植物冰结合蛋白通过冰再结晶抑制和隔离的评估使用冰亲和力纯化鉴定

摘要

本文概述冰结合蛋白的从冷冻耐受性植物通过冰再结晶抑制活性，并使用冰 - 亲和纯化天然IBPS的随后分离的评估鉴定。

摘要

冰 - 结合蛋白（IBPS）属于家族，其通过暴露于零下温度某些生物体合成应激诱导的蛋白质。在植物中，当胞外冰晶生长发生冷冻损伤，导致质膜和可能的细胞死亡的破裂。 IBPS吸附到冰晶通过被称为冰再结晶抑制（IRI），从而减少细胞损伤的方法限制了进一步的增长。 IBPS还证明压下平衡熔点以下的溶液，被称为热滞后（TH）活性的特性的凝固点的能力。这些防护性能都提出了小说IBPS鉴定兴趣，因为它们在工业，医疗和农业应用的潜在用途。本文描述的植物的IBPS通过1识别）IBPS的植物组织中诱导和提取，2）提取用于IRI活性的筛选，以及3）的分离和PURIFIBP的使用。在通过低温暴露诱导IBP后，使用"splat测定"测试提取物的IRI活性，其允许使用标准光学显微镜观察冰晶生长。该测定需要低蛋白质浓度并产生快速获得并容易解释的结果，为冰结合活性提供初步筛选。然后可以通过利用IBPs吸附到冰上的特性，通过称为"冰亲和纯化"的技术将IBP从污染蛋白质中分离出来。使用从植物提取物收集的细胞裂解液，可以在黄铜探针上缓慢生长冰球。这将IBP融入多晶冰的晶体结构中。不需要IBP 的先验生物化学或结构学知识，这种方法可以恢复活性蛋白质。冰纯化的蛋白质级分可用于下游应用，包括pep的鉴定通过质谱法和天然蛋白质的生化分析潮序列。

引言

冰-结合蛋白（IBPS）是已在许多生物包括植物^1，昆虫^2，鱼^3，和微生物⁴的被发现的保护蛋白质的不同的家族。这些蛋白质的关键特征是其独特的特异且高效地吸附到冰晶，修改他们的生长的能力。 IBPS具有若干记录性质，具有两个最充分表征的是热滞后（TH）和冰再结晶抑制（IRI）。 TH活性在以冷冻不耐动物产生IBPS更容易地观察到。此活性导致有机体循环或间质液的凝固点降低，以防止冻结。相反，在冷冻耐受性生物体，这将不可避免地冻结在零度以下的温度，IBPS似乎具有低TH活性。尽管低TH活性，高的IRI活动限制冰哭飞虱生长通常与这些蛋白质观察到。对于冷冻宽容有机体，这IRI活动可能有助于保护细胞免受冰的细胞外车厢的不受控制的生长。

的"床垫键"模型可以用于描述通过该IBPS防止冰晶⁵的生长机制。在这种模式下，特别IBPS吸附于在时间间隔，使得水分子可以仅与结合IBPS之间的空间中生长冰晶格掺入冰晶体的表面。这就形成了一个曲率，使额外的水分子的掺入不利的，可以由吉布斯·汤姆逊效应⁶描述的事件。锚定笼形水域假说提供了IBPS的特异性结合到冰晶体表面上的机构，从而电荷的残基的存在，特别是定位在蛋白冰结合位点上，结果在呼肠孤水分子的rganization所以它们匹配冰晶格⁷的一个或多个平面。

TH活性可通过测量熔化之间的差和在IBP的存在冻结单个冰晶的温度进行定量。而TH活性评价IBPS，通过植物IBPS（通常仅一个度的一小部分）中产生的低TH间隙的活性的广泛接受的方法通常需要较高的蛋白质浓度，专门的设备和操作员的经验。虽然非IBPS可限制冰晶生长，它是由所有IBPS因此测试对于IRI活动共享的属性被用于IBPS存在一个有效的初始屏幕上，特别是对那些具有低TH活性。用于测试该活动的方法是被称为"压片分析"，由此蛋白质样品快速冷冻，以产生的小冰晶，其在一段时间，以确定是否观察到单层冰晶生长受到限制。不同于用于筛选IBPS的存在的源组织样品的其它方法，该技术适用于在10-100纳克的范围内的低的蛋白质浓度，使用容易制造的设备，并且产生快速且容易地解释的数据。然而，强调的是，该测定提供了一个初始屏幕应遵循由TH的确定和冰晶成形IBPS是重要的。

天然蛋白质的分离是具有挑战性的，通常需要关于感兴趣的蛋白质的结构和生化特性的信息。 IBPS的冰的亲和力允许使用冰作为用于纯化目的的基板这些蛋白质的分离。由于多数分子被冰晶生长，在一个高度纯化样品中的IBP样品的存在导致冰 - 半球的生长缓慢，不含大quantit期间提前冰水边界的推污染的蛋白质和溶质的IES。该方法已被用于从昆虫^{8，9，10，11}的细菌，鱼¹²和植物^13,14识别IBPS。此外，通过这种方法实现的IBP-富集的级分也可用于下游生化分析。本文概述IBPS在植物通过IBPS的诱导和提取的识别，IRI活性的分析，以证实蛋白质的存在，并使用冰亲和纯化的蛋白质的分离。

研究方案

1.啪的装置设置

1. 填与乙二醇（50％V / V的水溶液）的温度可编程循环水浴中。
   注:绿色汽车乙二醇可以使用。
2. 为了组装外部腔室，使用绝缘塑料管的水浴附加到双壁玻璃碗。绝缘玻璃碗聚苯乙烯泡沫并用塑料皮氏培养皿盖上盖子。切割在聚苯乙烯室的底部3-4英寸的孔，使得光源可通过玻璃腔室中可以看出。
3. 安装在解剖显微镜外室，安装有摄像机端口和与10个目镜一个4X极化物镜。放置偏光膜的附加件在所述外部腔室的底部。
4. 夹持1-1.5米管（〜5cm直径）到大聚苯乙烯容器内的铁架台和地点，与位于下方管在铁架台的基座的冷却块沿。

2.天然蛋白提取物的制备用于IRI分析

1. 为了诱导IBPS在冷冻耐受草或其它冷冻耐受性的植物物种，冷驯化植物中表达为最多1周，在4℃，低光照条件下（6小时光照/ 18小时黑暗）下。这并不适用于从已经暴露在低温条件下驯化期间实地收集的样本。
2. 通过在杆的基部切割得到约0.1g叶组织，然后将在1.5mL管。立刻闪在-80℃下直至使用冷冻在液氮中并保存样品。
3. 为了裂解细胞，研磨组织样品放入使用液氮下用研钵和研杵细粉。确保液体氮不均质化工序蒸发。
4. 立即置于冰上研磨样品，并允许液氮完全蒸发。加入1毫升的天然蛋白质extracti的上含10mM的Tris-HCl，25mM的NaCl的（pH 7.5）中，与在使用前立即添加了两个无EDTA的蛋白酶抑制剂片剂缓冲器。移液器混合;不要振荡。
   注:其他添加剂可能需要被使用，如果所述裂解物含有次级代谢产物（见讨论）。
5. 轻轻摇动，在4℃过夜的样品（18-24小时）。进行在4℃下的其余步骤。
6. 通过在〜16000×g下离心样品5分钟，除去细胞碎片。保留的可溶性级分，离心额外的5分钟，如果细胞碎片仍然存在。澄清的样品可以储存在-20℃直至使用。

3.片分析预实验设置

1. 倒100毫升己烷到外部腔室设置与该偏光膜，并添加5-6干燥珠粒，以防止湿气积聚在滑动。真空润滑脂少量添加到所述板覆盖所述浴和扭曲，以确保紧密的密封，并防止己烷的蒸发。
2. 在开始实验之前冷却℃，-6℃使用可编程水浴大约2-3小时之间-4己烷浴中。请务必检查正己烷的温度之前开始实验温度计。
3. 放置冷却块在正下方的塑料管中的聚苯乙烯盒，并用干冰完全覆盖之前，开始实验40分钟。
4. 在开始测试之前，确保管处于水平位置。为了确定其中冷却块中的样本将下降，第一测试在与水的程序和指示在其中样品与标记下降（如下所述）。
5. 从冷块的顶部除去干冰，并放置在已被确定与水滴标记玻璃显微镜盖玻片。
6. 立即开始测定前，打开光源上并刮去已形成在玻璃腔室的底部的任何冰。避免保持光源上，除非冰晶被可视化，以防止加热己烷。

4.导电的压片分析

1. 浸一次性尖端固定到在浸油的自动吸管（1-20微升），用纸巾除去任何多余的油。这一步将允许样品下降，而不是坚持移液管的外侧。
   注:从吸管去除多余油脂关键是要确保油滴不会形成冰晶体，使得可视化困难。
2. 移液管10μL样品和地点移液管直接在释放样品之前塑料管。当样品撞击玻璃盖玻片，创造冰晶的单层一个独立的"图示"的声音应该被听到。
3. 快速并小心地取出从使用镊子和发生在该偏振膜的顶部上的己烷浴中冷块中的显微镜载玻片上。
4. 在显微镜下看，把显微镜载玻片进入视和广告领域只是物镜，使得交叉极化允许高对比度冰晶的可视化。调整放大倍数40倍。
5. 将相机安装到显微镜和调整到"宏"的设置，以允许冰晶体的清晰的可视化，并捕获图像。
   注:等待长达1个小时，使冰晶生长可以给更清晰的画面。
6. 重复步骤4.1-4.5所有样品。通常，放置最多6个滑动与在己烷腔室中的不同的样品。
7. 关闭光源并放置在己烷浴塑料板，确保紧密的密封。允许冰晶退火过夜（12-24小时，保持一个特定测定内一致的退火期间）。在温育之后，如上文所描述的冰膜的捕获图像。
   注:某些样本可能比其他人更快地再结晶。如果12个小时后没有再结晶是明显的，允许晶体退火达24小时，以确保没有recrystalli矩阵特殊积会发生。

5.片分析数据分析

1. 上传照片到电脑前和退火后直接比较冰晶的大小。用冰再结晶活性的样品不会生长，而没有无IRI活动样本将重结晶形成明显更大的冰晶。光干扰会使大量冰晶出现在稍微不同的色调，因此很容易看到。

6.冰亲和力净化设备安装

1. 填与乙二醇的温度可编程循环水浴中。绿色汽车乙二醇可以使用。
2. 浴连接到使用绝缘塑料管¹⁵的中空，黄铜探针。
3. 构造一个聚苯乙烯容器，其中一个150毫升烧杯中，可紧贴地配合。创建用于与中心为黄铜​​指形冷冻器中的孔的容器的盖子。

7。样品的制备用于冰亲和纯化

1. 冷驯化植物组织中第2.1节所描述的。
2. 收集〜100-150克在20个毫升管中的地上生物量（步骤2.3）的并立即闪烁冻结。样品可以保持在使用前-80℃。
3. 如在章节2.3-2.5描述制备样品。使用1:1倍的比例（mg组织:天然蛋白质提取缓冲液中的溶液），用于叶组织的再悬浮。使用额外的蛋白酶抑制剂药片通过内源蛋白酶，以避免IBPS的降解。
   注意:如果所述组织样品是过于集中，调整比率为1:2或1:3（mg组织的:天然蛋白质提取缓冲液中的溶液）。
4. 以去除细胞碎片，通过2层干酪包布的，分3次筛裂解物。沉淀通过离心碎片以30,000×g于4℃下40分钟。
5. 增加样品的使用天然蛋白质提取缓冲液120毫升的体积。立即使用裂解液冰亲和纯化，以避免冰结合活性的任何损失。

8.导电冰亲和纯化

1. 在纯化前，设置可编程水浴从-0.5℃至冷却在-0.04℃/ h的速率至-3℃。
   注:冷却速度可根据样品的初始体积进行调整。
2. 冷却冰手指至-0.5℃，并随后将其浸没到含有冷蒸馏水50mL试管。添加一些冰块，以促进冰成核和允许冰的薄层，以形成在手指上。这个过程通常需要20分钟到30之间。
   注:在冰面上涂覆的手指的任何团块应该用戴着手套的手在样品放置之前被平滑化。如果冰层不会在-0.5℃下形成，将温度降低到-0.75℃。
3. 地方样品中的150姆·格拉斯烧杯中含有小的磁力搅拌棒放入在磁力搅拌器上的顶部上的聚苯乙烯容器。确保冰手指居中并降低至少一半的方式进入液体样品。密封容器。
4. 允许程序大约运行了两天，检查每24小时。一旦样品的50％被冻结，停止该程序。 IBPS的纳入冰半球会导致"冰蚀刻"。
   注:实验纯化可使用较大的样品体积随着时间的长度在该程序运行相应的调整来进行。
5. 为了除去冰半球，温探测到4℃，冲洗半球用蒸馏水以除去未结合的蛋白质，然后在4℃下解冻。
   注意:大多数IBPS不是水和适当的缓冲液稳定的（ 即 50毫摩尔Tris-HCL，pH为8或50mM碳酸氢铵，pH 8）中将需要在解冻过程中定期加入（约1毫升/ 2小时） 。冰半球可以包裹在铝箔和解冻之前储存在-20℃。
6. 如果冰半球还含有小号颜料，或以增加样品纯化，重复步骤8.1-8.5 2-3次。
   注意:虽然IBP的浓度可以更低以下多轮的纯化，纯度大于屈服如果纯化的样品将使用MS分析更有价值。如果有足够的材料是可用的，建议三轮冰 - 亲和纯化的。

9. IBPS的鉴定

1. 由于IBPS跟随冰半球的解冻包含在一个大的体积，浓缩的样品。集中使用离心浓缩管与3000沓分子量截止，以避免小蛋白质的损失含有约100 g组织至〜1-3毫升样品。
2. 在发送之前样品的MS，确定使用蛋白定量测定法中的蛋白质浓度，如BCA或Bradford测定。通过凝胶电泳例如SDS-PAGE估计的样品的纯度。之前测试IRI活动的纯化蛋白质瑟nding为MS，以确保活性蛋白已经通过纯化和浓缩步骤保留。
3. 直接使用浓缩的样品用于质谱分析^10。

结果

为了便于设置， 图1和 图2被包括作为分别用于IRI分析和冰-亲和纯化，该设备的视觉表示。使用来自芥菜杂草收集有和没有IBPS提取IRI分析的结果在图3中被描绘。这些结果表明，从芥末杂草，这是不冷冻耐受收集提取物，无法限制冰晶生长由于缺乏IBPS本的。相比之下，小冰晶看到用含有从多?...

讨论

对于IBPS成功的分析和纯化，了解一些这些蛋白质的温度敏感性是非常重要的。某些植物IBPS在温度高于0℃变得不稳定，导致解折叠，沉淀和不活动。为了获得活性IBPS，通常关键的是植物在冷室（〜4℃）处理，并在实验过程中样品保持在冰上。另一个因素考虑使用全细胞裂解物的粗时是通过内源蛋白酶的蛋白质的降解。在植物中，IBPS的表达一般是低的，并且因此在蛋白质产量的损失可能导致材料?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifugetubes	Fisher	05-408-129
Adjustable lab jack	Fisher	S63080
Benchtop centrifuge	Desaga MC2
Brass probe	Custom built
Camera/camera port	Canon		Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port
Cheesecloth	Purewipe/Fisher Scientific	06-665-25A
Concentration tubes (0.5 mL)	EMD Millipore	UFC501008
Concentration tubes (15 mL)	EMD Millipore	UFC900308
Conical tubes (50 mL)	Thermo Fisher	AM12502
Cooling block	VWR	13259	Use a metal heating block
Dehumidifier	Whirlpool		50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier
Dessciation beads	t.h.e. Dessicant/VWR	EM-DX0017-2	6-8 mesh size; 100% indicating
Dissection microscope	Olympus Tokyo
Double walled glass bowl	Generic		Purchase from local lab glassware supplier
Dry ice	Generic		Use local supplier; hazardous
EDTA-protease inhibitor tablets	Sigma Aldrich	11836170001	Roche cOmplete mini
Ethylene glycol	Generic		Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot)
Hexane	Sigma Aldrich	296090	Anhydrous, 95%; hazardous
Immersion oil	Sigma Aldrich	56822
JA10/20 centrifuge	Beckman
Large plastic Petri dish	Generic
Liquid nitrogen	Generic		Use local supplier; hazardous
Magnetic stir plate	Hanna Instruments	HI190M
Microscope cover slides	Fisher	12-542A
Plastic tube	Generic		Purchase PVC pipe from local hardware store
Polarized film	Edmund Optics	43-781
Polystyrene foam	Generic		Can be constructed from polystyrene shipping boxes
Poreclain mortar and pestle	Fisher	FB961
PVPP	Sigma Aldrich	77627	110 µm particle size
Retort Stand	Fisher	12-000
Small stir bar	Fisher	14-513-51
Temperature-programmable water bath	VWR	13271-118
Vacuum grease	Dow Corning/Sigma Aldrich	Z273554
Vinyl tubing	Generic