一个<em&gt;体外</em&gt; Caseum结合测定，预测药物在渗透结核病变

摘要

在这里，我们描述了一种快速平衡透析（RED）方法，用于测量肺结核病变和腔内药物与病例的结合。该方案也与泡沫巨噬细胞衍生基质一起使用，这是一种有效的替代试剂。

摘要

消除结核病需要能够穿透多层复杂肺部病变的药物治疗方案。空腔和病变的干酪核心中的药物分布尤其重要，因为它们具有耐药细菌的亚群，通常也称为持久性细菌。用于测量结核病变中药物渗透的现有方法涉及与生物分析或成像技术相结合的昂贵且耗时的体内药代动力学研究。提出了与大肠杆菌大分子结合的药物的体外测定作为这种技术的替代方法，因为这种结合阻碍了药物分子通过底物的被动扩散。快速平衡透析是一种用于进行血浆蛋白和组织结合研究的快速可靠的系统。在该方案中，我们使用快速平衡透析（RED）装置来测量药物与排泄物的匀浆的结合从结核病感染的兔子的病变和腔中。该方案还描述了如何从脂质负载的THP-1巨噬细胞产生代替基质来代替小麦蛋白。这种病例/替代结合试验是结核病药物发现的重要工具，可用于帮助研究由其他疾病引起的病变或脓肿中的药物分布。

引言

肺结核病的治疗需要的药物有效的分配到不同类型的病变。坏死性病变和腔包含窝藏毒品宽容或"老大难"细菌的亚群干酪中心。 ^1，2空洞病与劣质治愈率和预后较差。 ^3，4以前的研究表明，使用定量和成像技术，即穿透caseum的能力而变化显著从一个药物类到另一个。 ^5,6这些方法，但是，需要使用动物感染模型是缓慢而乏味的。测量药物结合到离体 caseum 在体外测定的目的。这种结合被发现成反比地干酪样肉芽肿药物渗透和相互关联的，因此，是作为预测工具。 ⁷

平衡透析被认为是黄金标准的方法来血浆蛋白结合研究。快速平衡透析（RED）装置提供进行这种测定的一种快速，易于使用，可靠的系统。 ⁸所述的装置由两个部件组成:单次使用的，由通过半透膜的垂直筒2个分隔室的一次性刀片;和可重复使用的基板，其可容纳在一个时间48点的插入物。透析膜具有8kDa的分子量截止（MWCO），是理想的药物 - 大分子结合研究。膜隔室的高表面积 - 体积比允许快速透析和平衡。两个插入件和底板已经验证为最小的非特异性结合。用生物分析技术RED设备的组合提供了药物在p中未结合的级分的精确估计lasma。 ^8,9

虽然最初设计用于测量血浆蛋白结合，该RED设备已在若干组织结合研究使用匀浆使用。 ^10，11在这个协议中，我们测量药物结合到caseum，坏死碎屑从坏死损害和结核病感染的兔的空腔切除。干酪性材料的所述无细胞和非血管性质可以很容易地均匀成均匀的悬浮液，其与测定兼容。

鉴于caseum是乏味的，以产生和来之不易，该协议也被验证为与从泡沫巨噬细胞制备的替代矩阵使用。 THP-1单核细胞衍生的巨噬细胞与油酸诱导的积累，让他们自己的"泡沫"外观的多个脂质体。这些脂质加载收获细胞和加工成产生一个矩阵，我们用作表壳的替代品。这项研究表明，与该替代基质结合的药物与结合蛋白质有很好的相关性，有效地模拟了妨碍药物在肉芽肿和空腔的核心中的渗透的体内过程。

研究方案

所有动物研究按照指南国立卫生研究院的实验动物护理和使用从NIAID的机构动物护理和使用委员会（NIH），马里兰州贝塞斯达的批准进行。所有涉及结核分枝杆菌的研究是在实验室中的生物安全防护水平3（BSL-3）执行。

1.兔感染模型和Caseum收藏

1. 使用鼻式气溶胶曝光系统如前所述感染新西兰白兔结核分枝杆菌 。 ^12，13允许感染为12-16周进行。稳重用35毫克/千克氯胺酮和5mg / kg的甲苯噻嗪肌内，兔子安乐死与0.22毫升/公斤戊巴比妥钠和苯妥英钠兔子静脉内并与尸检进行。
2. 使用镊子和手术刀，从胸部取出CA肺VITY。从每个肺叶，使用手术刀解剖单个腔和大的坏死性肉芽肿。仔细地从空腔和肉芽肿壁上刮掉面包。称量，记录并将样品储存在-20℃的2 mL螺旋管中，直至准备使用。
3. Gamma在干冰上照射3 MegaRad上的感染性病例样本，使其在BSL-2实验室中不受感染和安全使用。

2.来自THP-1细胞的表皮代谢产物的体外生成

1. 在T175细胞培养瓶（80 mL /瓶）中，在RPMI 1640培养基（2 mM L-谷氨酰胺和10％胎牛血清）中培养THP-1单核细胞。将烧瓶在5％CO ₂气氛中于37℃孵育3-4天。
2. 将来自T175烧瓶的培养物以150×g离心5分钟的两个50mL锥形管中。弃去上清液并将沉淀悬浮在10mL的RPMI 1640培养基中。
3. 将5μL该培养液移至含有45μLt的1.5 mL试管中紫苏蓝通过移液彻底混合。将10μL转移到血细胞计数器，并使用光学显微镜（10倍放大）计数活的THP-1单核细胞数（未染色）。计算每毫升培养物的活细胞数。用RPMI培养基稀释至1.25×10 ^6个细胞/ mL的最终密度。
4. 在大细胞培养板（50×10 ^6个细胞/板）上加入40mL培养物。加入40μL100μMPMA（佛波醇12-肉豆蔻酸乙酯13-乙酸乙酯制备），并使细胞在培养箱中过夜。
   注意:PMA的最终浓度为100nM。
5. 在乙醇中稀释纯油酸（OA）（0.89 g / mL）至浓度为0.1 M（ 即在968.3μL乙醇中的31.7μLOA）。将此溶液稀释至新鲜预热的RMPI培养基中，浓度为10 mM。将该OA悬浮液稀释至预温至37℃的RPMI培养基中的0.4mM（最终工作浓度）。
6. 删除现有媒体和非从细胞培养板中吸收细胞，并轻轻加入40 mL 0.4 mM OA至THP-1巨噬细胞（THP-M）。在培养箱中37℃孵育过夜。
7. 使用40倍放大的光学显微镜来目视确认每个THP-M中存在许多脂质体夹杂物。从细胞培养板中取出所有的RPMI培养基，并用50 mL血清移液管用磷酸盐缓冲盐水（PBS）轻轻洗涤贴壁细胞两次。
   注意:脂质体在THP-M的细胞质中表现为小的，清晰的球形结构。
8. 在PBS中加入40mL 5mM乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS。在37℃孵育15分钟。
9. 通过使用10 mL血清移液管重复吸取整个板的表面，分离泡沫巨噬细胞（FM）。将细胞悬浮液转移到50mL锥形管中，并以150×g离心5分钟。
10. 将细胞沉淀重悬于10mL PBS（第三次PBS洗涤）中并转移到预先称重的15-mL锥形管中。以150 xg再次旋转5分钟。使用血清移液管小心吸出上清液并弃去。
11. 将FM颗粒置于3个冻融循环中以裂解细胞并将其在75℃下孵育20-30分钟以使基质中的蛋白质变性。将颗粒储存在-20°C直到准备使用。

快速平衡透析（RED）测定

1. 在二甲基亚砜（DMSO）中制备所有测试化合物的10mM储备溶液。在每次测定之前，稀释至DMSO中的500μM工作溶液。
2. 称重含有小麦替代颗粒的管。减去空管的重量以得出单独的颗粒的重量。每管添加2-3个金属珠，并使用组织匀浆器以1200冲程/分钟1分钟，破碎干酪或PBS（1:9w / v）中的替代物基质，以达到每种基质的10倍稀释悬浮液。
3. Spike 6.5μL的500试验化合物的μM溶液进匀浆643.5μL达到5μM（≤1％DMSO）和涡流的最终浓度。
4. 放置RED插入到基座板。添加药物掺入基质到每个RED插入物的供体腔室（红色环）和350μLPBS到每个接收器的腔室200μL。制备3插入各试验化合物（一式三份样品）。密封板用粘接剂密封板并孵育在37℃下在以200rpm（1×g）离心4小时的恒温。
5. 培育后，轻轻上下吹打2-3次的供体和受体室的内容混合。从供体室吸取出匀浆的20μL等分试样，并添加至PBS干净的20μL在1.5mL管（1:1）。类似地，从接收器腔室吸取出PBS样品的20μL的等分试样，并添加至20μL的清洁匀浆（矩阵匹配）。 ⁸
   注:矩阵匹配消除了NEED为2条独立的校准曲线（在匀浆和PBS）用于定量分析进行。供体腔的内容可能沉淀一段时间。轻轻由前中吸取吹打混合的内容。

4. LC-MS定量和数据分析

1. 加1的160μL:1甲醇:乙腈含有500毫微克/毫升的双氯芬酸或10ng / mL的维拉帕米（内标），以每管和涡流以沉淀蛋白质。离心机以10,000×g离心5分钟以沉淀沉淀物和上清液转移到96孔用于液相色谱 - 质谱（LCMS）分析深孔板。 ⁷
2. 从1-1,000纳米的各试验化合物建立校准曲线，同时保持相同的基质组合物作为样品的上方。量化测试化合物在从使用LC-MS方法的供体和受方腔室的样品的浓度。
3. 计算未结合的分数（f _u）的 Ôf使用方程1稀释的基质中的药物。使用等式2计算未稀释基质中的f _u （ D =稀释因子10）。 ¹⁴
   
   
4. 使用方程3检查每种化合物的恢复（质量平衡），以鉴定具有稳定性/代谢/非特异性结合问题的化合物。
   注意:恢复通常在70％到130％之间。 ¹⁵
   

结果

使用这个协议，我们已经测试了数百种结核病药物开发化合物，以达到预期的穿透性白蛋白的效率。 图1显示了RED测定的基本概念。 RED插入物的透析膜允许未结合的小分子从供体孔扩散到接收器，最终实现两个室之间的平衡。与大分子如蛋白质或脂质结合的小分子被捕获在供体井中。来自两个室的样品的定量分析允许计算小分子或替代基质中每个小分子的未?...

讨论

肺坏死病灶和空洞肺结核感染的患者含有细菌是顽抗到药物治疗的亚群。这些结构的干酪性芯是用于在细胞外环境中携带这些持留尤其负责。抗细菌剂为这些远程位置的¹⁶有利分布被认为是肺结核药物疗效的重要决定因素。在此之前协议的验证，没有体外技术，可以预测干酪样病变的药物发现的化合物的分布可用。其结果是，在这些关键病灶药物分布的评价在很大程度上?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
New Zealand White Rabbits	Covance	-
HN878 Mycobacterium tuberculosis	BEI Resources	NR-13647
Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N	Henry Schein Animal Health	56344
Anased (Xylazine) 100 mg/mL	Henry Schein Animal Health	33198
Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution	Virbac	710101
THP-1 monocytic cell line	ATCC	ATCC TIB-202
175 cm² TC-Treated Flask (T175)	Fisher Scientific	T-3400-175
RPMI 1640 media w/o glutamine	Fisher Scientific	MT-15-040-CV
Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated	Fisher Scientific	SH3091003IR
Hyclone L-glutamine, 200 mM	Fisher Scientific	SH3003401
Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented	Fisher Scientific	T-2881-1
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Fisher Scientific	BP685-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	E6758
Oleic acid	Fisher Scientific	ICN15178101
Pierce RED Device Reusable Base Plate	Fisher Scientific	PI-89811
Pierce RED Device Inserts, 50/box	Fisher Scientific	PI-89809
Pierce RED insert removal tool	Fisher Scientific	89812
Adhesive plate seal	Fisher Scientific	08-408-240
PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco)	Life Technologies	10010-049
DMSO	Sigma	472301
Acetonitrile	Sigma	34998
Methanol	Sigma	34860
Verapamil hydrochloride	Sigma	V4629
Diclofenac sodium salt	Sigma	93484
Trypan Blue Solution, 0.4%	Fisher Scientific	15-250-061
Ethanol, 200 proof	Fisher Scientific	04-355-451
2010 Geno/Grinder	SPEX SamplePrep	2010
Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads	Fisher Scientific	15-340-158
484R Cobalt 60 Irradiator	JL Shepard	7810-484-1
INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers	Fisher Scientific	22-600-100
Upright Light Microscope	Leica	DM1000
Binary Liquid Chromatography system	Agilent	1260	Multi-compenent
Mass spectrometer	AB Sciex	4000