利用胶囊对生物达标中病毒样品的阴性染色

摘要

该协议为负染色病毒样本提供了指导，可以很容易地用于BSL-2，-3或-4实验室。它包括使用创新的加工胶囊，其保护透射电子显微镜网格并且在生物达到的更湍流环境中为使用者提供更容易的处理。

摘要

透射电子显微镜（TEM）用于观察病毒和其他微生物病原体超微结构的纳米分辨率。大多数生物材料不含能够散射电子的致密元件以产生图像;因此，需要在样品周围放置稠密的重金属盐的负污渍。为了在TEM下观察悬浮液中的病毒，它们必须应用于涂覆有仅纳米厚的透明表面的小网格。由于其尺寸小巧易碎，这些网格难以处理，容易被气流移动。薄表面容易损坏，使样品难以或不可能成像。传染病毒必须在生物安全柜（BSC）中进行处理，有些需要生物化学实验室环境。生物安全水平（BSL）-3和-4中的染色病毒特别具有挑战性，因为这些环境更为动荡，技术人员需要to佩戴个人防护装备（PPE），降低灵活性。

在这项研究中，我们评估了一种新的装置，以帮助负染色的病毒生物获得。该设备是一种胶囊，可用作专用移液器吸头。一旦将网格装入胶囊中，用户只需将试剂吸入胶囊中，将病毒和污渍传递到封装的网格上，从而消除用户对网格的处理。虽然这种技术专门设计用于BSL-3或-4生物测定，但它可以通过实现病毒容易的阴性染色来缓解任何实验室环境中的样品制备。同样的方法也可用于制备纳米颗粒，大分子和类似标本的负染色TEM样品。

引言

透射电子显微镜（TEM）可以观察生物样本太小的形态和超微结构的有效工具与传统的光学显微镜^{1，2，3，4}中看到的。 TEM通过非常薄的样品射出电子，产生更高分辨率的图像，因为电子的波长比光短得多。弯曲或阻挡电子的样品的区域看起来很暗，而电子透明的区域看起来是白色的。

缺少电子致密物质使得病毒难以在TEM下观察，因为它们不能散射电子。阴性染色是用于通过TEM创建对比度和观察病毒的最常用方法。 Brenner和Horne在1959年提出了第一个负染色程序，基于Hall（1955）和Huxley（1957）观察到的实验当浸入电子密度物质⁵时，反向对比生物结构的外观。阴离子染色过程在过去半个世纪几乎没有改变。阴性染色涉及在TEM网格上简单地将重金属盐溶液施用于样品，以试图用致密材料包围病毒而不渗透病毒⁶ 。这产生了一个黑色的边框，并显示了颗粒的形状⁵ 。本研究使用两种阴性染色试剂，乙酸双氧铀（UA）和磷钨酸钾（PTA）。这两个污渍通常用于小的生物样品，如病毒，蛋白质复合物和纳米颗粒^7，8，9负染色。

常规的阴性染色技术是手动液滴阴性染色技术nique ⁷ 。该方法需要用镊子精确处理小而脆弱的TEM网格，以应用少量病毒样品，染色和漂洗。典型的制备方法包括将一滴样品悬浮液施加到膜涂布的TEM网格的表面上（ 图1A ）。在将样品连接到膜表面之后，漂洗网格以除去非粘附病毒，并且根据样品的类型用UA或PTA染色数秒至一分钟。通过将一块滤纸接触到网格的边缘，将过量的液体从网格中除去。

手动液滴方法要求每个格子单独制作。如果不小心处理，涂层的TEM网格容易被刺穿，弯曲或污染。处理多个样品可能导致跟踪网格的困难，并确保每个样品的染色一致。本手册染色程序更多d由于这些环境所需的个人防护装备（PPE），在生物安全水平（BSL）-3和-4生物实验室进行培训时很困难。 PPE是繁琐的，与常规实验室相比，生物环境的变化更为动荡。在BSL-3生物实验室工作的人员必须佩戴2双手套，并在生物安全柜（BSC）工作。这双手套可以降低触感，并限制电动机运动。保护用户并有助于防止样品污染的BSC的气流可导致样品和污渍太快地干燥，从而影响染色质量。 BSC中强烈的湍流气流也可以快速吹走不太牢固的电网。在BSL-4生物实验室中，还有其他安全要求。人员需要穿正压服，这进一步限制身体运动和清晰看见和操纵的能力网格。在BSL-4工作的技术人员还穿着至少2双手套，外套是厚厚的手套，大大降低了灵巧和触感。最后，用于处理TEM网格的镊子是锋利的，因此由于其穿刺手套的能力而对技术人员造成风险。使用含有网格的胶囊，镊子不是必需的，因此提供了一种安全的无镊子的替代方案，用于操纵生物体的网格。最后，胶囊还提供了在加工过程中储存网格的有效方式，锇蒸气去污和储存期间;从而保持网格的组织和安全免受损害。

在本报告中，我们介绍负染色TEM网格在生物防护实验室利用mPrep / g的胶囊，网格处理和染色^10，11，12基于胶囊的装置的新方法。胶囊accom改变两个TEM网格，最大限度地减少直接处理，并减少电网损坏的可能性。胶囊以与移液管尖端相同的方式直接附接到单通道或多通道移液管，允许将各种液体施加到包含在其中的网格上。这使得能够同时准备具有重复格栅的多个样品（ 图1B ）。用胶囊阴性染色，将病毒样品吸入胶囊中并保持10分钟，使病毒吸附在网格表面上。随后用去离子水（dI）洗涤带有吸附病毒的网格，并用UA或PTA染色数秒至1分钟。该方法使用与手动液滴法相同的方案步骤和试剂;不同之处在于，所有的工作都发生在胶囊内，没有物理处理网格。 （ 图1C ，1D ）。

本研究的目的是评估胶囊一种用于生物环境中病毒样品阴性染色的新方法。本研究还检测了由两种不同病毒灭活程序产生的TEM图像的质量:1）快速灭活，1％四氧化锇蒸气，2）用2％戊二醛灭活24小时。这些都是使用胶囊进行的。最后，我们评估了两种常用的阴性污染物UA和PTA，用于胶囊。 ¹³

研究方案

1.在使用病毒样本之前，在BSL-2环境中进行实验准备

1. 准备或购买Formvar和碳涂层的TEM铜网格，通常为200-400目。
2. 将涂层的TEM网格插入胶囊。
   1. 使用放大镜可以使此过程容易执行。一个或两个网格可以插入每个胶囊。如果需要，可以购买预装胶囊以消除此步骤。
3. 将带有TEM涂层网格的胶囊与其他用品和试剂一起转移到生物体内，其中病毒将被染色。

2.使用水性戊二醛和1％四氧化锇蒸气失活的生物达标中的阴性染色的胶囊方法

1. 在生物驯化BSC内，将40μL病毒悬浮液吸入附着在移液管上的胶囊。
   注意:移液器仍然连接到e胶囊，直到过程完成。病毒准备是根据我们以前的出版物¹⁴ 。
2. 将移液管放在其侧面10分钟，网格水平定向。这是为了促进病毒颗粒在涂层网格上的均匀分布。
3. 在Biocontainment BSC内的胶囊内灭活病毒。
   1. 拿起移液管并按压柱塞将病毒溶液分配到废物容器中。
   2. 将40μL2％戊二醛固定液吸入胶囊。
      注意:戊二醛是一种危险化学品，需要适当的保护。戊二醛可以在正常BSC中短暂使用，但延长的开放试剂需要在管道BSC或化学通风橱中工作。
   3. 将移液器放在其侧面20分钟。这是为了确保样品固定好。
   4. 推出固定剂并将40μL的dI水吸入胶囊中灰掉了固定剂。重复此洗涤步骤总共3次漂洗循环。
4. 吸入40μL的1％乙酸铀酰（UA）或1％磷酸钨酸（PTA）到胶囊中，并使其静置30秒。
   注意:基于病毒样本，染色时间可能在10秒至1分钟之间变化。
   注意:UA是α发射体，是一种累积的毒素。处理适当的保护。
5. 从移液管中取出胶囊，然后通过在网格保留在胶囊内的同时将一块滤纸接触网格边缘，来吸干网格。
6. 氧化锇蒸汽灭活程序。
   1. 将胶囊盖子打开放入含有浸泡在1％四氧化锇溶液中的滤纸的50mL离心管中。
      注意:四氧化锇在极低的蒸气压下毒性极大。必须在管道BSC或化学通风橱中使用。处理适当的保护。发布警告在工作区域的信息。
   2. 将50 mL离心管密封1 h，以使四氧化锇蒸气完全渗透。然后，随后对BSL-2 EM设施进行净化和转移出生物处理。
7. 从胶囊中取出EM网格。
   1. 在BSL-2 EM设备中，从离心管中取出胶囊并将其放在移液管上。
   2. 将40μL的dI水吸入胶囊中，并将水分配到废物容器中三次。
   3. 从移液器上取下胶囊，用滤纸吸干网格以接触网格边缘。
   4. 空气干燥后，存放电网用于随后的TEM成像。

3.用2％戊二醛生物达标灭活的胶囊方法，随后在BSL-2实验室中进行阴性染色

1. 病毒灭活程序。
   1. 在生物驯化BSC内，将病毒悬浮液与相同体积的4％戊二醛混合，达到终浓度为2％的戊二醛。
      注意:戊二醛是一种危险化学品，需要适当的保护。戊二醛可以在正常BSC中短暂使用，但延长的开放试剂需要在管道BSC或化学通风橱中工作。
   2. 在包装，去污和将其转移到BSL-2 EM设施之前，先将固定剂灭活至少24小时。
2. 在BSL-2 EM设备中，将病毒和固定剂混合物吸入胶囊，包含两个连接到移液管上的TEM网格。
3. 将移液器水平放置10分钟，网格水平定向。
   注意:这是为了促进病毒颗粒均匀分布到TEM网格上。
4. 拿起移液管并按压柱塞将病毒排出到废物容器。吸出40μL的dI水进入胶囊并将其排入废物容器中3次漂洗循环。
5. 将40μL的1％UA或1％PTA吸入胶囊中30 s。
   注意:基于病毒样本，染色时间从10秒变化到1分钟。
   注意:UA是α发射体，是一种累积的毒素。处理适当的保护。
6. 从移液器上取下胶囊，并通过将网格边缘接触到一张滤纸来吸干网格。空气干燥网格并存放它们用于随后的TEM成像。

结果

胶囊方法产生优质的阴性染色用于TEM成像:

首先，我们通过使用手动液滴法和用于阴性染色扎伊尔埃博拉病毒的胶囊方法来评估产生的图像的质量。伏博病毒属于Filoviridae家族，还有Marburg病毒。埃博拉病毒的直径通常为80至100纳米，长度可超过1000纳米。埃博病毒必须在BSL-4生物环境中处理。 图2...

讨论

负染是用于评估和筛选病毒，蛋白质复合物和纳米颗粒的有价值的TEM技术。通过手动将网格从试剂转移到阴性污渍，这些样品的液滴制备已经是半个多世纪以来的典型方案。这是一个简单的过程，但需要通过培训获得成功完成的专业知识。优秀的阴性染色仍被认为是最先进的技术，并且在许多TEM实验室中非常期望。胶囊方法相对于手动液滴方法具有几个明显的优点，特别是在生物实验室中。首先?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formvar/carbon coated TEM grids	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules	EMS	85010-01	box
mPrep/f couplers	EMS	85010-11	standard 16/Pk
glutaraldehdyde	EMS	16320	50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide	EMS	19190	4% aqueous solution
Uranyl Acetate	EMS	22400	powder
Potassium phosphotungstic acid	EMS	19500	powder
filter paper	Whatman	1450-090	size 50
Tranmission Electron Microscope	JEOL	JEM-1011	TEM