毒的整个区域。重复消毒一步的两倍。
   注:手术区，纱布，及手术器械应灭菌。维持无菌区整个过程和穿一次性使用的，无菌手术手套，口罩，和帽。
5. 在显微镜下，进行沿LINEA inguinalis垂直切口。用两个镊子皮下组织轻轻分开，并从其ORI暴露腹壁浅静脉杜松子酒的股静脉。小心地从周围组织中分离出腹壁浅静脉。
6. 停止使用两个微夹子固定腹壁浅静脉血流。
7. 通过仔细地抬起与镊子分离静脉，并通过容器与microscissors切割收获静脉的大致0.5到1厘米的段。留在容器残端微夹具防止血液流失。放置在无菌纱布取下的一块静脉。小心地将一地下30针收获静脉的一端内侧和冲洗用肝素容器（50单位/ ml）。
   注意:小心使用静脉，避免吊装，切割，和冲洗过程中的损坏。确保肝素适量的冲洗移植。
8. 保持在冰上在1％利多卡因的血管区段，直到移植到受体鼠，以防止一个容器痉挛。
9. 通过增加麻醉5％异氟醚安乐死供体鼠。后2-3分钟，运恩沿着白线腹部，划破膜片，并取出心脏停止流通。

3.收件人鼠的制备

1. 麻醉并固定收件人大鼠以相同的方式作为供体鼠。
2. 剃腿的内侧与毛发修剪器，并使用聚维酮碘和80％乙醇消毒三次。
3. 监测麻醉深度，并确保它是按捏后脚时验证的情况下的反射的足够了。
4. 从膝盖到腹股沟褶执行中值股骨切口。在显微镜下，用2镊子股动脉从周围环境中分离出来。
5. 使用微夹钳阻止血液的流动。放置近侧夹紧第一，其次远侧夹子。
6. 剪出夹紧股动脉microscissors短段和丢弃。缩短剩下的树桩动脉与microscissors，创造一个差距是1-2毫米比静脉移植大。利用地下30针冲洗动脉残端与肝素。
   注:如果外膜伸出略微超出血管断端，使用镊子小幅拉过来的船只将其取出一块。
7. 从步骤2.8动脉树桩之间放置收集静脉和调整长度，使其合适地配合到间隙。注静脉的方向。
8. 首先用一个10-0普理灵缝合执行近端吻合。在所示（ 图1D）的顺序进行单针。开始与腹侧增加三个缝合线之前的每个侧面缝合。之后，放置在容器的背侧三针来完成吻合术。
9. 与使用相同的技术，作为在步骤3.8中描述的近端吻合接枝连接远侧血管。再次，开始在每个横向侧的缝合线，然后将三道缝线上的腹侧的side和背侧。
10. 负载两个1毫升注射器用纤维蛋白胶成分1和2小心提起用镊子接枝拖放大约100μl的纤维蛋白胶部件1的接枝下，接着部件2。
    注:确保组件1和2在1应用:1的比例。
11. 放置接枝背部在其位置，并在移植物的顶部下降一个额外的100μl的组分1和2的。可以肯定的胶水涵盖接枝并且为了防止吻合不全和静脉移植物的过度膨胀的吻合术。
12. 小心地打开远端夹紧，随后近端。
13. 确认通过检查在移植静脉和移植物的远端动脉可见光脉冲一个成功的手术。
14. 除去过多的胶水，阻碍皮肤缝合。使用镊子解除固化胶水和microscissors去除多余的。关闭皮肤层用5-0普理灵缝线。
15. 注射4-5米克/公斤卡洛芬皮下注射使鼠醒来了。不要离开无人看管的动物，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧。保持动物在一个单一的笼子里，直到它完全恢复。
16. 添加安乃近到饮用水（每100毫升50毫克安乃近）作为止痛药为以下3天，每日监测动物。

4.多普勒超声

注:使用超声duxplex可视化血流非侵入性大鼠^14。

1. 麻醉中的感应腔（异氟烷2％）大鼠。将在它的后面大鼠和与覆盖鼻面罩维持麻醉。
2. 使用电推剪及脱毛霜去除周围的大腿区域的头发。
3. 应用超声波凝胶大腿。确保有没有气泡。使用MS 400传感器获取多普勒超声图像（中心频率:30男赫兹）与230-400帧/秒的帧速率。

5.组织病理学

注:嘉实和染色与马松染色的容器形态分析^15。

1. 过夜固定在4％低聚甲醛的收获容器和在增加的乙醇浓度脱水它。嵌入石蜡的样品，并将其切成用切片机5微米厚的切片。
   注:多聚甲醛是有毒的，应特别小心。
2. 用三色染色液染色之前Deparaffinize的幻灯片。脱水染色切片，用二甲苯清除它们，在安装中安装它们。干燥载玻片后，用显微镜观看样本。

6.生物发光成像（BLI）

注:移植术后通过测定生物发光信号¹跟踪随着时间的推移在体内6。

1. 溶解1g D-荧光素钾盐在22ml的PBS中，并将其注入腹膜内到大鼠（375毫克/千克体重）。等待15分钟的荧光素在动物中循环。
2. 将老鼠变成一个实时定量生物发光系统并访问生物发光信号。

结果

大鼠静脉插入模型适用于研究myointima增生静脉移植失败的发展。动物从手术中恢复良好，显示出出色的身体条件后的操作。 图1示出了关键的手术步骤。沿着LINEA inguinalis切开皮肤后，上腹部浅静脉和股动脉被确定（ 图1A）。应仔细进行接枝的收获，而不会损坏接枝（ 图1B），因为这可能导致早期移植物衰竭和通畅损失。在受体动物（ 图1C）定位?...

讨论

本视频演示了大鼠静脉插入模型，探讨静脉移植的损失，并允许潜在的病理过程的探索和新的药物和治疗方案的测试。

麻醉的手术过程中的一个关键方面。建议连续吸入性麻醉系统，因为这是一种安全，简便的方法，尤其是在长时间的操作。这可以在训练阶段期间，当操作的时间超过1小时，是非常重要的。

相对于手术过程，重要的是不向收获及植入^...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat LEW/Crl	Charles River	Stock number 004
Rat LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor- 1 luc)11Jmsk	Institute of laboratory animals, Kyoto University, Japan	NBPR rat number 0299	http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/
PFA 4%	Electron Microscopy Sciences	#157135S	20%
hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
Forene	AbbVie	PZN 10182054 Art.Nr.: B506	Isoflurane
microsurgical clamp	Fine Science Tools	18055-04	Micro-Serrefine - 4 mm
clamp applicator	Fine Science Tools	18056-14
hair removal creme	Rufin cosmetic	27618
Povidone-Iodine	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
10-0 Ethilon suture	Ethicon	2814G
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
Rimadyl	Pfizer	400684.00.00	Carprofen
Novaminsulfon	Ratiopharm	PZN 03530402	Metamizole
Heparin	Rotexmedica	PZN: 3862340	25.000 I.E./ ml
Xylocain 1%	AstraZeneca	PZN: 1137907	Lidocain
EVICEL	J&J Med.Ethicon Biosur	PZN 7349697 Art. Nr.:EVK01DE	fibrin glue
NaCl 0.9%	B.Braun	PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160
Vevo 770 high-resolution in vivo micro-imaging system	VisualSonics		duplex sonography
Ecogel 100 ultrasound gel	Eco-med	30GB
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Biosynth	L-8220
PBS pH 7.4	Gibco	10010023
Xenogen Ivis 200	Perkin Elmer		bioluminescence imaging
Weigerts iron hematoxylin Kit	Merck	1.15973.0002	Trichrome staining
Resorcine-Fuchsine Weigert	Waldeck	2.00E-30	Trichrome staining
Acid Fuchsin	Sigma-Aldrich	F8129-25G	Trichrome staining
Ponceau S solution	Serva Electrophoresis	33427	Trichrome staining
Azophloxin	Waldeck	1B-103	Trichrome staining
Molybdatophosphoric acid hydrate	Merck	1.00532.0100	Trichrome staining
Orange G	Waldeck	1B-221	Trichrome staining
Light Green SF	Waldeck	1B-211	Trichrome staining
Vitro-Clud	Langenbrinck	04-0001
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	537020
37% HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Xylene	Th. Geyer	3410
Paraffin	Leica biosystems	REF 39602004
Ethanol absolute	Th. Geyer	2246
Ethanol 96%	Th. Geyer	2295
Ethanol 70%	Th. Geyer	2270
Slide Rack	Ted Pella	21057
Staining dish	Ted Pella	21075
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer	1578675	Eye ointment