体外和活体评估移植受体的 T、B 和髓细胞抑制活性和体液反应

摘要

在这里, 我们提出了一个诱导耐受性的移植, 并评估体外和体内的抑制能力的不同细胞亚群从接受者和免疫状态的受体向施主或外源性抗原。

摘要

移植的主要关注是通过诱导调节细胞来达到特定的耐受性。对公差机制的理解需要可靠的模型。在这里, 我们描述模型的耐受性心脏移植的大鼠, 诱导阻断 costimulation 信号或通过上调的免疫调节分子通过基因转移。这些模型中的每一个都允许在体内生成调节细胞, 如调节性 T 细胞 (Tregs)、调节 B 细胞 (Bregs) 或调控髓细胞 (RegMCs)。在这篇手稿中, 我们描述了两种互补的协议, 它们被用来识别和定义体外和体内调节细胞活动, 以确定它们在耐受性诱导和维护中的责任.首先, 一个体外抑制性试验允许以剂量依赖性的方式快速识别具有抑制能力的免疫细胞, 并可用于进一步分析, 如细胞因子的测定或细胞毒性。第二, 从耐受治疗的接受者的细胞移植到新近辐照的接枝受体, 突出了这些细胞在控制移植定向免疫应答和/或转换新的调节细胞方面的耐受特性 (称为传染性耐受)。这些方法不限于具有已知表型标记的细胞, 并且可以扩展到任何细胞群。此外, 捐助者定向 allospecificity 调节细胞 (这一领域的一个重要目标) 可以通过使用第三方供体细胞或移植或体外或体内来评估。最后, 为了确定这些调节细胞的特定耐受能力, 我们提供了评估体液 anti-donor 抗体应答的协议和接受者对新的或前已知抗原进行体液反应的能力。所描述的公差模型可用于进一步刻画调控细胞, 识别新的生物标志物和免疫调节分子, 并适应其他移植模型或啮齿动物或人类自身免疫性疾病。

引言

大鼠心脏移植是一种可靠的器官移植模型, 用于评估耐受性诱导治疗, 破译耐受诱导和维持的机制, 并具有诱导功能性和显性调控细胞的潜能。下面的协议描述了一个完全不匹配的异位心脏移植从刘易斯1W 捐赠鼠 (卢 1 w, RT1^u) 到刘易斯1A 受体鼠 (卢. 1 a, RT1^a)。在这种嫁接组合中, 急性排斥反应迅速 (在大约7天), 可以很容易地通过通过触诊的腹部进行移植物跳动测量。在这里, 我们提出了三项协议, 以诱导耐受性心脏移植大鼠。在这些模型中, 公差是由不同的调节细胞类型诱导和/或维持的。首先, 阻断 CD40-CD40L 的相互作用与腺病毒编码 CD40Ig (AdCD40Ig) 诱导的 CD8⁺ Tregs 能够诱导耐受性时输转移到辅助嫁接收件人¹。此外, AdCD40Ig-treated 接收者中的 CD8⁺细胞 (带有 anti-CD8α抗体) 的损耗产生了 Bregs 和 RegMCs²。CD8 的深层分析⁺ Tregs 属性突出显示了定义为 interleukin-34 (IL-34) 和 Fibroleukin-2 (FGL-2)^3、4、5、6 的几个免疫调节分子的关键作用..而过度表达的 IL-34 (与 AAV 载体) 诱导 Tregs 通过生成 RegMCs, 过度表达 FGL-2 诱导 Bregs, 在复杂的调控细胞网络的基础。

由于慢性排斥发展缓慢, 是长期的, 需要 in-depth 分析来区分耐受性与慢性排斥。移植通常被评估为细胞浸润, 纤维化, 血管壁增厚和补充 C4d 沉积由 immunohistology⁷。虽然组织学方法需要动物的牺牲或移植活检, 这里我们描述了一个简单的方法来评估不同的特点, 耐受同种异体: 调节细胞的出现和功能和 anti-donor 特异抗体反应的血液样品流式细胞仪 (在这里, 我们使用荧光活化细胞分类 (外地))。

对同种异体骨移植后的耐受性的维持通常与诱导的调节细胞⁸有关。在过去的几十年中, 研究的重点是 CD4⁺Tregs 一致的特点, 他们的关键标记 Foxp3⁺, CD25^高, 和CD127¹⁰⁹¹¹。同样, 多个标记被归因于 CD8⁺ Tregs, 如 CD122⁺、CD28、CD45RC^低、PD1⁺和赫利俄斯^{+ 1、12、13}、^,15,16,17. 多年来, GITR、CTLA4 和细胞因子 (IL-10、TGFβ、IL-34、IL-35、FGL-2) 的表达还与 t 配置文件^3、4、6、¹³等相关联. ^{18、19、20、21}。然而, 新兴的调控细胞群体, 如 Bregs, RegMCs, 或 NKTregs, 缺乏相关的特定标记。实际上, Bregs 主要报告为未成熟的 CD24⁺单元格, CD27 表达式不明确, 有时生成 IL-10、TGFβ或颗粒 B^22、23、24。髓细胞谱系的复杂性需要多个标记的组合来定义它们的调节或促炎症轮廓, 如 CD14、CD16、CD80、CD86、CD40、CD209a 或 CD163^25,26。最后, 报告了一些标记来识别 NKTregs, 如 CD11b⁺, CD27⁺, TGFβ⁺, 但是需要更多的研究来进一步型描述它们^{27,28,29 ,30,31,32}。因此, 需要抑制活动的证据, 使进一步的表型描述合法化, 新的生物标志物, 新的免疫调节介质, 并扩大范围, 以新的细胞疗法。

我们提出两种互补的方法来评价细胞的抑制活性。首先,体外方法包括培养具有标记效应 t 细胞的抑制细胞, 由异基因供体细胞抗原呈递细胞 (apc) 在6天内不同比例的刺激, 并分析效应 t 细胞增殖反映了捐助者定向的免疫抑制。治疗后的大鼠细胞可以直接与单纯的大鼠和处理移植大鼠的细胞进行比较, 以抑制活性 (或其他调控细胞的数量), 在一系列抑器: 效应比。此外, 这种方法不需要任何移植, 并取得的结果在6天内。其次,体内方法包括将预期的调节细胞从被处理的老鼠转移到新近辐照的接枝受体。处理天真大鼠的 B 细胞、髓细胞或 T 细胞通常无法抑制急性排斥反应, 并在过继转移时延长移植成活, 而接受治疗的受体强化抑制作用的细胞具有这些特性^1,2,3,4,33。淋巴细胞诱导受照射的接受者建议允许输转移细胞保持不受血液稳态的影响, 更容易掌握 anti-donor 免疫应答。对于这两种方法,体外利用同种异体第三方 apc 或体内将抑制细胞转移到接受 third-party 心脏移植的受体中, 可以分析 anti-donor 特异性。而在体内方法需要大量的细胞, 但表现不佳的细胞亚群可以更容易地评估为抑制活动体外³³。

体液反应也可以测量, 以评估耐受状态和控制的定向抗体反应的施主抗原。的确, 耐受性的特征是缺乏体液对捐献者的反应, 而是对受体对新抗原的体液反应和记忆反应的保存能力的保护。首先, 同种检测的原理是基于受体抗体在捐赠细胞类型与移植接受者血清的孵育后对供体细胞的识别。其次, 对外源性抗原的体液反应可以通过对帽血 (KLH) 与完全弗氏佐剂乳化的长期耐受受体的刺激进行评估。在免疫接种后, 可分别检测4和13天的特异 IgM 和 IgG 抗体, 与酶联免疫吸附试验 (ELISA)³⁴。第三, 免疫记忆反应的保存可以通过注射异种红细胞 (红细胞) 在-7 天和 +3 的移植和红细胞染色与受体血清收集在 +8 和 +17 天后移植。所有这些方法都可以通过使用特定的二级抗体来鉴定免疫球蛋白亚型, 并通过酶联免疫吸附法或几个小时快速获得1.5 小时以内的结果。

最后, 这些协议是为移植模型的特点而设计的, 在一定程度上可以应用于自身免疫疾病模型。该方法的原理可以转换为所有物种。

研究方案

注意: 这里的所有协议都是由一个道德委员会批准的, 应该以不育的方式进行。

大鼠同种异体心脏移植模型的耐受性1.Generation

1. 卢 1 w 到卢1异体移植手术
   1. 麻醉 1 w 大鼠使用异氟醚-O₂吸入, 在5分钟后补充 1% N₂O 将动物放在背卧处, 并用控告消毒腹部以执行开胸手术 (即, 切开胸腔的胸膜空间)。
      1. 钳的劣势和上级络静脉, 结扎他们, 并削减他们。然后切开肺动脉和主动脉, 在冷0.9% 氯化钠中保存移植物。
   2. 麻醉一个250克的男性卢. 1 一个受体鼠 (8-12 周) 使用异氟醚-O₂吸入, 辅以 1% min. 将动物放在背卧处, 用控告消毒腹部, 进行 xyphopubic 剖腹探查(即, 从剑过程到耻骨联合的大切口)。
      1. 外植肠道, 钳腹血管, 执行端侧吻合 (即,连接在一个通道的一端和另一侧的壁) 之间的移植主动脉和腹主动脉之间的肺动脉和腹腔静脉, 并删除钳。
   3. 缝合肌肉的平面和皮肤, 并用控告消毒。
   4. 注射啡 (镇痛) 6 毫克/千克皮下 (南卡罗来纳州) 和土霉素 (抗生素) 注 (贝聿铭), 并放置在一个热灯下的动物, 直到动物唤醒。注射丁丙诺啡 (阿片类) (50 µg/千克) 贝聿铭和昔 (非甾体抗炎药) (0.3 毫克/千克) 在移植日和后天。
2. 阻断刺激相互作用诱导耐受性
   1. 按照步骤1.1.1。1.1.2。
   2. 在动物设施的分类 A2 区域, 稀释 2 x 10¹⁰ AdCD40Ig (一种腺病毒编码 CD40Ig, 嵌合分子, 阻断 CD40-CD40L 相互作用) 在林格的乳酸溶液中达到最后的体积150µL并注入3点 (3 x 50 µL) 在移植的心尖部的心室壁。
   3. 按照步骤1.1.3 到1.1.4。
      注: AdCD40Ig 治疗可与 anti-CD8α、抗 ICOS 或 anti-CD28 抗体注射液有关,^2,35,36。
3. 重组蛋白的过度表达诱导耐受性
   1. 稀释 1 x 10¹²病毒基因组大鼠 IL34-recombinant AAV 在林格的乳酸溶液, 以达到最后的体积100µL. 麻醉150一大鼠与异氟烷 O₁吸入并注入静脉 (静脉注射) 在生殖器。
   2. 一个月后, AAV-IL34 注射, 执行一个卢. 1 w 移植的卢. 1 根据协议1.1 的收件人。

2.体外混合淋巴细胞反应 (火箭) 对细胞抑制活性的评价

注意: 应将耐受性大鼠的细胞抑制活性与体移植受体或单纯性大鼠的等效种群进行比较。

1. 异基因 apc 的分离: 样树突状细胞 (pdc)
   1. 麻醉一个男性卢. 1 w 天真的供体鼠使用异氟醚-O₂吸入, 补充 1% N,₂o 在5分钟后, 将动物置于背卧, 并用控告消毒腹部以执行脾切除术。用 transecting 将脾取出, 在冷的1X 磷酸缓冲盐水 (PBS) 中保存脾脏, 缝合动物。
   2. 在盘中转移脾脏, 取出 1X PBS 和灌注5毫升0.2% 胶原酶 D。为了改善酶的消化, 将脾脏切成小块, 在37° c 下孵育15分钟。
   3. 加入500µL 的0.1 米乙酸酸 (EDTA), 将脾片转移到筛子中, 用注射器活塞粉碎脾脏, 使细胞游离。转移到一个管和洗涤的细胞与15毫升的 1X PBS。离心机10分钟, 430 x 克丢弃上清液。
   4. 为了消除红细胞和血小板, 在10毫升低渗溶液中重脾颗粒, 室温下孵育5分钟 (RT)。用 1X PBS 和离心机清洗10分钟, 190 x g. 丢弃上清液。
   5. 通过过滤100µm 组织过滤器去除胶原纤维。在 1X PBS/2%fetal 小牛血清 (FCS)/0.5 毫米 EDTA 中, 将细胞浓度调整到 5 x 10⁷细胞/毫升。
      注意: 脾的数目应介于 4 x 10⁸和 7 x 10⁸单元格之间。
   6. 在单元格排序前通过负选择来丰富感兴趣的单元格。孵育15分钟, 在4° c 与2µg/毫升纯化抗体特异的 T 细胞 (抗 TCRαβ, R7/3 克隆, 抗 TCRγδ, V65 克隆), B 细胞 (anti-CD45RA, OX33 克隆), NK 细胞 (抗 CD161, 3.2.3 克隆), 用 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA 和离心机洗涤10分钟在 430 x g.丢弃上清液。
   7. 用磁珠洗涤3次, 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA。使用3.5 µL beads/10⁶脾, 通过添加30毫升 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA, 在磁铁上放置1分钟, 并丢弃上清。重复两次。重的珠子在10卷 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 edta (例如, 35 µL 珠被稀释350µL 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 edta)。
   8. 将脾与磁珠混合, 在4° c 下搅拌10分钟, 将该管放在磁体上1分钟, 并将上清液转移到新的管中, 从而去除多余的细胞。重复两次。在 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA 中对细胞进行计数, 并将细胞浓度调整到 5 x 10⁷细胞/毫升。
      注: 富脾数字应介于 5 x 10⁷和 9 x 10⁷之间。
   9. 使用标记抗体对细胞进行染色, 进一步分类 pdc: 排除剩余的 T 细胞 (反 TCRαβ、R7/3 克隆) 或 B 细胞 (anti-CD45RA、OX33 克隆) 和排序 CD4⁺ (anti-CD4、OX35 克隆) CD45R⁺单元格 (anti-CD45R、His24 克隆)。标签珠与每个 Ab 建立一个补偿矩阵的外地资产管制。孵育15分钟在4° c 和洗涤用 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA。
   10. 重在浓度为 5 x 10⁷的细胞/毫升, 过滤60µm 组织过滤器, 并标记死细胞通过添加 DAPI 在最后浓度0.1 µg/毫升。通过在 DAPI^-TCR^-CD45RA^-CD4⁺CD45R 中显示70µm 喷嘴单元格排序单元格, 如 图 1所示。
2. 响应方效应 T 单元的隔离 (CD4 ⁺ CD25 ^- t 单元格)
   1. 从一个处理的 non-grafted 中收获脾脏1一只老鼠, 并保存在冷 1X PBS。
   2. 将脾脏放入盘中的筛子中, 加入10毫升的 1X PBS。用注射器的活塞粉碎脾脏, 使细胞脱离。将细胞转化为50毫升的管子, 用 1X PBS 洗涤, 离心机10分钟, 430 x g. 丢弃上清液。
   3. 为了消除红细胞和血小板, 重10毫升低渗溶液中的脾颗粒在 RT 5 分钟, 然后在 1X PBS 和离心机上洗涤10分钟 190 x g. 丢弃上清液。
   4. 通过过滤100µm 组织过滤器去除胶原纤维。在 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA 中计算单元格浓度以调整到 5 x 10⁷单元/mL。
      注意: 脾的数目应介于 3 x 10⁸和 5 x 10⁸单元格之间。
   5. 在排序前丰富感兴趣的细胞。孵育15分钟, 在4° c 与2µg/毫升纯化抗体特异 CD8 细胞 (anti-CD8α, OX8 克隆), B 细胞 (anti-CD45RA, OX33 克隆), NK 细胞 (抗 CD161, 3.2.3 克隆), 髓细胞 (anti-CD11b/c, OX42 克隆), 伽玛三角洲 T 细胞 (抗 TCRγδ, V65 克隆)。然后用 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA 冲洗, 离心机10分钟, 430 x g. 丢弃上清液。
      注意: 要排序自然 CD8⁺ Tregs 从天真的老鼠在同一时间 CD4⁺效应 T 细胞, 不要添加 anti-CD8α在耗尽期间 Ab。
   6. 用 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA 洗涤磁珠3次, 如步骤2.1.7 所述。
   7. 将脾与磁珠混合, 在4° c 下搅拌10分钟, 然后将管放在磁体上1分钟, 然后将上清液转移到新的管上。重复两次。在 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA 中对细胞进行计数, 并将细胞浓度调整到 5 x 10⁷细胞/毫升。
      注意: 脾数字的范围应介于 5 x 10⁷和 8 x 10⁷单元格之间。
   8. 添加标记抗体排序 CD4⁺CD25^- T 细胞: 反 TCRαβ (R7/3 克隆), 反 CD4 (OX35 克隆), anti-CD25 (OX39 克隆) 和孵化15分钟在4° c。若要同时对 CD8⁺CD45RC^低Tregs 进行排序, 请添加 anti-CD45RC Ab (OX22 克隆)。标签珠与每个 Ab 建立一个补偿矩阵, 进一步处理流式细胞仪。用 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA 清洗细胞, 丢弃上清液。
   9. 重细胞到 5 x 10⁷细胞/毫升, 过滤60µm 组织过滤器, 并标记死细胞通过添加 DAPI 在最后浓度0.1 µg/毫升。通过在 DAPI ^-TCR⁺CD4⁺CD25 单元格中的单元格对70µm 喷嘴单元格分类器进行排序 (如果需要, 请 DAPI TCR ⁺CD4 CD45RC^低作为 CD8⁺Tregs 抑制细胞), 如图 2所示。
3. 抑制细胞的分离
   注意: 将脾脏分为两个等分: B 细胞、髓细胞和 NK 细胞, 另一种在 CD4⁺和 CD8⁺ CD45RC^低T 细胞, 以评估其抑制功能。
   注: 对于过继单元格传输, 请保存 1 x 10⁸脾, 以便在需要时通过过继转移作为对公差的积极控制。
   1. B 细胞、髓细胞和 NK 细胞的分类
      1. 按照协议2.1.1 到2.1.5。
      2. 孵育15分钟, 在4° c 与2µg/毫升 T 细胞特异的未标记抗体 (抗 TCRαβ, R7/3 克隆, 和反 TCRγδ, V65 克隆), 洗涤用 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA 和离心机10分钟在 430 x g. 丢弃上清液。
      3. 用磁珠洗涤3次, 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA, 如步骤2.1.7 所述。
      4. 混合脾与磁珠, 以消除不需要的细胞和孵化10分钟在4° c 的鼓动下, 然后把管在磁铁上1分钟, 并转移上清到一个新的管。重复两次。在 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA 中对细胞进行计数, 并将细胞浓度调整到 5 x 10⁷细胞/毫升。
      5. 添加标记抗体的脾, 以排序细胞怀疑抑制活动, 如髓细胞 (anti-CD11b/c, OX42 克隆), B 细胞 (anti-CD45RA, OX33 克隆), 或 NK 细胞 (anti-CD161, 3.2.3 克隆)。标签的珠子与每个 Ab 建立一个补偿矩阵的外地资产管制。孵育15分钟在4° c 和洗涤用 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA。
      6. 重在浓度为 5 x 10⁷的细胞/毫升, 过滤60µm 组织过滤器, 并标记死细胞通过添加 DAPI 在最后浓度0.1 µg/毫升。通过在 DAPI^-CD11b/c⁺对髓细胞、CD45RA⁺为 B 细胞和 CD161⁺对 NK 细胞进行排序, 如图 3中所示, 对具有70µm 喷嘴单元格分类器的单元格进行分拣。
   2. CD4 ⁺和 CD8 ⁺ CD45RC^低T 单元格的排序
      1. 按照协议2.2.1 到2.2.4。
      2. 对于磁性柱上的阴性选择, 孵育15分钟在4° c 与2µg/毫升纯化抗体特异 B 细胞 (anti-CD45RA, OX33 克隆), NK 细胞 (抗 CD161, 3.2.3 克隆), 髓细胞 (anti-CD11b/c, OX42 克隆), 伽玛三角洲 T 细胞 (抗 TCRγδ, V65 克隆), 清洗他们与 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA 和离心机10分钟在 430 x g. 丢弃上清。
      3. 用 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA 洗涤磁珠3次, 如步骤2.1.7 所述。
      4. 将脾与磁珠混合, 在4° c 下搅拌10分钟, 然后将该管放在磁体上1分钟, 然后将上清液转移到新的管上。重复两次。在 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA 中对细胞进行计数, 并将细胞浓度调整到 5 x 10⁷细胞/毫升。
      5. 添加标记抗体的细胞, 以排序 Tregs: 反 TCRαβ (R7/3 克隆), anti-CD4 (OX35 克隆), anti-CD45RC (OX22 克隆)。标签的珠子与每个 Ab 建立一个补偿矩阵的外地资产管制。孵育15分钟在4° c 和洗涤用 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA。
      6. 重在浓度为 5 x 10⁷的细胞/毫升, 过滤60µm 组织, 并标记死细胞通过添加 DAPI 在最后浓度0.1 µg/毫升。通过在 DAPI^-TCR⁺CD4⁺CD45RC^低CD4⁺Tregs 和 DAPI TCR⁺CD4 CD45RC^低为 CD8⁺Tregs (图 4)。
         注: anti-CD8α ab (OX8 克隆) 可以使用, 而不是 anti-CD4 ab 如果 T 细胞被歧视的 CD4⁺非 t 细胞通过反 TCR 标记.过量的 CD4⁺Tregs 应根据细胞增殖染料 (的) 标记对细胞死亡的预期进行排序.
4. 羧基琥珀酰亚胺酯 (CFSE) 标记的应答细胞, 以测量增殖
   1. 在应答细胞排序后, 用 1X PBS 清洗两次细胞。
   2. 重在 1X PBS 的浓度为 1 x 10⁷细胞/毫升的细胞, 孵化与0.5 µM CFSE 为5分钟在 RT 在黑暗中。停止反应, 加入 FCS 在1.5X 的体积和离心机10分钟在 430 x g 在4° c。丢弃上清液。
   3. 用完全培养基冲洗两次细胞, 计数细胞。
      注: 在这一步, 预计30% 的细胞死亡。
5. CD4 ⁺ Tregs 的标签, 用于 CD4 ⁺效应单元的压制性试验
   注意: 这一步是歧视 CFSE^-CD4⁺Tregs 从 CFSE 增殖响应程序 CD4⁺T 细胞在6天的共通过在方案的细胞上浇口。
   1. 在 CD4⁺ Tregs 单元格排序后, 用 1X PBS 清洗两次单元格。
   2. 重在 1X PBS 的浓度为 1 x 10⁷细胞/毫升的细胞, 孵育与10µM 的 V450, 在 RT 在黑暗中的20分钟。
   3. 用完全培养基冲洗两次细胞, 计数细胞。
      注: 在这一步, 预计30% 的细胞死亡。
6. 共的建议
   1. 使用培养基包括: RPMI 1640 培养基辅以β-基 (5 x 10^-5 M), 青霉素 (100 U/毫升), 链霉素 (0.1 毫克/毫升), 丙酮酸钠 (1 毫米), 谷氨酰胺 (2 毫米), HEPES 缓冲液 (1 毫米), 非必需氨基酸 (1X), FCS (10%)。
   2. 培养细胞在96井 U 底板。
   3. 按以下顺序添加单元格: 压制细胞、应答细胞和异基因细胞。
   4. 保持恒定的应答 T 细胞和异基因 apc 的数量, 并测试一系列的 Tregs 数。例如, 比率 4:4: 1, 5 x 10⁴抑制细胞, 5 x 10⁴响应单元格和 1.25 x 10⁴异基因细胞, 和比率 2:4: 1, 2.5 x 10 4 抑制细胞, 5 x 10 ⁴响应单元格, 和 1.25 x 10⁴异基因细胞.
   5. 保持200µL 介质/井的 5 x 10⁴响应单元格的比例。
   6. 对于控制, 包括一些没有异基因 apc (负控制) 的应答 t 细胞和应答 t 细胞与异基因 apc 没有调节细胞 (积极控制) 的 CFSE 浇口在6天 (见步骤2.7.6。
7. 共6天后的染色及分析
   注意: 效应细胞的增殖可以在多个时间点进行评估。注意, 扩散是指数性的: 随着细胞分裂的增加, 抑制条件和阴性控制之间的差异可以被观察到。
   1. 从96井 U 底板转移到96井 V 底板和离心机1分钟在 1200 x g 在4° c。
   2. 如果需要的话, 在-20 ° c 的时候将上清液保存在一个新的盘子里来测量细胞因子水平。
   3. 洗涤细胞与200µL 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA 每井和离心机1分钟在 1200 x g 在4° c。
   4. 将抗体添加到细胞中进一步的门上的应答 T 细胞: 抗 TCRab (R7/3 克隆) 和 anti-CD4 (OX35 克隆)。孵育15分钟在4° c 和洗涤两次与200µL 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA 每井。丢弃上清液。
   5. 添加100µL DAPI 稀释在0.1 µg/毫升在 1X PBS 和阅读板与一个外地资产管制分析仪。
   6. 通过 DAPI 负 (实时单元) (non-CD4⁺Tregs) TCR⁺CD4⁺单元格来分析 CFSE 配置文件。刺激响应单元格具有最大的 CFSE 亮度, 如图 5左下角直方图所示。在同种异体 apc 存在的情况下, 应答细胞具有最大的增殖和最小的 CFSE 亮度 (底部、中部)。在异基因 apc 和调节细胞存在的情况下, 效应细胞具有中等增殖和 CFSE 亮度 (底部、右侧)。

3.活体内心脏移植受体细胞的过继转移对细胞抑制活性的评价

注意: 需要照射, 以消除宿主细胞, 有利于供体细胞植入和增殖。

1. 在移植前的前一天及早照射移植受体, 以获得接受者的先决条件。麻醉的大鼠与 i. m.注射嗪 (8 毫克/千克)-氯胺酮 (80 毫克/千克), 用 X 射线照射剂量4.5。
2. 按照协议2.3 隔离感兴趣的单元格。
   注意: 如果需要, 请保存 1 x 10⁸脾以作为对公差的积极控制。
3. 照射后12小时 (移植前的前一天, 晚上), 麻醉吸入4% 异氟醚-O ₂并注入细胞 (5.0 x 10⁷ T 细胞, 3.0 x 10 7 B 细胞, 3.0 x 10 7 髓细胞, 或 1.50 x 10 8脾是通过过继转移对耐受性的积极控制 , 在静脉中静脉注射。
   注意: 通过过继转移所需的细胞数量取决于细胞的抑制活性。
4. 第二天, 按照协议1.1 执行同种异体移植。通过腹部触诊来追踪移植的演变。

4. 供体特异抗体检测

注意: 针对移植供体的 IgG 反应是通过从捐献者的血清中孵化出受体的细胞来测量的。通过在体卢 1 w 血清中孵育细胞, 减去直接染色 1 w B 细胞引起的背景。

1. 收获血液从鼠和离心机15分钟在 1200 x g 在4° c。保存血清。血清可以储存在-20 ° c 或立即使用。在56° c 下孵育30分钟, 使血清中的补体钝化。
2. 从捐献者卢 1 w 鼠中获取脾脏, 并将其保存在冷 1X PBS 中。按照2.2.1 的步骤操作。2.2.4。在96井 V 底板中添加 2 x 10⁵单元格。离心机1分钟在 1200 x g 在4° c, 并丢弃上清。
3. 在 1X PBS (4 稀释/样品) 中从1/10 到1/270 依次稀释血清。在4° c 下孵育1小时的细胞, 25 µL 稀释血清/井。预测每个样本 (1 血清 x 4 稀释 x 4 igg 亚型) 对供体特异性 igg 类型 (igg、IgG1、IgG2a、IgG2b) 免疫应答的数量。用 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA 清洗细胞, 丢弃上清液。
4. 孵育细胞与每个小鼠鼠 IgG 亚型 Ab 荧光-标记为30分钟, 在4° c, 一个子类型/井。
   注: 如果荧光标记的鼠 Ig ab 是不可用的, 可以使用纯化的未标记的小鼠鼠 IgG 亚型 ab 和荧光标记的次要 anti-mouse ab. 根据可用的荧光和细胞仪配置,几个鼠 IgG 亚型可以测试在一个适当的设置。
5. 用 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA 清洗细胞两次, 丢弃上清液。
6. 添加100µL DAPI 稀释在0.1 µg/毫升在 PBS 和阅读板与一个外地资产管制分析仪。
7. 阅读在所有 DAPI^-单元格上标记有荧光的鼠 IgG 亚型 Ab 的平均荧光强度 (多边组织)。减去与天真的卢. 1 一个血清在卢. 1 w 细胞 (背景染色, 左下) 从每个接受者在卢的血清获得的. 1 w 细胞在相应的稀释 (底部中间为未经治疗的拒绝接受者显示显示中级多国公司的受处理宽容的接收者的最大的多边基金会和右下角 (图 6)。

5. 评价体液对外源性抗原的反应 (天真和记忆)

注: 移植前大鼠血清、治疗和免疫应作为体液反应的阴性对照。否则, 免疫天真的老鼠可以使用。免疫受体的血清,即, 移植 exoantigen 免疫和排斥受体, 被用作体液反应的阳性控制。

1. 发展体液对新抗原的反应能力 (图 7)
   注意: 这种方法是体液反应的相对定量, 因为它不包括一个标准。一个绝对的 Ig 量化是可能的, 增加了一系列的稀释的大鼠 IgG 或 IgM 抗 KLH Ab 与已知浓度的步骤5.1.6。
   1. 乳化50µg KLH 在200µL 完整弗氏的佐剂和注射在 long-surviving/耐受受体的尾部, 控制未治疗的拒绝接受者, 或天真的老鼠作为积极控制体液反应。
   2. 在免疫接种后4和13天采集血样, 在4° c 时离心15分钟, 1200 x g。保存上阶段是血清。从免疫的大鼠体内获取血清, 进行阴性对照。血清可在-20 ° c 冷冻, 直到 ELISA 检测。
   3. 涂层 ELISA 板 (平底) 与50µL/井 KLH 稀释在10µg/毫升在 1X PBS 在夜间在4° c。确保涂层溶液覆盖所有的井。
   4. 通过洗涤去除多余的未涂 KLH。要清洗, 请添加150µL/井洗涤缓冲器 (1X PBS 包含0.1% 补间) 和轻弹。
   5. 通过在37° c 下孵育1小时, 用100µL/井洗涤缓冲液 (含10% 个 FCS) 来阻断受体的 Ig 不结合。洗一次。
   6. 在洗涤缓冲液中依次稀释接受者血清, 从1/40 到 1/512, 添加50µL/好的重复的序列稀释到涂层板, 并孵化2小时在37° c。保持一些井不含血清, 以负控制。洗两次。
   7. 添加50µL 1 µg/毫升的生物素共轭鼠 IgM Ab 在含血清4天在接受者, 或50µL 生物素共轭鼠 IgG 在含血清13天, 并孵化 1 h 在37° c 的水井。洗两次。
   8. 在37° c 的45分钟, 在1µg/毫升中添加50µL/HRP 共轭亲和。洗3次。
   9. 添加50µL 3,3′, 5,5′ Tetramethylbenzidine (TMB) 衬底 < 30 分钟在 RT 和停止反应与25µL 2 米硫酸当积极控制饱和。
   10. 阅读 405 nm 的吸光度。比较接受者血清与单纯大鼠血清的光密度。
2. 内存体液反应能力评估 (图 8)
   1. 移植前7天, 注入静脉注射 10⁹的异种红细胞稀释800µL 1X PBS 进入天真老鼠。红细胞可以是绵羊、马或其他种类的。
   2. 进行移植并管理耐受治疗。
   3. 移植后3天, 再注射 10⁹红细胞稀释800µL 1X PBS 在移植受体和 non-grafted 大鼠。
   4. 采集血液样本5和14天后的第二次免疫和离心机15分钟在 1200 x g 在4° c, 以恢复上血清阶段。血清可以储存在-20 ° c 或立即使用。在使用前在56° c 孵育30分钟, 使补体在大鼠血清中钝化。
   5. 添加 2 x 10⁵ RBC/96 井 V 底板的井。离心机1分钟在 1200 x g 在4° c, 并通过抽吸小心地丢弃上清。
   6. 在 1X PBS (8 稀释/样品) 中, 连续稀释2倍的血清, 从1/10 到1/1280。在4° c 下孵育1小时的细胞, 25 µL 稀释血清/井。用 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA 清洗细胞, 丢弃上清液。
   7. 孵育的细胞与红细胞物种吸附鼠 IgG 或 IgM 亚型标记与荧光30分钟, 在4° c, 一个亚型/井。对免疫后5和14天血清中的大鼠 IgM 和 IgG 抗红细胞进行评估, 分别为.用 1X PBS/2%fcs/0.5 毫米 EDTA 清洗细胞两次, 丢弃上清液。
      注: 如果荧光标记的鼠 Ig ab 是不可用的, 可以使用纯化的未标记的小鼠鼠 IgG 亚型 ab 和荧光标记的次要 anti-mouse ab。
   8. 添加100µL DAPI 稀释在0.1 µg/毫升在 1X PBS 和分析的细胞与一个外地资产管制分析仪。
   9. 代表了各群体的稀释作用。

结果

对 apc (图 1)、响应单元和 Tregs 同时 (图 2) 或单独 (图 4) 和任何其他假定的管理单元 (图 3) 进行排序后的抑制活动的评估可以通过 CFSE 亮度的测量 (图 5) 直接注入调节细胞和体外完成体内。受体对捐献者的体液反应 (图 6) 或外...

讨论

将总脾移植到新移植的受体中是一种有效的方法, 可以通过治疗来检测诱导或强化的调节细胞的存在。宿主辐照诱导的瞬态淋巴细胞促进细胞在移植后的存活和耐受性的建立。此外, 致死照射留下时间的细胞与耐受属性转换为新的调节细胞在免疫重建, 一种现象称为传染性耐受³⁴。通常, 在观察公差时, 首先研究描述 CD4⁺CD25^高Foxp3⁺CD127^低Tregs。但是, ?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
animals
LEW.1W and LEW.1A rats	Janvier Labs, France		8 weeks old,
BN third party donor rats	Janvier Labs, France		8 weeks old,
name	company	catalogue number	comments
reagents
AdCD40Ig	Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France		home made plasmids
IL34-AAV	Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France		home made plasmids
FGL2-AAV	Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France		home made plasmids
anti-TCRab	Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K	R7/3 clone	Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD25	Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K	OX39 clone	Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD8	Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K	OX8 clone	Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RA	Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K	OX33 clone	Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD161	Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K	3.2.3 clone	Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD11b/c	Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K	OX42 clone	Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-TCRgd	Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K	V65 clone	Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RC	Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K	OX22 clone	Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD4	Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K	OX35 clone	Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45R	BD Biosciences, Mountain View, CA	#554881, His24 clone
anti-rat IgG-FITC	Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA	#112-096-071
anti-rat IgG1	Serotec	#MCA 194
anti-rat IgG2a	Serotec	#MCA 278
anti-rat IgG2b	Serotec	#MCA 195
anti-rat IgM-FITC	Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA	#115-095-164
streptavidin HRP	BD Biosciences, Mountain View, CA	#554066
KLH	Sigma Aldrich, St. Louis, USA	#9013-72-3
PBS 1X	Thermo Fisher Scientific Inc, USA		Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium,
Tween 20	Sigma, Saint-Louis, USA	#9005-64-5
TMB substrate reagent kit	BD Biosciences, Mountain View, CA	#555214
CellTraceTM CFSE cell proliferation kit	Thermo Fisher Scientific Inc, USA	#C34554
RPMI 1640 medium 1X	Thermo Fisher Scientific Inc, USA	#31870-025
penicilline streptomycine	Thermo Fisher Scientific Inc, USA	#15140-122
Hepes Buffer	Thermo Fisher Scientific Inc, USA	#15630-056
non essential amino acids	Thermo Fisher Scientific Inc, USA	#11140-035
Sodium pyruvate	Thermo Fisher Scientific Inc, USA	#11360-039
2 beta mercaptoethanol	Sigma, Saint-Louis, USA	#M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell	Thermo Fisher Scientific Inc, USA	#65-0842-85
Glutamine	Sigma, Saint-Louis, USA	#G3126
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc, USA	#D1306
Collagenase D	Roche Diagnostics, Germany	#11088882001
EDTA	Sigma, Saint-Louis, USA	#E5134
NaCl 0.9%	Fresenius Kabi	#B230561
Magnetic dynabeads	Dynal, Invitrogen	#11033	Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeads	Ebiosciences, San Diego, USA	#01-1111-42
Betadine	Refer to the institutional guidelines
Isoflurane	Refer to the institutional guidelines
Naplbuphine	Refer to the institutional guidelines
Terramycine	Refer to the institutional guidelines
Buprenorphine	Refer to the institutional guidelines
Meloxicam	Refer to the institutional guidelines
Complete Freund's adjuvant
Rompun	Refer to the institutional guidelines
Ringer lactate	Refer to the institutional guidelines
Ketamine	Refer to the institutional guidelines
Red blood cell lysis solution			Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.
Collagenase D			Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%)			Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen)			Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution
complete medium for coculture			500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS
name	company	catalog number	comments
equipments
falcon 50ml	BD Biosciences, Mountain View, CA	#227261
falcon 15ml	BD Biosciences, Mountain View, CA	#188271
sieve
Corning plastic culture dishes	VWR, Pessac	#391-0439
100µm and 60µm tissue filters	Sefar NITEX, Heiden, Switzerland	#03-100/44 and #03-60/35
96 wells U bottom plates for coculture	Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning	#353077
96 wells V bottom plates for FACS staining	ThermoScientifique, Danemark	#249570
96 wells flat bottom ELISA plates	Nunc Maxisorb
seringue for spleen crush	BD Biosciences, Mountain View, CA	#309649
ELISA reader	SPARK 10M, Tecan, Switzerland	SPARK 10M, Tecan, Switzerland
centrifuge
bain marie
X rays irradiator	Lincolshire, England	Faxitron CP160
solar agitator
FACS Canto II	BD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria II	BD Biosciences, Mountain View, CA
magnet	Thermo Fisher Scientific Inc, USA	12302D