反复臭氧暴露对小鼠慢性阻塞性肺疾病模型的产生

摘要

这项研究描述了一个新的慢性阻塞性肺疾病 (COPD) 动物模型的成功生成, 反复暴露小鼠到高浓度的臭氧。

摘要

慢性阻塞性肺疾病 (COPD) 的特点是持续气流限制和肺实质破坏。它在老龄人口中的发病率很高。目前常规的 COPD 治疗主要集中在症状修饰药物;因此, 迫切需要开发新的治疗方法。合格的慢性阻塞性肺病动物模型有助于确定基本的机制, 并可用于新的药物筛选。目前的 copd 模型, 如脂多糖 (LPS) 或猪胰弹性蛋白酶 (PPE) 诱导肺气肿模型, 产生 copd 样病变的肺部和呼吸道, 但没有其他类似的发病机制的人 copd。香烟烟雾 (CS) 诱导模型仍然是最流行的之一, 因为它不仅模拟 copd 样病变的呼吸系统, 但它也基于其中一个主要的危险物质, 导致 copd 的人。然而, CS 诱导模型的耗时和 labor-intensive 的方面极大地限制了它在新药筛选中的应用。在这项研究中, 我们成功地产生了一个新的 COPD 模型, 暴露小鼠到高水平的臭氧。该模型显示如下: 1) 减少了强迫呼气体积 25, 50, 75/强迫肺活量 (FEV₂₅/FVC, FEV₅₀/FVC, 和 FEV₇₅/FVC), 表明肺功能恶化;2) 肺肺泡肿大, 肺实质破坏;3) 减少疲劳时间和距离;和 4) 炎症增加。综合起来, 这些数据表明, 臭氧暴露模型是一种与人类相似的可靠动物模型, 因为臭氧过度曝光是 COPD 的病因之一。此外, 根据我们以前的工作, 它只花了 6-8 周, 创建一个 OE 模型, 而它需要 3-12 月, 以诱导卷烟烟雾模型, 表明 oe 模型可能是一个很好的选择 COPD 的研究。

引言

据估计, COPD, 包括肺气肿和慢性支气管炎, 可能是世界上的第三个主要死因在 2020年^1,2。在未来40年³中, 在40岁以上的人口中, COPD 的潜在发病率估计为12.7% 男性, 8.3% 为女性。目前尚无药物可逆转 COPD 患者的渐进性恶化⁴。可靠的 COPD 动物模型不仅要求对疾病的病理过程进行模拟, 而且需要较短的周期。目前的 COPD 模型, 包括 LPS 或 PPE 诱发的模型, 可以诱发肺气肿样症状^5,6。一个单一的管理或一个星期的挑战, LPS 或 PPE 的小鼠或大鼠结果在支气管肺泡灌洗液 (BALF) 的显着中性, 增加炎调解人 (例如, TNF-α和 IL-1β) 在 BALF 或血清, 产生肺实质破坏-扩大空气空间, 并限制气流^5,6,7,8,9,10。然而, LPS 或 PPE 不是人类慢性阻塞性肺病的原因, 因此不模仿病理过程¹¹。CS 诱导模型产生持续气流限制, 肺实质破坏, 并减少功能锻炼能力。但是, 传统的 CS 协议至少需要3月才能生成 COPD 模型^12,13,14,15。因此, 重要的是要产生一个新的, 更有效的动物模型, 满足这两个要求。

最近, 除了吸烟, 空气污染和职业暴露已成为更常见的原因 COPD^16,17,18。臭氧作为主要污染物之一 (虽然不是空气污染的主要成分), 可以直接与呼吸道发生反应, 损害儿童和青年成人的肺组织^{19,20,21 ,22,23,24,25}。臭氧, 以及其他刺激, 包括 LPS, PPE, 和 CS, 参与了严重的生化途径的肺氧化应激和 DNA 损伤, 并与启动和促进 COPD^26,27。另一个因素是, 一些 COPD 患者的症状在暴露于臭氧后恶化, 表明臭氧会扰乱肺部功能^18,28,29。因此, 我们产生了一个新的 COPD 模型, 反复暴露小鼠到高浓度的臭氧7周;这导致气流缺陷和肺部实质损伤类似于以前的调查^30,31,32。我们在本研究中推广了对雌性小鼠的 OE 协议, 并成功地再现了我们以前研究的雄性小鼠的肺气肿^30,31,32。由于 copd 死亡率在男性减少, 但在许多国家的妇女增加了³³, 需要对女性 copd 模型进行研究, 以探讨慢性阻塞性肺病患者的发病机制和治疗方法。OE 模型对所有性别的适用性进一步支持它作为 COPD 模型的使用。

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研究方案

注意: OE 模型已经生成并用于以前报告的研究 ^{30 、 31 、 32} 。所有动物实验均经上海交通大学机构动物护理与使用委员会 (IACUC) 批准.

1. 鼠标

1. 在受控温度 (20 和 #176; c) 和湿度 (40-60%) 的动物设施的单个通风笼中, 无病原体、7至9周老的雌性 balb/c/c 小鼠。提供12和 #160; h 光和 12 #160; 设备中的暗循环。提供食物和水 ad 随意 .

2。臭氧或空气暴露

1. 在密封丙烯酸 ( 如 有机玻璃) 框中生成带有电发生器的臭氧。用小风机吹出箱内的空气, 通过排气管连接在箱体内外。使用臭氧探针监测盒子中的臭氧浓度。等到臭氧浓度达到2.5 分之百万分之一 (ppm).
   注: 臭氧探头可自动开启或关闭臭氧发生器, 并可在 2.5 ppm 时保持盒内的臭氧水平.
2. 当臭氧水平达到 2.5 ppm 时, 将小鼠放入盒子中。把老鼠放在盒子里, 每次3小时, 让它们暴露在臭氧中.
   注: 该盒可在3小时内保持臭氧水平 2.5 ppm, 通过自动开关臭氧发生器打开或关闭和吹出的 CO ₂ , 这是由小鼠产生的方块.
3. 每周 (每3天) 给两次臭氧暴露 (每次接触持续3小时), 为期7周; 同时将控制小鼠暴露在同一时间内, 并同时进行.

3。微计算机断层扫描

1. 在7周结束时, 麻醉小鼠腹腔注射 pelltobarbitalum 孢 (1%、0.6-0.8 ml/100 g) 和 #160; 根据个别情况调整剂量以查看鼠标不响应脚趾捏. 和 #160; 监测和保持鼠标在一个稳定的呼吸频率;并确保在程序中不存在自愿的动作.
2. 将麻醉小鼠放置在微计算机断层扫描室 (#181; CT).
3. 校准和 #181; 使用标准协议和制造商和 #39 的说明进行 CT 检查。设置 X 射线管在50伏和电流在450和 #181; A.
   注: X 射线和探测器都围绕鼠标旋转.
4. 执行和 #181; CT 分析通过获得515投影, 有效像素大小为 0.092 mm, 一个切片的曝光时间为300毫秒, 切片厚度为 0.093 mm.
5. 使用软件重建肺部与获得的图像。通过分别设置-750 和-550 Hounsfield 单元的灰度最小值和最大值来调整灰度图像亮度.
   注: 该软件将自动计算肺实质的体积和 low-attenuation 区 (LAA) ^{34 , 35} 。
6. 通过将 LAA 体积除以肺总容积来计算 LAA (LAA%) 的百分比.

4. 平板电脑测试

1. 在跑步机上为小鼠提供10米/分钟的适应性测试. #160; 注意: 当程序进行时, 电总是关闭的. #160;
2. 管理对小鼠进行疲劳试验。
   1. 以10米/分钟的速度将鼠标预热到5分钟
   2. 将速度提高到15米/分钟, 10 分钟.
   3. 增加运动强度: 提高速度5米/分钟, 从20米/分钟开始, 每30分钟, 直到鼠标不能继续运行 ³⁶ .
3. 将总运行距离和运行时间分别记录为疲劳距离和疲劳时间.

5. 肺功能测量

1. 麻醉腹腔注射 pelltobarbitalum 孢 (1%、0.6-0.8 ml/100 g) 的小鼠, 根据个别情况调整剂量, 以查看鼠标是否不响应脚趾捏和 #160; 并等待, 直到老鼠保持自发性呼吸. #160; 监测和保持鼠标在一个稳定的呼吸频率;并确保在程序中不存在自愿的动作.
2. 小心地 tracheostomize 老鼠, 并将它们放在与计算机控制的呼吸机相连的身体体积中.
   注: 通风通过靠近气管导管的下部阀门进行控制。该装置提供了不同的半自动机动, 包括准静态压力容积的机动和快速流动量的机动.
3. 通过压力控制通气将平均呼吸频率设置为150呼吸/分钟到麻醉小鼠, 直到每一个呼吸循环都得到一个正常的呼吸模式和完全失效.
4. 使用体积中产生的负压力对设备执行准静态压力-容积机动.
5. 在准静态压力-容积回路内执行快速流动容积机动, 以记录 FVC 和 FEV。将肺部充气到 +30 厘米 h ₂ O, 然后立即将其连接至高度负压, 以强制执行有效期, 直到剩余体积在-30 厘米 h ₂ o. 记录 FEV 在第一25、50和75毫秒中的呼气 (FEV ₂₅ , 分别 FEV ₅₀ 和 FEV ₇₅ 。拒绝次优演习。对于每一个测试, 每个单一的鼠标, 进行至少三可接受的演习, 以获得一个可靠的平均所有数值参数.

6。BALF 集合

1. 使用 pelltobarbitalum 孢 (1%、1.8-2.4 ml/100 g) 和 #160 进行晚期麻醉; 根据个别情况调整剂量, 以观察鼠标不响应脚趾捏和失去呼吸), #160; 灌洗2毫升 PBS 通过一个1毫米口径的气管插管, 然后检索 BALF ¹⁰ .
2. 将检索到的灌洗等分, 并将其离心4和 #176; C 和 250 x g 为10分钟.
3. 收集上清液以便立即使用, 并将剩余物存储在-80 和 #176; C 或液氮.
4. 使用例计算单元总数.
5. 重在 PBS 中的细胞颗粒, 然后旋转 (1400 x g, 6 分钟) 250 和 #181; L 悬浮细胞在幻灯片上使用滑动微调离心机.
6. 根据制造商和 #39 的协议将赖特染色应用于幻灯片上的单元格.
7. 每只鼠标计数200单元格; 根据标准形态学, 在400X 放大倍数下, 将细胞识别为巨细胞或嗜中性白血球; 并计算它们的数量.

7。心脏血液取样

1. 通过心脏穿刺收集血液, 将其加载到1.5 毫升的管中, 并将其放在冰上30分钟.
2. 在 2000 x g 和4和 #176 上离心血样5分钟; C.
3. 将上清液 (血清) 转移到新管上, 并将其存储在-80 和 #176; C 或液氮.
4. 为 IL-1 和 #946、IL-10、TNF 和 #945 制备血清; 使用各自的 ELISA 试剂盒进行检测测试.

8。肺形态计量学分析

1. 从老鼠身上解剖肺部和气管。
   1. 在牺牲后立即将每个被安乐死的鼠标置于手术板上.
   2. 解剖阔和前气管肌肉, 以可视化和进入气管环.
   3. 打开胸腔。解剖肺部和气管, 但不要把心脏和肺部分开.
2. 通过 PE90 聚乙烯管将气管导管连接到含有4% 甲醛的注射器.
   警告: 甲醛是有毒的。戴上手套和安全眼镜, 并使用通风罩内的解决方案.
3. 用4% 甲醛 (10 滴, ~ 200 和 #181; L) 通过气管导管完全充气肺部。在通货膨胀完成后取出心脏.
4. 保持15和 #160 的肺部; ml 管包含10毫升的4% 甲醛, 至少4小时.
5. 将肺部嵌入石蜡中。通过石蜡切片和旋转切片获得5和 #181; m 段。在切片过程中, 暴露支气管树区内肺组织的最大表面积.
6. 用于形态分析, 在切片上进行苏木精和曙红 (H 和 #38; E) 染色.
7. 用明亮的场直立显微镜 (物镜, 20X; 曝光时间, 1.667 毫秒) 来图像剖面.
8. 有两名调查人员对治疗方案视而不见, 独立计算组织学部分。使用平均线性截距 (L _m ) 作为测量 inter-alveolar 间隔壁距离的参数。使用以下步骤确定 L _m :
   1. 打开 Photoshop 中各节的图像, 并在图像上绘制一个手提五550和 #181; m 和 #160; 长行.
   2. 计算网格线上的肺泡数.
   3. 通过将网格线的长度除以肺泡的数目来计算 L _m 。对于量化, 每只鼠标图像五节。获取每个部分的十图像 (每个字段一个图像) 并随机评估。在野外选择的过程中, 通过在前方或另一个方向移动一个磁场来避免气道和容器的电场.
      注: 数据显示为平均值和 #177; S.E.M。对 air-exposed 小鼠和臭氧暴露小鼠进行了 un-paired t 检验。每组三只动物被用来计算显著的差异。p 值的和 #60; 0.05 被认为是重要的.

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结果

每个组的3D µCT 图像的示例显示在图 1a中。臭氧暴露的小鼠的总肺容积明显较大 (图 1a 和 b) 和 LAA% (图 1c) 比 air-exposed 控制小鼠。六周的臭氧暴露后, 肺容积和 LAA% 保持升高^31,32。肺容积和 LAA% 的增加代表肺气肿的表型。肺肺...

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讨论

在这项研究中, 我们提出了一个可靠的方法来生成一个新的 COPD 模型。与其他模型 (即LPS 或 PPE 模型) 相比, 此 OE 模型重述 COPD 患者的病理过程。由于香烟烟雾是导致人患 copd 的主要危险物质⁴⁰, CS 模型仍然是最受欢迎的 copd 模型^41,42。然而, CS 模型需要 3-到12月的 r-和 #38;D 期新药。与 CS 模型相比, 目前的 OE 模型将生成周期缩短为6-...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mice	Slac Laboratory Animal,Shanghai, China	N/A	7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.
Individual ventilated cages	Suhang, Shanghai, China	Model Number: MU64S7	The cages were used for housing mice in the animal facility.
Sealing perspex-box	Suhang, Shanghai, China	N/A	The box was used  to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.
Electric generator	Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany	Model 500	The device was used for generating ozone.
Ozone probe	ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK	Ozone 300	The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.
Pelltobarbitalum natricum	Sigma, St. Louis, MO, USA	P3761	Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.
Micro-Computed Tomography	GE Healthcare, London, ON, Canada	RS0800639-0075	This device was used for acquiring images of the lung.
Micro-view 2.01 ABA software	GE Healthcare, London, ON, Canada	Micro-view 2.01	This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.
Treadmill machine	Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China	DSPT-208	This machine was usd for fatigue test.
Body plethysmograph	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Ventilator	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Slide spinner centrifuge	Denville Scientific, Holliston, MA, USA	C1183	It was used to spin BALF cells onto slides.
Wright Staining	Hanhong, Shanghai, China	RE04000054	It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.
Hemocytometer	Hausser Scientific, Horsham, PA, USA	4000	It was used to count cells.
IL-1β	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100704	They were used to test the respective factors in serum.
IL-10	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab46103	They were used to test the respective factors in serum.
TNF-α	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100747	They were used to test the respective factors in serum.
Paraformaldehyde	Sigma, St. Louis, MO, USA	P6148	The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.
Paraffin	Hualing, Shanghai, China	56#	It was used to embed the lung.
Rotary Microtome	Leica, Wetzlar,  Hesse, Germany	RM2255	It was used for sectioning the lung.
Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution	Solarbio, Beijing, China	G1120	H&E staining was done for morphometric analysis.
Upright bright field microscope	Olympus, Center Valley, PA, USA	CX41	It was used to image the H&E staining slides.
Adobe Photoshop 12	Adobe, San Jose, CA, USA	Adobe Photoshop 12	It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images.
GraphPad prism 5	Graphpad Software Inc., San Diego, CA	GraphPad prism 5	It was used for data analysis and production of figures.