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摘要

在这里, 我们描述一个方法, 结合原位MHC 聚丙烯染色与免疫组化, 以确定的定位, 表型和数量的抗原特异性 T 细胞在组织。本协议用于确定抗原特异性 CD8 T 细胞相对于其他细胞类型和组织结构的空间和表型特征。

摘要

T 细胞对许多免疫过程至关重要, 包括检测和消除病毒感染的细胞, 预防自身免疫, 协助 B 细胞和血浆细胞产生抗体, 以及检测和消除癌细胞。流式细胞术分析抗原特异性 t 细胞 MHC-聚丙烯染色的进展, 改变了我们研究和理解 t 细胞免疫的能力。流式细胞仪在确定抗原特异性 t 细胞的数量和表型时非常有用, 但不能确定抗原特异性 t 细胞在组织中的其他细胞和结构的空间定位, 以及当前的分类技术提取流式细胞术所需的 T 细胞在非组织中的有效性有限。原位MHC-聚丙烯染色 (IST) 是一种技术的可视化 T 细胞是特定的抗原感兴趣的组织。结合免疫组化 (IHC), IST 可以确定抗原特异性 CD8 和 CD4 T 细胞在组织中的丰度、位置和表型。在这里, 我们描述一个协议, 以染色和列举抗原特异的 CD8 T 细胞, 与特定的表型位于特定的组织隔间。这些程序与我们在最近出版的李et al.中使用的相同, 标题是 "在卵泡中的猿猴免疫缺陷病毒产生细胞在体内被 CD8 的+细胞部分抑制."所描述的方法是广泛适用的, 因为它们可以用于本地化, 表型, 并量化基本上任何抗原特异性 CD8 T 细胞的 MHC 体是可用的, 在任何组织。

引言

T 细胞对许多免疫过程至关重要, 包括检测和消除病毒感染的细胞, 预防自身免疫, 协助 B 细胞和血浆细胞产生抗体, 以及检测和消除癌细胞。多肽/MHC I. 类抗原特异性 CD8 t 细胞聚丙烯染色的研究进展1和最近发展的 mhc 类 II 聚丙烯染色 CD4 t 细胞2流式细胞术彻底改变了我们的学习和理解能力T 细胞的免疫。流式细胞仪在确定抗原特异性 t 细胞的数量和表型时非常有用, 但不允许检测抗原特异性 t 细胞在组织中的其他细胞和结构的空间定位, 以及当前用于提取流式细胞术所需 T 细胞的分类技术在非组织中的有效性有限3。

我们和其他人已经开发的方法使用肽负载 MHC i 类和 II 类聚丙烯或 multimer 试剂染色抗原特异性 CD8 和 CD4 T 细胞在组织中4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. 这些 IST 方法可以确定组织中抗原特异的 CD8 和 CD4 T 细胞的位置、丰度和表型, 并提供一种方法来检测这些细胞与组织中其他细胞和结构的关系。我们的小组广泛使用 MHC I 聚丙烯染色研究人体免疫缺陷病毒 (HIV) 和猴免疫缺陷病毒 (SIV) 特定的 CD8 T 细胞的淋巴, 生殖器和直肠组织获得了解艾滋病毒和 SIV 免疫并识别成功接种策略的相关性14,15,16,17。此外, 我们还开发了一种技术, 结合 IST 与原位杂交 (一), 以本地化和量化病毒特异性 CD8 T 细胞和病毒感染的细胞在组织和确定的在体内effector-to-target 水平18,19。

在这里, 我们描述了一个协议使用多肽负载 MHC I 体染色抗原特异性 CD8 T 细胞在新鲜的组织切片, counterstain 组织使用 IHC, 并量化细胞与特定的表型在特定的组织舱室。这些过程与我们最近出版的李et al.所使用的程序相同, 在该出版物中, 我们确定了在猕猴慢性 siv 感染过程中, 在淋巴组织中的 siv 特异性 T 细胞的位置、丰度和表型,20。

在这个过程中, 新鲜的组织被切片和培养过夜与肽负载 MHC I 体共轭的荧光素硫氰酸盐分子 (FITC)。然后固定在甲醛。在修复组织后, 从 MHC 体的信号被放大使用兔抗 FITC 抗体和孵化与荧光标记兔 IgG 抗体, 进一步放大信号从绑定体。IHC 与 IST 结合用于抗原特异 T 细胞和周围细胞的特征。抗体, 承认表位在细胞表面或在胞外空间是包括在初级孵化与体。识别细胞内抗原表位的抗体需要在染色前渗透细胞壁。使用共聚焦显微镜对染色组织切片进行成像, 并使用共焦软件进行分析。标记细胞使用共聚焦显微镜软件或 ImageJ 进行量化。所述的协议可用于在任何有 MHC I 体的组织中基本上染色任何抗原特异的 CD8 T 细胞。

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研究方案

1. 1 天: 新鲜的组织切片和主要孵化

  1. 使用手术刀将新鲜的组织切成小 (大约0.5 厘米宽0.5 厘米高) 的碎片。分别将每个组织粘附到一个柱塞上, 并在 PBS 中嵌入 3-5 毫升的 4% low-melt 琼脂糖。用贴纸标记柱塞与组织信息。把它放在冰桶的冷冻柜里, 以固化.
  2. 打开切片并将剖面的粗细设置为200和 #181; m. 在切片上安装刀片式服务器, 并在切片浴缸中插入带有组织的柱塞.
  3. 用肝素 (pbs-H) 制备磷酸盐缓冲盐水, 加入100和 #181; 在 pbs 中添加 g/毫升或 18.7 U/毫升肝素以保存 RNA, 并允许下游潜在的应用。用 100-120 毫升的冷冻、无菌的 PBS 填充切片浴, 覆盖嵌入的组织。在浴缸中加入 PBS-H 冰块, 以保持 0-2 和 #176 的温度; c. 开始切片并将组织切成200和 #181; m 部分.
    注意: 重要的是保持在冰上的组织冷冻, 以减少细胞活动的组织内, 因为新鲜的组织更容易切片时, 它是冷。如果没有针对下游的计划, 则可以单独使用 PBS.
  4. 或者, 对于不切片的组织 (例如, 肠道和肺部), 使用手术刀或刀片将组织切成薄条, 尽可能接近200和 #181; m.
  5. 用实验样本信息对24个组织培养皿的盖子进行标记, 并将组织室放置在相应的井中。使用画笔将剖面转移到一个24井组织培养板的井中, 其中含有1毫升的冷却 PBS-H.
    注: 在开始染色前, 应先制作可重复使用的组织室。组织室可以使用14毫升聚丙烯圆底管和金属丝网。使用锋利的剃刀刀片削减底部的一个14毫升聚丙烯圆底的 snap 盖帽管。将金属丝网切割成一个圆, 以适应管子底部的孔。用本生燃烧器加热金属丝网圈, 直到 red-hot。将金属丝网圈迅速放下, 把管子推到网格上。检查金属丝网是否牢固地连接到管子的底部, 然后小心地用锋利的剃刀刀片在3毫升标记上切断管子的顶端。在每个组织室中放置多达3组织切片, 或每井组织多达 1 cm 2 。保持至少一个空井之间的不同的抗体组合, 以避免交叉污染.
  6. 在完成将所有切口部分转移到组织室后立即进行主聚丙烯和抗体染色。在任何时候保持1毫升的 PBS-H 的部分被淹没和冷冻.
  7. 在夜间用0.5 和 #181 孵育组织切片; FITC 共轭的、多肽负载的 MHC I 体在 PBS-H 中稀释, 2% 正常山羊血清 (NGS)。包括老鼠或其他 non-rabbit 抗体定向的细胞外表位的兴趣在这个孵化 ( 例如, 大鼠 anti-CD8 抗体稀释1:500 在 PBS H 与 2% NGS)。每井放置1毫升稀释的抗体.
    注: 在选择 CD8 抗体时应注意, 一些可以增强, 有些可以抑制 MHC 体对 T 细胞受体的束缚 4 , 21 。在这里描述的大鼠人 CD8 抗体是不稳定的, 有时会导致一些微弱的染色。这是用于三重标记, 因为它是唯一的 non-rabbit 和 non-mouse CD8 抗体测试, 染色恒河猴 CD8 T 细胞.
  8. 使用1毫升的溶液每井的主要抗体和所有后续孵化, 并执行这一和所有随后的孵化在4和 #176; C, 在一个摇摆平台上的板块.
    注: 组织应在会议厅自由浮动.

2。2天: 固定和二次孵化

  1. 在主孵化后, 用1毫升的冷冻 PBS 清洗两次, 每次洗涤20分钟。通过将组织腔转移到不同的24孔组织培养基中, 在相应的井中包含1毫升的冷冻 PBS H.
    注意: 在组织室间移动时, 要注意不要将内容从一个实验样品滴入另一种。对于所有随后的孵化和洗涤, 类似的转移组织室到一个干净的板包含适当的解决方案。在手术过程中, 一定要对组织室的各部分进行监测, 以确保这些部分不会粘在组织室的两侧。如果他们这样做, 把他们推回解决方案.
  2. 用1毫升新鲜 PBS-缓冲4% 甲醛在室温下2小时修复部分 (不要 over-fix)。用冷的 PBS 冲洗两次, 5 分钟
    警告: 甲醛有毒;穿戴适当的个人防护设备.
    注: 如果需要抗原提取和性检测细胞表位, 抗原可以通过煮沸的切片0.01 摩尔尿素后, 甲醛固定.
  3. 将剖面转换为含有0.01 摩尔尿素的24井培养皿, 并将这些板放在微波炉中。煮沸的部分三次, 约十年代每个, 总共三十年代.
    注意: 要非常小心, 煮沸的解决方案可以迫使部分出井。如果发生这种情况, 使用画笔将部分从组织室的两侧或从板的盖子推回到适当的组织室的底部.
  4. 在二次抗体孵化之前, permeabilize 并阻断组织切片, 将其孵化为含有 pbs-h、0.3% 洗涤剂 (pbs-T) 的阻断溶液和 2% NGS 在4和 #176 上的 1 H 的摇杆上; c. 执行随后的抗体孵化PBS-H-T/2%ngs.
  5. 对于次生孵育, 将组织室中的部分转移到含有家兔抗 FITC 抗体稀释1:10,000 的 PBS-H-T/2%ngs。夜间孵化.
  6. 在 PBS-H-T/2%ngs 中使用小鼠 anti-CD20 抗体稀释1:200 进行 counterstaining。对于这个选项, 如果需要的话, 检索表位, 渗透到细胞, 并在这种孵化之前阻止, 如上所述.

3。3天: 第三次孵化

  1. 在第二个孵育后, 在 PBS H 中以4和 #176 的三次清洗剖面; C 至少 20 min.
  2. 执行最后的孵化与适当的荧光标记抗体 ( 例如, 山羊兔共轭绿黄色, 山羊鼠共轭远红色染料, 和山羊 anti-mouse 共轭绿色染料抗体稀释 1:5, 000,1:5, 000, 和 1:2, 000, 分别在 PBS-H-T/2%ngs)。夜间孵化.
    注意: 在这一点上, 孵化可以延长多达三天, 如果需要。在这个 incu 中, 通过在锡箔纸上包裹盘子来保持部分免受光线的保护。bation 步和尔后, 作为轻解渴荧光.

4。4天: 安装节

  1. 在 PBS H 中将部分三次洗涤, 至少 20 min.
    注意: 如果计划在下游的 19 , 修复4% 甲醛中的部分, 1 小时, 以确保体和抗体到位, 然后清洗两次与 PBS h 的每节5分钟.
    警告: 甲醛有毒;穿戴适当的个人防护设备.
  2. 使用画笔将剖面转移到显微镜幻灯片。注意不要把纸巾戳得太多。每节涂上甘油/明胶, 含有4毫克/毫升的无食子酸丙酯或另一种载有荧光防腐剂的安装介质。盖上片.
  3. 将幻灯片存储在-20 和 #176 的 light-protected 幻灯片容器中; c. 冲洗组织培养皿, 用酒精除去盖子上的标签.
    注: 板可重复使用.

5。共焦显微镜图像的获取

  1. 使用共聚焦显微镜捕获高分辨率图像, 对每个荧光 ( 图 1A 和 B ) 采用适当的激光器和滤镜.
    注: 在本例中, 使用了共焦显微镜 (参见 材料表 )。图像收集使用 561 nm 激光在20% 功率为绿色的黄色标记特异性 t 细胞, 488 nm 激光在10% 功率为绿标记的 CD20-expressing B 细胞, 和 640 nm 激光器在15% 功率为远红色标签的 CD8 t 细胞。20X 目标和数字孔径0.8 被使用了.
  2. 在多个 800 x 800 像素字段的三通道中依次收集 z 系列3和 #181; m (或其他) 间隔。构造收集字段的蒙太奇 ( 图 1C -e )。根据相应幻灯片的信息命名每个蒙太奇图像, 并保存以进行分析.
  3. 使用各自的共聚焦显微镜分析和量化软件或使用 ImageJ 进行量化图像分析.

6。定量图像分析

注意: 可以使用共聚焦显微镜分析和量化软件或使用 ImageJ 软件来完成定量图像分析。在这里, ImageJ 被用作一个例子.

  1. 通过将其拖动到 ImageJ 窗口 ( 图 2A ) 来打开共焦蒙太奇.
    注: ImageJ 可以直接打开蒙太奇收集的许多不同的共焦显微镜。如果 ImageJ 无法直接打开蒙太奇, 则将选定的 z 扫描作为 TIFF 文件导出以将其打开.
  2. 复制所选的 z 扫描以进行分析 (#34; 图像和 #34;-#62; #34;D 重复和 #34;) ( 图 2B ).
  3. 拆分不同的通道 (#34; 图像和 #34;-和 #62; #34; 颜色和 #34;-和 #62; #34; 分割通道和 #34;) ( 图 2C ).
  4. 在相应的通道中绘制量化分析的 roi 以实现目标, 并通过按下和 #34 将其添加到 roi 管理器中; #34; 在键盘上。测量该区域.
    注: ImageJ 的 ROI 管理器显示了 #181 中的区域; m 2 ( 图 2D ).
  5. 调整要分析的通道的荧光亮度和对比度 (#34; 图像和 #34;-#62; #34; 调整和 #34;-#62; #34; 亮度/对比度和 #34;) ( 图 2E ).
  6. 拼合图像上的 roi (#34; roi 管理器和 #34; #62; #34; 拼合和 #34;) ( 图 2F ).
  7. 使用 and #34 量化图像中的正单元格; 多点和 #34; 工具 ( 图 2G ).

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结果

图 1显示了如何使用共聚焦显微镜收集共聚焦图像。图 2演示使用 ImageJ 进行定量图像分析。图 3和4显示了来自 SIV 感染的恒河猴的淋巴结组织的代表性图像, 体、CD8 抗体和 CD20 抗体染色, 并有助于证明 mhc-聚丙烯染色的特异性。图 3比较 mhc 类 i 体载有一个多肽从 SIV 相比, 从同一组?...

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讨论

IST 结合 IHC 提供了一个基本的工具, 以检测, 定性和量化抗原特异性 CD8 T 细胞在本机环境与其他细胞和组织结构的上下文。在这里, 我们描述了 IST 结合 IHC 的详细程序, 其次是定量图像分析, 以确定的位置, 丰度和表型的抗原特异性 CD8 T 细胞在淋巴结的恒河猴。类似的染色可以适用于人类, 老鼠, 或其他物种组织的 MHC I 体是可用的。此外, 肽 MHC 类 II 聚丙烯或 dextramer 染色可以使用相对相似的方法来?...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作得到了国家卫生研究院 (T32 DA007097、R01AI096966、andUM1AI26617) 的公共卫生服务补助金的支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
MHC-I monomerNIH tetramer core facilityMaterials for MHC-tetramer preparation
ExtrAvidin-FITCSigma-AldrichE2716Materials for MHC-tetramer preparation
Normal goat serumJackson Immunoresearch005-000-121
Low melt agarosePromegaV3121
HeparinSigma-AldrichSLBL6391V
Triton X-100Sigma-AldrichT-6878
UreaJ.T.Baker4204-05
Glycerol gelatinSigma-AldrichSLBH2672V
n-propyl gallateSigma-AldrichP3130
rat-a-h-CD8 (1:500)Acris0714Antibody unstable, use single use frozen aliquot
m-a-h-CD20 (1:500)NOVOCASTRA6026819
m-a-h-Ki67 (1:500)Vector6022201
goat-a-m-A488 (1:2,000)Jackson Immunoresearch124083
goat-a-rb-Cy3 (1:5,000)Jackson Immunoresearch106232
goat-a-rat-Cy5 (1:5,000)Jackson Immunoresearch118088
goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)Jackson Immunoresearch86579
Compresstome: VF-300 MicrotomePrecisionary Instruments, LLC1079
Quick Set Instant AdhesiveLoctite46551
24-well flat bottomed tissue culture platesFalcon353226
Microscope slideGlobe scienfitic Inc.#1321
Razor  bladeTed Pella, Inc121-6
Feather Disposable ScalpelFEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.No. 21
Round paintbrush #2PRINCETON ART & BRUSH CO.4350RCan trim as needed with razor
Confocal MicroscopeOlympusFV1000
FV10-ASW_Viewer4.0Olympus

参考文献

  1. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  2. Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).
  3. Steinert, E. M., et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
  4. Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
  5. Haanen, J. B., et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).
  6. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining using MHC class I tetramers. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
  7. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).
  8. Li, Y., et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology. 216, 947-960 (2011).
  9. Bischof, F., et al. Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers. J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).
  10. Massilamany, C., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS ONE. 9, e87519(2014).
  11. Massilamany, C., et al. In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers. J Vis Exp. (90), e51679(2014).
  12. Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues. PLoS ONE. 10 (6), e0128862(2015).
  13. Tjernlund, A., et al. In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques. Retrovirology. 7, 7-12 (2010).
  14. Connick, E., et al. CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue. J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).
  15. Hong, J. J., et al. Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium. PLoS ONE. 4 (1), e4131(2009).
  16. Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge. PLoS ONE. 8 (12), e81623(2013).
  17. Connick, E., et al. Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL. J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).
  18. Li, Q., et al. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2009).
  19. Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ. J Vis Exp. (30), e1561(2009).
  20. Li, S., et al. Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo. J Virol. 90, 11168-11180 (2016).
  21. Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
  22. Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response. Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).
  23. Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biol Proced Online. 17, (2015).
  24. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).

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