软琼脂覆盖技术使用筛选细菌产生的抑制化合物

摘要

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

摘要

最初开发的软琼脂覆盖技术70年前已被广泛用于在微生物研究的几个区域，包括与噬菌体和细菌素，蛋白质抗菌剂的工作。这种方法是相对便宜的，以最小的资源要求。此技术包括从供体菌株斑点上清液（潜在窝藏一种有毒化合物（S））到该接种用细菌试验菌株（对有毒化合物的（S）潜在的敏感）的固化软琼脂覆盖的。我们利用这种技术来筛选丁香假单胞菌库菌株种内查杀。通过组合一个沉淀步骤和靶基因的缺失这种方法，由相同的菌株产生多种有毒化合物可以区分。使用这种技术通常回收的两个对抗剂是噬菌体和细菌素。这两种药物可以使用区别两个简单的额外的测试。在含有噬菌体上清液进行连续稀释，将导致个体斑块成为数少具有更大的稀释，而含有细菌素，将导致该变得均匀以更大的稀释更浑浊结算区上清液系列稀释。此外，当点样到用相同的菌株接种新鲜软琼脂覆盖，而当转移到新鲜的软琼脂草坪，由于细菌的稀释细菌素不会产生透明区噬菌体将产生一个透明区。

引言

最近，出现了显著的兴趣深化微生物生态学的理解（在不同环境中特别是微生物组），以及新的抗菌化合物打击抗生素耐药病原菌^1,2使用。这些利益之间的相互连接的主题是了解在自然环境中的细菌菌株之间的拮抗相互作用。另外还有一些细菌对抗竞争对手³多种方式。细菌素，蛋白质，抗菌化合物的不同群体，长期研究其在调解interbacterial拮抗作用，有两个研究最多的品种是绿脓杆菌 ^4,5和大肠杆菌 ^6，重要的人类病原体的作用。除了细菌素，诱导原噬菌体也可以作为anticompetitor剂，允许应变侵入到该已定植⁷利基。 假单胞菌小号yringae是已知产生的抗微生物剂的阵列，包括单蛋白质细菌素^8，噬菌体尾部来源的细菌素^9（称为tailocins），以及非蛋白质的次级代谢产物¹⁰的植物病原体。最近有兴趣了解这些抗菌药物如何影响这种微生物的生态环境，以及它们如何被利用来控制植物病害^11。

为研究细菌素都和噬菌体一种广泛使用的方法是软琼脂覆盖技术。这种方法最早是由特惠于1936年在列举噬菌体^12,13描述的援助。

在这里，我们描述了软琼脂覆盖方法的应用，在有针对性的遗传操作和聚乙二醇（PEG）沉淀组合，在三种不同的抗微生物剂可区别（噬菌体，高的分子量BACTeriocin，和低分子量的细菌素）由一个单一的细菌菌株产生的。这种方法的好处是，它是相对简单和便宜的，这是为什么，尽管它是断然'低技术"，它仍然被广泛利用。

研究方案

1.上清液准备进行测试的活动

1. 通过适当的量溶解在无菌的0.1M _硫酸镁缓冲液（ 如 1毫克丝裂霉素C / 2毫升缓冲液）制备丝裂霉素C的0.5毫克/毫升储液。在4℃的避光储存容器股票（丝裂霉素C对光敏感）。
2. 接种丁香假单胞菌的单菌落于3ml国王的培养基B（KB）肉汤^14。孵育过夜，在室温下振荡（200rpm）下（21-25℃）。
3. 第二天早上，淡化肉汤培养物的1/100为3毫升新鲜KB肉汤。孵育3-4小时，在室温下摇动。加丝裂霉素C（0.5微克/毫升，最终浓度）。孵育过夜培养在室温下摇动。
   注:丝裂霉素C导致双链DNA断裂，从而刺激细胞的SOS反应，导致产生两个噬菌体和细菌素。
4. 粒料1-2毫升丝裂霉素C以20,000 xg离心诱导的培养离心在台式微量离心机5分钟。
5. 除去，要么通过使上清液通过0.22μm孔径的过滤器或通过用氯仿的上清液（每1ml上清液100μl的氯仿）消毒培养上清。
   1. 如果使用氯仿，涡旋该混合物15秒，并让在室温下孵育1小时。培养后，离心以20,000 xg离心混合物5分钟。
      注:氯仿​​有效地溶解它们的膜杀死细胞。使用氯仿过过滤除菌的好处是，它是便宜和更容易按比例放大，如果在一次处理多个（> 20）的样品。可能有一种可能性，即一给定的杀伤活性丢失以下氯仿处理作为分割的结果到有机相中。
   2. 使用1毫升吸移管到新鲜，无菌的1.5或2.0毫升拆下上部，水相离心管。小心不转让任何下层氯仿层（最好是删除较少的水相，以避免结转）。
   3. 孵育在通风橱中未加帽的转移的上清液允许残余氯仿蒸发（几个小时）。商店上清在4℃。

2.聚乙二醇（PEG）沉淀高分子量的化合物杀菌法分离和浓缩

1. 到无菌上清液，分别加入NaCl和PEG 8000至1 M和10％的最终浓度。反复颠倒样品直到两者NaCl和PEG完全溶解。孵育的样品在冰浴中1小时或过夜，在4℃。
2. 离心样品以16,000 xg离心在4℃下30分钟。粒料应该形成在离心管的底部。倒出上清液并悬浮颗粒在所需的体积（如1/10或原始上清液体积的1/100通过反复移液缓冲液（10mM的Tris，10mM的_硫酸镁 ，pH7.0）中的乌梅）。
3. 由两个连续提取用等体积的氯仿除去残留的PEG。
   1. 结合氯仿与重悬沉淀，涡旋10到15秒，然后离心混合物以20,000×g离心5分钟。上层水相转移到新的微量离心管中。重复此萃取，直到水相和有机相之间没有白色接口是可见的（通常为2萃取总数）。允许残留的氯仿，以从提取的上清液在通风橱中蒸发。

3.活动覆盖测试上清液的制备

1. 接种丁香假单胞菌菌株的单个菌落用于灵敏度测试于3ml的KB，夜孵育过在室温下摇动。
2. 第二天早上，回到淡化文化1/100到新鲜KB。孵育3-4小时，在室温temperatu摇动回覆。
3. 通过高压灭菌的悬浮液0.35-0.7％（重量/体积）在超纯水中琼脂制备无菌水琼脂上。
   注:软水琼脂A股可以用微波炉融化和重复使用，新鲜的叠加并不需要为每个实验做好准备。如果水琼脂再利用，这是至关重要的，以确保它完全熔化以下微波处理。如果不是，则覆盖将具有在固化粒状纹理，这将使解释困难。如果发生这种情况，熔融数分钟在微波中比以前完成更长的琼脂。
4. 保持在使用前一个60℃的水浴中熔化软琼脂。使用无菌血清吸管，转印3毫升软琼脂的无菌培养管。返回培养管水浴在熔融状态下保持。
5. 倒覆盖，首先使熔融琼脂冷却（它应该感到温暖，但不烫手），但不允许凝固。
6. 在无菌罩，接种100微升试验菌文化融入到软琼脂，涡旋混合。用手转动培养10-15秒，然后倒到一个底部琼脂（KB琼脂）。倾斜盘，全方位地保证了软琼脂均匀覆盖底部琼脂。
   注:底部琼脂可以是任何固化（1.5％琼脂）培养基上的试验菌株蓬勃发展。对于一个标准的100毫米直径的培养皿中，用〜20毫升融化网上平台。底部琼脂（如果保持在4℃下不进行干燥），或者可以在同一天制备可以提前准备好几个星期。如果准备在同一天进行叠加，最好做3.4的步骤之前如此。
7. 覆盖板，并允许它20-30分钟固化。要小心，不要打扰板，同时巩固。
8. 一旦固化，发现2-5微升上清液到覆盖（在部分1和2，上述生成）。允许所述板到夜间在室温下孵育过。观察并在第二天早上创纪录的业绩。
   注意:可以是执行并从上清液的系列稀释斑点是有用的。这将使研究人员能够噬菌体和细菌清除活动区别开来。在这种情况下，建议执行1:5或1:10稀释液。

结果

软琼脂覆盖和PEG沉淀的组合可用于鉴定和表征由相同的菌株产生的不同的抗微生物剂。 图1示出了丁香假单胞菌 （A和B），它们由相同物种的第三应变抑制两株。两种菌株，但是，由不同的细菌素抑制。上株A结算区域呈现尖锐的边缘，而在菌株B资料交换区较大，并表现出无锋利边缘。的生产菌株中的基因操作特异性灭活任tailocin（tailocin缺陷）或低分子量细菌（细菌素缺陷型）确认该菌株A和B是对不同细菌素敏感。 图2显示了噬菌体介导的杀伤可从其他非复制性抗微生物剂通过比较稀释系列进行区分。因为这两种细菌素和噬菌体可通过丝裂霉素C处理来诱导，这两种药物的活性可密切彼此相似（特别是如果活化噬菌体是丰富）。在噬菌体介导的清除的情况下，将上清液的稀释将解析成单个噬菌斑（透明圈），而细菌介导的清除不会解析成这样的斑块。

图 1: 同一菌株产生多种抗菌药物的表型的区别。株A是一个高分子量的细菌（tailocin），但不敏感的替代的低分子量细菌素，由缺乏在tailocin缺陷菌株清算的，但不是细菌缺失菌株证明。相反，菌株B是不敏感的tailocin，但是将低分子量的细菌敏感。该tailocin是efficiently回收以下PEG沉淀，而较低分子量的细菌素都没有。 WT =野生型。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2:非复制型抗菌剂和噬菌体之间的区分。 （ 一 ）在个别斑块越来越少许多噬菌体的结果（高滴度的顶部，低滴度底部）高滴度的稀释。在统一结算较少的细菌素的结果（B）稀释，不能解决成单独的斑块。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

这里描述的软琼脂覆盖技术已被有意或噬菌体研究细菌素被广泛应用了几十年。这种方法的主要好处是，它简单，价格便宜，比较容易理解。通过结合用PEG沉淀和连续稀释的软琼脂覆盖，抗微生物剂可以被分成高与低分子量药物，并且复制与非复制性试剂（ 即噬菌体与tailocin，分别）。最后，假定的细菌或噬菌体基因座的靶向基因操作（删除和互补）的掺入可以牢固树立在给定拮抗化合物的身份。最近，我们用这种方法来描述一个新的噬菌体衍生丁香假单胞菌细菌之间的流行株^9。

在这个协议工作假单胞菌SY指示以及生长培养基和条件ringae，并可能足够了，在这些条件下，蓬勃发展的其他革兰氏阴性菌。但是，使用该方法的研究人员将要优化的定时，培养基，诱导方法，和温育温度为他们的系统。关键参数包括诱导产生培养，而在对数生长期，以及晶种具有足够的对数相培养的软琼脂覆盖，以确保均匀的细菌分布，但不能过量培养，这将掩盖潜在透明区。但是也有一些不诱导作为SOS反应的一部分许多细菌素，而是通过基于肽的群体感应系统（特别是革兰氏阳性细菌素^15），由此，一个研究人员可能想筛选几种不同的感应方法（例如感应修改诱导培养基，或允许产生菌的潜伏期延长）的营养成分。

当使用这种技术，在软琼脂覆盖必须彻底加入接种菌株之前熔化并保持在55-60℃。我们有过多次试验，其中软琼脂没有彻底融化（虽然视觉上看起来是），并导致了颗粒状的外观的叠加。从一个粒状叠加结果仍然可以大致可解释，然而，这是依赖于抑制的强度（弱抑制将更加难以观察）。最后，混杂变量考虑使用这种技术时是熔化的琼脂的温度足够的时间来冷却接种接种菌株之前，以免杀死播种菌株。为了避免这个问题，我们可以确保软琼脂是温暖的，但不热，触摸。沿着这些思路，我们也观察到，如果我们给的时间不够了播种文化适应熔融琼脂，事先浇覆盖，我们恢复普遍较差细菌摹rowth，这使得特异性抑制难以或无法解释解释。这就是为什么我们允许涡旋和浇注覆盖层之间培养更多的10-15秒。保持琼脂完全熔化状态之间的权衡（热越好），但不是致命的播种株（热是不是更好）是一个可能需要由研究人员通过试验和错误决定。

如果使用PEG沉淀步骤中，将是有益的地方包括无菌肉汤培养基相同的处理，以培养物上清液的阴性对照。这将确保杀伤活性不是样品的上清液中残余的PEG或氯仿的结果。

由于两个噬菌体和细菌素往往是高度特异性的，这种情况并不少见遇到没有明显的杀伤活性与菌株的一个给定的结合。这可以导致从各种菌株特异性重sistance机制，其中之一是，该测试仪应变要么缺少或具有需要由给定细菌或噬菌体靶向该受体的无法识别的版本。

一种替代方法，细菌的筛选方法已经由河合等人描述。 ，但是从缺点遭受并没有被广泛采用^16。具体地讲，这种技术需要在时间间隔，可以是累赘观察液样品，并且不允许对噬菌体衍生的和细菌来源的杀伤活性之间的鉴别。

该技术的主要限制是它不能很好地适合于不强劲增长（并因此将缺乏容易辨别透明区），或不稳健实验室条件下产生的海港原噬菌体或细菌素生物。这种技术的适应检测环境样品既能扩大实用程序产生的细菌素这种技术并促进更深入地了解自然的环境中细菌素的作用。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mitomycin C	Santa Cruz Biotechnology	sc-3514	Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution.
Chloroform	Sigma-Aldrich	34854	Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood.
Polyethylene Glycol (PEG)	Amresco	0159
Bacteriological grade agar	Genesee Scientific	20-274