大鼠慢性心肌梗塞的组织学定量分析

摘要

The post-mortem assessment of myocardial infarction (MI) in rodents is based on quantification of the infarct on stained heart sections. We describe an accurate method to quantify the infarct size using systematic sampling of harvested rat hearts from base to apex and image analyses of trichrome-stained histological sections.

摘要

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ischemic injury. Following the initial acute phase, chronic remodeling of the left ventricle (LV) modifies the structure and function of the heart. Permanent coronary ligation in small animals has been widely used as a reference model for a chronic model of MI. Thinning of the infarcted wall progressively develops to transmural fibrosis. Histological assessment of infarct size is commonly performed; nevertheless, a standardization of the methods for quantification is missing. Indeed, important methodological aspects, such as the number of sections analyzed and the sampling and quantification methods, are usually not described and therefore preclude comparison across investigations. Too often, quantification is performed on a single section obtained at the level of the papillary muscles. Because novel strategies aimed at reducing infarct expansion and remodeling are under investigation, there is an important need for the standardization of accurate heart sampling protocols. We describe an accurate method to quantify the infarct size using a systematic sampling of harvested rat heart and image analyses of trichromatic stained histological sections obtained from base to apex. We also provide evidence that calculating the expansion index (EI) allowed for infarct size assessment, taking into account changes of the left ventricle throughout the remodeling.

引言

心肌梗死（MI）是全球死亡和残疾的主要原因。冠状动脉心脏疾病是主要原因; MI缺血连续冠脉事件，如阻塞造成的。当未在第一6小时内进行再灌注，局部缺血诱导的不可逆的心肌坏死。在患者中，心肌梗死的表征依赖于不同的诊断工具，包括临床体征，心电图，生物标志物，超声心动图，MRI影像的血浆水平的评估，以及组织学分析^1。急性和慢性心肌梗塞是根据相对于冠状动脉闭塞时的心肌坏死的定时列为损伤的两个不同阶段。急性期，在第7天发生，与心肌细胞的损失，广泛炎症，和成纤维细胞的招募相关联。亚急性期，其特征在于所述心脏组织和瘢痕形成的愈合，发生1和4之间 - 6周。梗死，心室壁变薄，心室扩张的扩张表征慢性期。左心室重构粗放逐步导致严重的心脏衰竭^2。

MI永久左前降支（LAD）结扎引起慢性代表心肌梗死的标准啮齿动物模型。冠状动脉结扎模仿冠状动脉闭塞。梗塞的大小取决于该结扎的部位上。是用经典的生物标志物血浆水平，如肌钙蛋白执行在啮齿动物模型心肌缺血损伤的表征我和T ^3，超声心动图，MRI和组织学^4,5。生物标记水平与心肌死亡的程度相关。超声心动图检查评估从区域室壁运动异常导致左心功能受损。此外，非侵入性的成像技术，如MRI或高分辨率超声心动图，允许在壁运动的减少的评估，以减少灌注和存活心肌，和壁变薄的瘢痕区域的体积。 LV尺寸允许梗死面积的准确的评价。最后，可行和死心肌的量化可以用收获内心的组织切片的特殊污渍的进行尸检，并允许梗死面积（IS）的验证。另一个重要的特征是梗塞膨胀指数^（EI）6的评价。在EI与内的第3天透梗死并启动有关。在EI的特征在于在壁厚的逐步减少，增加了在LV空腔尺寸，并在左心室的形状随之变化。

为了评估的新的治疗方法的治疗效果 - 尤其是，根据细胞，基质再生策略，以及在啮齿动物中的MI的基因递送精确的评估是极其重要的。当在乳头肌水平而获得的单个横截面测得，在IS大小可能由于存在于梗塞的发展以下LAD结扎的大变异被偏置;心尖梗塞可能会再遮掩。重要的是，更准确的方法来确定的梗死面积已为^7-9小鼠或大鼠¹⁰所示。然而，IS不足以准确量化左室重构或重塑的治疗引起的减少（或预防措施）。事实上，IS通常表示为评估对心脏的横截面总左心室体积的百分比。虽然这种方法是有效的急性心肌梗死，重塑过程中发生的左心室壁的变薄仍在评估^11,12。梗塞大小和结构变化的完整形态量化应量化的几个参数，如心内膜和心外膜的长度和直径，以及梗塞和健康领域。我们描述一个方法论APPRoach准确评估MI和重构的一种慢性大鼠模型。

研究方案

所有的动物在符合欧洲公约动物保健收到人文关怀。获得国家兽医局，弗里堡，瑞士联邦兽医办公室，瑞士批准同意后按照瑞士动物保护法进行外科手术。

1.心收获

注:所有手术干预措施，异氟烷麻醉下进行的。作出了努力，以减少动物的痛苦。特别是，所有动物接受0.1毫克/千克丁丙诺啡预麻醉的皮下注射。外科协议诱导心肌梗塞先前已在别处^13中所述。

1. 麻醉（插管动物，2.5％异氟烷麻醉适当通过爪子捏反射确认）下一个的心肌梗死的动物进行胸骨。
   1. 通过切割皮肤，然后肌肉打开动物用手术剪。削减左，右肋骨，然后取出胸部。
   2. 删除以前的手术（LAD结扎）后剩余的粘连。切开主动脉并取出心脏。把在1M氯化钾（在PBS中）的组织，然后用PBS清洗。

2.组织准备

1. 把梗死心脏在纵向的丙烯酸大鼠心脏矩阵。保持在-20℃1小时。
2. 直接使用具有横向刀片矩阵切心脏。确保每片厚2毫米。切割约5 - 为每个心脏（基于重构级）7滑动;这就是所谓的系统抽样。
3. 在此步骤中，执行2,3,5-氯化三苯基四唑（TTC）染色是可选的（保持心脏切片基站至顶点的方向）。
   1. 在37℃孵育，在PBS中的1％TTC 50分钟。孵育它在4％低聚甲醛（PFA）进行20分钟至1小时。把部分betweeÑ与2-毫米间隔物的两块玻璃板和拍照与15X放大率耦合有相机的体视显微镜。
      警告！多聚甲醛是有毒的。
4. 幻灯冻结（ ^第一选择）
   1. 把每个幻灯片在塑料模具（10×10×5毫米）的带安装为cryotomy介质（最佳切割温度，OCT）保持取向（放置部的面向顶点侧倒在模具的底部）。冷冻液态氮冷却10下与2-甲基丁烷蒸气块 - 15分钟。最后，保存在-80℃的组织。
5. 石蜡化（ ^第二选项）
   1. 放置在包埋盒的每个滑板（通过将部分向下在盒的底部的面向顶点侧保持的取向），然后在4％PFA 24小时。把它放在纸巾处理器的机器过夜。
      1. 孵育它在乙醇中的70％2小时。孵育它伊桑醇95％2小时。孵育它在乙醇100％，持续3小时。孵育它在二甲苯4小时。孵育它在石蜡（熔融在60℃下在烘箱中）5小时。最后，通过嵌入在石蜡每个心脏幻灯片制作块。

3.马森Goldner三色染色

1. 使从石蜡块组织切片用手动切片（厚度:5微米），或从OCT块设置为-18℃的低温恒温器（厚度:7微米）。
2. 从染色心脏各部分一张幻灯片每只大鼠（3 -每张幻灯片4横向剖面的）用Masson-Goldner三色染色（ 见附件 ）。
   注:这一步的石蜡切片开始。
   1. 熔化在60℃下将载玻片在烘箱。根据通风橱，deparaffinize它们二甲苯两次，每次10分钟。水化它们在100％乙醇，95％乙醇，70％乙醇和蒸馏水对每个3分钟。
      注:从这一步骤的开始冰冻切片秒。
   2. 解决这些问题的解决方案，布安一夜之间。然后，冲洗他们在流动的自来水10 - 15分钟。冲洗他们在蒸馏水中。孵育他们在Mayer的苏木3分钟。
   3. 删除的幻灯片，让他们在蒸馏水中5分钟。然后，孵育它们在酸性品红-丽春5分钟。冲洗他们在1％乙酸1分钟。
   4. 其次，培养他们磷钼酸橙G 1分钟。冲洗他们在1％乙酸，1分钟，孵育它们在光绿色染料10分钟，并冲洗它们在1％乙酸1分钟。
   5. 脱水它们在70％的乙醇（30秒），95％的乙醇（30秒），和100％的乙醇（5分钟）。放在组织切片的树脂封固剂一滴，用盖玻片覆盖他们，让他们干。

4.梗死大小分析

1. 来自再加上相机立体显微镜（放大15倍），每张幻灯片获得一个图像。照片统治者具有相同的设置秒。
2. 使用图像分析软件来测量梗塞，隔膜的厚度，左心室（LV）腔区域，该梗塞区域，使用LV组织区域的中间疤痕的厚度。
   1. 设定标尺图像（ 图1A）的规模。
      1. 点击测量 ，然后选择设置转换系数 。绘制校准栏上的一条线。右键点击图片，然后点击结束校准 。注意栏值，然后单击确定 。
   2. 从染色心脏的图像（ 图1B）的LV。使用多段工具。选择LV逐点，然后右键单击 复制/粘贴的任何地方。
   3. 采用单段测量工具测量瘢痕及室间隔厚度（ 图1C ）。
   4. 自动检测的LV腔，梗塞，以及使用在RGB模式（ 图1D）的自动区域测量工具的LV面积。
      1. 点击工具。 仅激活边框和 连续 RGB模式。最后，点击所关注的区域内检测到它。如有必要，使用精密工具。
3. 计算梗塞大小作为梗塞面积与左心室面积的比率。
4. 计算膨胀指数如下:[LV腔面积/整个LV面积] / [梗塞厚度/隔膜厚度]，与整个LV区域包括了LV腔和LV组织区域。
5. 最后，如下计算每个心脏一个"平均":从幻灯片梗死扩张平均指数] * [梗死幻灯片数/总幻灯片的数量。

结果

六个星期后LAD结扎，心从Lewis大鼠收获。 2毫米组织切片获得从顶点基地。被执行的TTC染色过程可视化的梗塞面积，这出现在白色，与健康心肌，它出现在红（ 图2）。根据法援署结扎的部位，梗死面积变化。对于大型MI，从顶点观察到基地（ 图2A）透梗死。较小的梗塞呈现白色梗塞组织从顶点到心脏（ 图2B）的中间部分是可见的。对?...

讨论

该议定书中的关键步骤

纤维组织可在使用心脏收获和图像的系统抽样一种慢性心肌梗死大鼠模型准确地评估分析从基地获得到顶点三色染色组织切片。两个步骤是成功的协议实现尤为重要。首先，对于心脏收获使用氯化钾使心肌以松弛状态被维持。本步骤是从不同的心梗塞尺寸的比较重要的。第二，在布安溶液中的部分的过夜固定是至关重要的，以获得明亮的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic rat heart matrix 2mm	72-5015	Harvard Appartus
INSPIRA ADVANCED VOLUME CONTROLLED VENTILATOR	HARVARD APPARATUS	557058
CATHETER INSYTE 14G	BD	381267
O.C.T	BDHA361603E	VWR
TTC	T8877-10G	Sigma Aldrich
Mayer hematoxylin	MHS32-1L	Sigma Aldrich
Acid Fuchsin CI 42685	F8129-50G	Sigma Aldrich
Ponceau Xylidin CI 16150	P2395-25G	Sigma Aldrich
Orange G CI 16230	O3756-100G	Sigma Aldrich
Light green CI 42095	L5382-25G	Sigma Aldrich
KCl	P9333-500G	Sigma Aldrich
Xylol	10315083	HoneyWell
Ethanol absolute	10303990	HoneyWell
2-methylbutane	M32631-1L	Sigma Aldrich
Stereogical microscope	SM2800	Nikon
Formaldehyde	99340	Reactolab
Embedding cassette	K113.1	Carl Roth
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