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Method Article
在这里,我们描述了一种快速平衡透析(RED)方法,用于测量肺结核病变和腔内药物与病例的结合。该方案也与泡沫巨噬细胞衍生基质一起使用,这是一种有效的替代试剂。
消除结核病需要能够穿透多层复杂肺部病变的药物治疗方案。空腔和病变的干酪核心中的药物分布尤其重要,因为它们具有耐药细菌的亚群,通常也称为持久性细菌。用于测量结核病变中药物渗透的现有方法涉及与生物分析或成像技术相结合的昂贵且耗时的体内药代动力学研究。提出了与大肠杆菌大分子结合的药物的体外测定作为这种技术的替代方法,因为这种结合阻碍了药物分子通过底物的被动扩散。快速平衡透析是一种用于进行血浆蛋白和组织结合研究的快速可靠的系统。在该方案中,我们使用快速平衡透析(RED)装置来测量药物与排泄物的匀浆的结合从结核病感染的兔子的病变和腔中。该方案还描述了如何从脂质负载的THP-1巨噬细胞产生代替基质来代替小麦蛋白。这种病例/替代结合试验是结核病药物发现的重要工具,可用于帮助研究由其他疾病引起的病变或脓肿中的药物分布。
肺结核病的治疗需要的药物有效的分配到不同类型的病变。坏死性病变和腔包含窝藏毒品宽容或"老大难"细菌的亚群干酪中心。 1,2空洞病与劣质治愈率和预后较差。 3,4以前的研究表明,使用定量和成像技术,即穿透caseum的能力而变化显著从一个药物类到另一个。 5,6这些方法,但是,需要使用动物感染模型是缓慢而乏味的。测量药物结合到离体 caseum 在体外测定的目的。这种结合被发现成反比地干酪样肉芽肿药物渗透和相互关联的,因此,是作为预测工具。 7
平衡透析被认为是黄金标准的方法来血浆蛋白结合研究。快速平衡透析(RED)装置提供进行这种测定的一种快速,易于使用,可靠的系统。 8所述的装置由两个部件组成:单次使用的,由通过半透膜的垂直筒2个分隔室的一次性刀片;和可重复使用的基板,其可容纳在一个时间48点的插入物。透析膜具有8kDa的分子量截止(MWCO),是理想的药物 - 大分子结合研究。膜隔室的高表面积 - 体积比允许快速透析和平衡。两个插入件和底板已经验证为最小的非特异性结合。用生物分析技术RED设备的组合提供了药物在p中未结合的级分的精确估计lasma。 8,9
虽然最初设计用于测量血浆蛋白结合,该RED设备已在若干组织结合研究使用匀浆使用。 10,11在这个协议中,我们测量药物结合到caseum,坏死碎屑从坏死损害和结核病感染的兔的空腔切除。干酪性材料的所述无细胞和非血管性质可以很容易地均匀成均匀的悬浮液,其与测定兼容。
鉴于caseum是乏味的,以产生和来之不易,该协议也被验证为与从泡沫巨噬细胞制备的替代矩阵使用。 THP-1单核细胞衍生的巨噬细胞与油酸诱导的积累,让他们自己的"泡沫"外观的多个脂质体。这些脂质加载收获细胞和加工成产生一个矩阵,我们用作表壳的替代品。这项研究表明,与该替代基质结合的药物与结合蛋白质有很好的相关性,有效地模拟了妨碍药物在肉芽肿和空腔的核心中的渗透的体内过程。
所有动物研究按照指南国立卫生研究院的实验动物护理和使用从NIAID的机构动物护理和使用委员会(NIH),马里兰州贝塞斯达的批准进行。所有涉及结核分枝杆菌的研究是在实验室中的生物安全防护水平3(BSL-3)执行。
1.兔感染模型和Caseum收藏
2.来自THP-1细胞的表皮代谢产物的体外生成
快速平衡透析(RED)测定
4. LC-MS定量和数据分析
使用这个协议,我们已经测试了数百种结核病药物开发化合物,以达到预期的穿透性白蛋白的效率。 图1显示了RED测定的基本概念。 RED插入物的透析膜允许未结合的小分子从供体孔扩散到接收器,最终实现两个室之间的平衡。与大分子如蛋白质或脂质结合的小分子被捕获在供体井中。来自两个室的样品的定量分析允许计算小分子或替代基质中每个小分子的未?...
肺坏死病灶和空洞肺结核感染的患者含有细菌是顽抗到药物治疗的亚群。这些结构的干酪性芯是用于在细胞外环境中携带这些持留尤其负责。抗细菌剂为这些远程位置的16有利分布被认为是肺结核药物疗效的重要决定因素。在此之前协议的验证,没有体外技术,可以预测干酪样病变的药物发现的化合物的分布可用。其结果是,在这些关键病灶药物分布的评价在很大程度上?...
没有竞争的经济利益。
我们要感谢强生公司,结核病联盟,阿斯利康Zeneca,Rib-X和Trius治疗公司分别提供床上苯胺,PA-824(pretomanid),AZD5847,radezolid和tedizolid。 Brendan Prideaux,Matthew Zimmerman,Stephen Juzwin,Emma Rey-Jurado,Nancy Ruel,Leyan Li和Danielle Weiner为MALDI分析,生物分析方法,干酪替代品的制备,化学合成和兔子白蛋白的分离提供了支持。这项工作是由比尔和梅林达·盖茨基金会资助的,拨款为OPP1044966和OPP1024050的V. Dartois,NIH Shared Instrumentation Grant S10OD018072,以及Bill和Melinda Gates基金会以及Wellcome Trust for A卓越中心的联合资助。将发展中世界疾病的潜在优化用于P.Wyatt。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
New Zealand White Rabbits | Covance | - | |
HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
THP-1 monocytic cell line | ATCC | ATCC TIB-202 | |
175 cm² TC-Treated Flask (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
RPMI 1640 media w/o glutamine | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
Hyclone L-glutamine, 200 mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
Oleic acid | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
Pierce RED Device Reusable Base Plate | Fisher Scientific | PI-89811 | |
Pierce RED Device Inserts, 50/box | Fisher Scientific | PI-89809 | |
Pierce RED insert removal tool | Fisher Scientific | 89812 | |
Adhesive plate seal | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco) | Life Technologies | 10010-049 | |
DMSO | Sigma | 472301 | |
Acetonitrile | Sigma | 34998 | |
Methanol | Sigma | 34860 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma | V4629 | |
Diclofenac sodium salt | Sigma | 93484 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
484R Cobalt 60 Irradiator | JL Shepard | 7810-484-1 | |
INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
Upright Light Microscope | Leica | DM1000 | |
Binary Liquid Chromatography system | Agilent | 1260 | Multi-compenent |
Mass spectrometer | AB Sciex | 4000 |
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