寡肽竞争测定磷酸化位点测定

摘要

肽竞争测定广泛用于各种分子和免疫学实验。本文描述了体外寡肽竞争激酶测定的详细方法和相关的验证程序，其可用于发现特定的磷酸化位点。

摘要

特定位点的蛋白质磷酸化决定了其与其他分子的构象和相互作用。因此，蛋白磷酸化影响细胞的生物功能和特征。目前，发现磷酸化位点最常见的方法是通过液相色谱/质谱（LC / MS）分析，快速而灵敏的方法。然而，相对不稳定的磷酸酯部分通常在分裂步骤期间从磷酸肽释放，其通常产生假阴性信号。在这种情况下，使用定点突变体的传统的体外激酶测定将更准确，但是该方法费时费力。因此，使用肽竞争的替代方法可能是有利的。已经建立了5'腺苷单磷酸激活蛋白激酶（AMPK）的共识识基序¹ ，并使用位置扫描肽库文库验证ay ² 。因此，可以通过肽竞争测定来预测和证实用于新基质的AMPK磷酸化位点。在本报告中，我们通过说明AMPK介导的核因子红系2相关因子2（Nrf2）磷酸化来描述体外寡肽竞争激酶测定的详细步骤和程序。为了认证磷酸化位点，我们使用位点特异性突变体进行了连续的体外激酶测定。总体上，肽竞争测定提供了筛选多个潜在磷酸化位点并鉴定磷酸化位点突变体验证位点的方法。

引言

特定残基处的蛋白磷酸化在广泛的细胞过程中起着重要的作用。因此，了解信号网络需要鉴定特异性磷酸化位点。此外，磷酸化位点决定了对蛋白质功能的影响，因为蛋白质内的各个结构域具有不同的结构和功能。核因子红因子2相关因子2（Nrf2）的活性是一种主要的抗氧化转录因子，通过不同位点的磷酸化双向调节。我们的研究集中在催化Nrf2磷酸化的激酶。 Nrf2对氧化性攻击的应激反应迅速发生，主要通过丝氨酸40的磷酸化并由蛋白激酶C（PKC）-δ介导，其激活Nrf2,3,4。相反，Fyn催化Nrf2在酪氨酸5处的抑制性磷酸化68用于活动的紧密控制⁵ 。

用于发现磷酸化位点的最常见方法是液相色谱/质谱（LC / MS）分析。可以通过这种方法生成快速高灵敏度的磷酸化位点作图数据;然而，它有几个技术限制，通常产生假阴性信号。 LC / MS分析中频繁发生序列覆盖不良。为了鉴定磷酸化位点，需要关于蛋白质最大氨基酸覆盖度的信息⁶ 。在消化步骤期间与几种蛋白酶的目的蛋白质的蛋白水解可能有助于改善序列覆盖。识别磷酸化残基的另一个障碍是丝氨酸和苏氨酸磷酸化肽^6,7经常观察到的磷酸的容易损失。不规则磷酸酯部分通常是在碎裂过程中从磷酸肽释放⁷ 。寻找磷酸化位点时的第二个选择是使用肽微阵列法。可以使用含有衍生自感兴趣的蛋白质的肽片段的微阵列芯片筛选激酶靶位点。然而，由于微阵列芯片的生产和检测的设备要求，肽微阵列方法被认为是耗时且昂贵的。

为了克服这些挑战， 体外寡肽竞争激酶测定可用于具有已知识别基序的蛋白激酶。如果确定了激酶的共识识基序，则可以预测候选底物的推定的磷酸化位点，并且可以验证位点的真实性。这个程序最有说服力的方法是显示在其中是preicte的突变蛋白中磷酸化的消除d残基被不可磷酸化的氨基酸（ 即丝氨酸或苏氨酸转化为丙氨酸，酪氨酸至苯丙氨酸）取代。然而，突变蛋白的生产和分离是耗时的。作为研究初期的替代方案，竞争性肽激酶测定是直接和方便的。在这里，我们描述了体外肽竞争测定和磷酸化位点验证的方案。

研究方案

安全

注意:本协议使用[γ- ³² P] -ATP评估AMPK的活性。磷32是放射性同位素，主要发射β辐射。由于β粒子的尺寸非常小，因此可以很容易地穿透衣服和皮肤。外部和内部暴露于β辐射可能对人体健康有害，包括引起皮肤灼伤和组织损伤。

1. 执行需要使用[γ- ³² P] -ATP的所有步骤，使用适当的保护，如丙烯酸屏蔽。
2. 确保所有人员配备电子个人剂量计（EPD），以监测所有程序中暴露于有害辐射的程度。
3. 只有经过适当的培训和监管批准才能处理开源辐射。
   注:在这里，所有的实验都是在首尔国立大学完成开源辐射使用培训后进行的呃和韩国政府的批准（nssc.go.kr/nssc/en）。
4. 根据当地法规处理放射性废物。
   注:遵循首尔国立大学环境保护与安全研究所的指示。以下是美国和欧洲国家的监管机构名单:美利坚合众国，美国核管理委员会（http://www.nrc.gov/）;英国健康与安全执行（HSE）（http://www.hse.gov.uk）;法国，自由诺基亚（https://www.asn.fr/）;和德国，联邦环境，自然保护，建筑和核安全部（BMU）（http://www.bmu.de）。

2. 体外竞争激酶测定

1. 竞争肽的构建
   1. 确定由AMPK磷酸化的共有基序。
      注意:AMPK识别共识基序，＃934; - [X，β] -XX-丝氨酸/苏氨酸-XXX-Φ。在共识序列中，Φ表示疏水氨基酸（ 即缬氨酸[V]，亮氨酸[L]，甲硫氨酸[M]和异亮氨酸[I]），β代表碱性氨基酸（ 即赖氨酸[K]，精氨酸[ R]和组氨酸[H]） ¹ 。
   2. 根据上述共识基序从目标序列中选择丝氨酸或苏氨酸残基。使用人Nrf2的三个假定位点（＃1，包括Ser153的148-157;包含Ser335的＃2，330-339;和包含Ser558的＃3，553-562） ⁸ 。
   3. 商业合成模拟推定位点的10位残基肽。获得合成的产物作为每种肽的纯度大于98％的冻干粉末。
   4. 使用激酶缓冲液溶解肽以达到71.667g / L的浓度。如果肽不溶于激酶缓冲液，则将其溶于20％DMSO。如果它是不溶性的，则模仿放置的肽可能延长现场可增加溶解度。

2. 体外竞争性AMPK激酶测定
   1. 如下制备5×激酶缓冲液:100mM HEPES，pH 7.4; 25mM MgCl ₂ ; 5mM EGTA; 5mM DTT; 125mMβ-甘油磷酸酯（丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂）; 5mM Na ₃ VO ₄ （酪氨酸磷酸酶抑制剂）; 0.5％（v / v）蛋白酶抑制剂鸡尾酒套装III，1mM冷ATP;和500μMAMP。
      注意:AMP是测试AMPK活性的激酶缓冲液的重要组成部分。缓冲液可用于测量丝氨酸/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶的活性。
   2. 在冰上解冻以下重组蛋白和合成肽:AMPK; Nrf2的;和寡肽＃1，＃2和＃3。
   3. 在冰上制备反应缓冲液:0.15μgAMPK，0.4μgNrf2（〜4pmol），0.43mg寡肽（〜300nmol）和6μL5×激酶缓冲液。一个用无菌蒸馏水（DW）将最终体积调节至30μL。
      注意:在制备反应缓冲液后添加[γ- ³² P] -ATP可能会降低由于激酶自磷酸化引起的放射性信号。
3. 运行反应物
   注意:以下所有过程必须使用丙烯酸屏蔽，机架或块，以及适当的个人防护设备进行保护。
   1. 在开始实验之前将加热块设置为30°C。
   2. 在冰上向反应管中加入1μL[γ- ³² P] -ATP（1μCi）。通过上下移动多次混合反应缓冲液。
      注意: ³² P的放射性半衰期约为14天⁹ 。通过考虑半衰期来调节体积（ 例如，从[γ- ³² P] -ATP生产一个月后，加入4μL[γ- ³² P]-ATP使1μCi）。
   3. 将加热块中的样品在30℃下孵育15-30分钟。在此步骤中，制备7.5％十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶。根据目标蛋白的大小调整凝胶的百分比。
   4. 通过加入3μL10×SDS样品缓冲液（10％（v / v）甘油，20％（w / v）SDS，15.42％（w / v）二硫苏糖醇，90％（v / v） M Tris-HCl（pH6.8）和0.02％（w / v）溴酚蓝）。通过上下移动多次混合反应缓冲液。
   5. 将样品在7.5％SDS-PAGE凝胶中在70V下运行20分钟，并在140V持续1小时。
      注意:凝胶末端的溴酚蓝线含有极高的放射性信号。建议在蓝色线下方移除凝胶，然后再进行下一步以减少背景信号。
   6. SDS-PAGE后，从施法者轻轻取出凝胶。将凝胶放在玻璃杯中ube为下一步。
   7. 用固定缓冲液固定凝胶20分钟（50％甲醇和10％冰醋酸）。
   8. 将凝胶轻轻移动到滤纸上，并用透明包装纸盖上。注意，在该步骤中，凝胶可能容易撕裂。用真空凝胶干燥器在80℃下干燥凝胶1小时。
4. 可视化
   1. 将凝胶暴露于荧光屏或X射线胶片过夜（通常约16小时）。
      注意:荧光屏在暴露于超亮的光线之后可以重复使用。当使用X光胶片时，将凝胶暴露两天。 X射线胶片具有比荧光屏更低的灵敏度。
   2. 用荧光成像仪扫描荧光屏。将图像导出为高分辨率TIFF或位图文件。
   3. 在可视化后，将凝胶移动到玻璃或塑料容器，以进行考马斯亮蓝（CBB）染色。
   4. 用DW洗涤凝胶。丢弃DW并染色e用染色试剂凝胶1小时。
   5. 弃去试剂并用DW将凝胶脱胶1小时或过夜。将凝胶放在透明塑料薄膜（或等同物）之间，用办公扫描仪进行扫描。

3.使用位点特异性突变体进行体外激酶测定

1. pGEX-Nrf2的定点诱变
   1. 诱变引物设计
      注意:设计适当的诱变引物对于诱变的成功结果至关重要。以下是设计诱变引物的一些考虑。创建一个由25到45个碱基组成的引物，在引物中间有所需的突变。引物应具有40-60％的GC含量，并终止于一个或多个G或C碱基。根据公式[T _m = 81.5 + 0.41（％GC） - （675 /碱基长度） - ％不匹配），确保引物的T _m等于78℃或更高。
      注意:净化引物，因为其纯度对突变效率很重要。有几个设计诱变引物的网站。
      1. 打开"定点诱变设计引物"的引物设计程序（http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp）。
      2. 粘贴人类Nrf2 DNA序列（访问号NM_006164.4）并选择"上传翻译"按钮。
      3. 从翻译的氨基酸序列中选择丝氨酸558残基，以更改为丙氨酸。使用诱变引物，将密码子替换为来自agc的丝氨酸至gcc，用于丙氨酸。
      4. 考虑引物长度，T _m和GC含量。
         注意:诱变引物最终设计为5'-ctactgaaaaaacaactc gcc accttatatctcgaag-3'。
   2. 使用聚合酶链反应（PCR）的突变链合成反应
      1. 在冰上准备PCR反应混合物:10×反应缓冲液，50ngpGEX-GST-Nrf2，125ng正向引物，125ng反向引物，1μLdNTP混合物（每个10mM），2.5U Pfu DNA聚合酶和无菌DW至50μL。
      2. 用以下循环程序运行pGEX-GST-Nrf2突变体链合成的PCR:95℃30秒的1个循环;在95℃30秒，55℃1分钟，68℃90秒循环18个循环;在68℃下1个循环5分钟。
         注意:根据质粒长度，循环参数可能会改变。
      3. 将其放在冰上2分钟，冷却反应物进行下一步骤。或者，将其储存在4°C过夜。
   3. Dpn I消化和突变质粒的选择
      1. 冷却后，向每个反应物中加入1μLDpn I限制酶（10U /μL）。通过移液彻底混合并离心1分钟。
      2. 在37℃下孵育2小时以消化亲本pGEX-GST-Nrf2双双链DNA。
      3. 在冰上轻轻融化DH5α超感受态细胞。
      4. 将50μL反应物加入到150μL预冷的DH5α超级感受态细胞中，并在冰上孵育至少30 min。
      5. 将管转移到预热至42℃的加热块，并将其放置90秒。将它们放在冰上2分钟。
      6. 向转化的DH5α细胞中加入预热的溶菌酵母（LB），并在37℃下以180rpm摇动孵育1小时。
      7. 将转化的细胞在LB-氨苄青霉素琼脂平板上铺展并在37℃下孵育过夜。
         注意:氨苄青霉素用于选择，因为质粒GEX-GST-Nrf2具有氨苄青霉素抗性标记。使用适当的抗生素，这取决于诱变质粒的抗性标记。
      8. 从板上挑取单个菌落，将其转移至5mL LB-氨苄青霉素中，并在37℃下以180rpm摇动孵育过夜。为了验证诱变序列，评估至少三个菌落。
      9. 使用DNA微量制备试剂盒提取DNA进行DNA序列分析;遵循制造商的协议。
      10. 使用自动DNA序列分析仪根据制造商的方案验证诱变DNA序列。使用至少200ng的DNA构建体来验证突变序列。
2. 重组GST-Nrf2蛋白的纯化
   1. 诱变GST-Nrf2融合蛋白在大肠杆菌中的表达
      1. 将诱变型pGEX-GST-Nrf2质粒转化到BL21细胞中。接种在含有氨苄青霉素（100μg/ mL）的25mL LB肉汤中的单个菌落，并在37℃下在旋转器上孵育过夜。
      2. 将培养的细胞接种在含有氨苄青霉素（100μg/ mL）的100mL含有1:100稀释比的LB肉汤中。
      3. 在37°C的温度下旋转或直到600nm处的吸光度达到约0.4-0.8（约4小时）。
      4. 向100 mL培养细胞中加入100μL1M IPTG，制备终浓度为1 mM IPTG。
      5. 将细胞在30℃下在旋转器上孵育6小时或过夜以进行蛋白质表达。
      6. 以5,000×g离心细胞20分钟，并用1mL细菌裂解缓冲液（25mM HEPES，5mM EDTA，2mM DTT，0.1％CHAPS，1μg/ mL胃酶抑素，0.5μg/ mL亮抑酶肽，和1mM PMSF）。
      7. 使用超声波均化器以最大功率输出的50％，以2秒间隔裂解细胞沉淀2分钟。
      8. 在4℃离心细胞12,000×g 15分钟并收集上清液。
   2. 重组GST-Nrf2蛋白的纯化
      1. 准备200μL的50％（v / v）谷胱甘肽 - 琼脂糖珠，并用1mL PBS（pH 7.3; 140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na ₂ 4和1.8mM KH ₂ PO ₄ ）。通过在500×g离心1分钟收集珠子。重复洗涤步骤三次。
      2. 将细胞裂解物加入到制备的200μL的50％（v / v）谷胱甘肽 - 琼脂糖珠中，并在4℃下在终端旋转器上孵育2小时。
      3. 通过在500×g离心1分钟收集与GST-Nrf2蛋白结合的谷胱甘肽 - 琼脂糖珠。用31 G针头的1 mL注射器取出上清液。
      4. 用1mL PBS洗涤珠子（pH7.3），如步骤1。
      5. 向与GST-Nrf2组合的谷胱甘肽 - 琼脂糖珠中加入500μL洗脱缓冲液（50mM Tris-HCl和10mM还原型谷胱甘肽，pH8.0）。在4℃下在终端旋转器上孵育30分钟。
      6. 以500×g离心1分钟并收集上清液。
      7. 再次加入洗脱缓冲液300μL，重复步骤3.2.2.5-3.2.2.6两次。
   3. 纯化的GST-Nrf2蛋白的确认
      1. 准备5μL样品，用0.5μg标准蛋白质BSA观察蛋白质数量。
      2. 将样品在7.5％SDS-PAGE凝胶中在70V下运行20分钟，然后在140V下运行60分钟。
      3. 用0.1％CBB染色溶液（0.1g CBB R250,40mL99％甲醇，10mL乙酸乙酸和50mL蒸馏H ₂ O）将凝胶染色2小时，脱色（​​30mL甲醇， 10mL冰醋酸和60mL蒸馏水H ₂ O）直到清楚显示条带。
      4. 将脱色凝胶放在滤纸上，盖上透明包装纸。用真空凝胶干燥器在80℃下干燥凝胶1小时。
      5. 通过体外 AMPK激酶测定的光密度测定法确定突变体GST-Nrf2蛋白的数量。
3. 体外 AMPK活性测定与位点特异性突变体
   不E:根据步骤2.2-2.4 进行体外 AMPK激酶测定，使用0.4μg纯化的野生型GST-Nrf2或没有肽抑制剂的GST-Nrf2-S558A突变体。遵循步骤1中描述的所有辐射安全准则。
   1. 用0.15μgAMPK，0.4μg突变体或野生型GST-Nrf2和6μL5激酶缓冲液在冰上制备反应缓冲液。用无菌DW填充30μL。
   2. 在冰上向反应管中加入1μL[γ- ³² P] -ATP（1μCi/μL）。通过上下移动多次混合反应缓冲液并离心。
   3. 将样品在30℃加热块中孵育30分钟。
   4. 加入3μL10×SDS样品缓冲液停止激酶反应。
   5. 在7.5V的SDS-PAGE凝胶中在70V下运行20分钟，然后在140V下运行1小时。
   6. 用固定缓冲液固定凝胶20分钟，将其移至滤纸上，并用透明膜覆盖凝胶包装
   7. 用真空凝胶干燥器在80℃下干燥凝胶1小时，然后将其过夜曝光至荧光屏或X射线胶片。
   8. 用磷光体成像仪扫描荧光屏，并根据步骤2.4将凝胶移动到可视化后的玻璃管进行CBB染色。

结果

图1和图2显示了先前报道的文献⁸中重复实验的结果。合成了三种模拟推定的AMPK靶位点（包括Ser153的＃1,148-157;包含Ser335的＃2，330-339;和包含Ser558的＃3，553-562）的10个残基寡肽，并将其用作在体外激酶测定。在寡肽＃3的存在下，AMPK对Nrf2的磷酸化作用大大降低（ 图1 ）。接下来，进...

讨论

作为评估由AMPK介导的预测的磷酸化位点的真实性的简单和方便的方法，在此我们描述了体外激酶测定法，其可用于使用竞争性肽发现特定磷酸化位点，并使用位点特异性突变体。从体外竞争性AMPK活性测定获得的代表性数据与使用位点定向突变蛋白的测定结果匹配，表明肽竞争测定是确定磷酸化位点的有用工具。该方法也用于鉴定由PKCδ磷酸化的特异性位点的研究，其在丝氨酸40

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	15630
MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	208337
EGTA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E3889
DTT	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	D9779
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G9422
Na3VO4	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	450243
Protease inhibitor cocktail	Calbiochem, Nottingham, UK	539134
ATP	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A2383
AMP	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A1752
AMPK	Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY	14-840
Nrf2 (WT)	Abnova, Taipei City, Taiwan	H00004780-P01
[γ-32P]-ATP	PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA	NEG502A
EZblue staining reagent	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G1041
Pfu turbo DNA polymerase	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	600250
dNTP mix	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	200415-51	Avoid multiple thaw and freezing cycle
DpnI	New England Biolabs, Ipswich, MA	R0176S
LB broth	Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands	L1704
Ampicillin	Affymetrix, Santa Clara, CA	11259
Agarose LE	iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea	32034
HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit	Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan	QDF100
Coomassie Brilliant Blue R-250	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	161-0400
Bovine Serum Albumin	Bovogen Biologicals, Victoria, Australia	BSA100
Glutathione Sepharose 4B	GE Healthcare, Marlborough, MA	17-0756-01
Acetic Acid glacial	Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea
Methyl alcohol	Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea	5558-4410
[header]
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare, Marlborough, MA	28-9558-09
SDS-PAGE kit	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	1658001FC
Vacuum pump	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	165-178
Gel dryer	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	165-1746
Dancing shaker	FINEPCR, Seoul, Korea	CR300	The machine is needed for washing step
PCR machine	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	T100
Incubator/shakers	N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea	NB-205L
Microcentrifuges	LABOGENE, Seoul, Korea	1730R
Chromatography columns	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	732-1010