人视网膜解剖与 RPE-脉络膜的蛋白质组分析

摘要

人类视网膜由功能和分子的不同区域组成, 包括黄斑、黄斑和外周视网膜。在这里, 我们描述了一个方法使用穿孔活检和手工清除组织层从人眼解剖和收集这些不同的视网膜区域的蛋白质组分析。

摘要

人视网膜由感觉 neuroretina 和底层的视网膜色素上皮 (RPE) 组成, 它与血管脉络膜层紧密地复合。视网膜的不同区域是解剖学上和分子上的区别, 促进独特的功能和证明差异易感性的疾病。蛋白质组分析的每个区域和层可以提供重要的洞察力的分子过程中的许多疾病, 包括年龄相关的黄斑变性 (AMD), 糖尿病和青光眼。然而, 在进行定量蛋白质组分析之前, 视网膜区域和层的分离是必不可少的。在这里, 我们描述了解剖和收集的中心, 黄斑, 和周边视网膜区域和底层 RPE-脉络膜复合体的方法, 涉及区域穿孔活检和手工清除组织层从人眼。一维 SDS 页以及下游蛋白质组学分析, 如液相色谱-串联质谱 (LC-ms), 可用于识别每个解剖视网膜层的蛋白质, 揭示视网膜疾病的分子标志物。

引言

视网膜、RPE 和脉络膜是复杂的组织, 在蛋白质表达、生理功能和病理敏感性方面表现出重要的区域差异^1,2。例如, 与年龄相关的黄斑变性 (AMD)、视网膜色素变性和中央浆液性视网膜病变等疾病都表现出在凹、黄斑或视网膜周围的特征定位^{1,3, 4,6}。在这里, 我们提出了一个方法来演示如何独立取样的视网膜区域。该方法的总体目标是提供一个可靠的指南, 收集的组织样本从中心, 黄斑, 周边地区的人视网膜和 RPE-脉络膜的蛋白质组分析。这一技术的发展和应用的基本原理是, 通过对这些特定的视网膜区域的蛋白质组分析, 可以获得重要的分子洞察力, 这些区域的生理和病理功能。

这种方法有望揭示相关区域疾病敏感性的蛋白质组基础, 并有助于确定新的具体治疗目标。事实上, 蛋白质组学对玻璃体及其与视网膜相互作用的研究为健康和患病组织的分子组成和功能提供了重要的洞察力^{5,7,8,9,10,11,12,13}. 然而, 对不同的视网膜区域缺乏明确的比较蛋白质组分析。该技术将有助于支持这些急需的研究, 提供比其他方法的优势, 通过展示一个可靠的和可再生的组织收集方法。更重要的是, 该方法是非常容易获得的, 利用标准和现成的组织穿孔活检工具。我们的技术强调适当的收集和储存组织的蛋白质组处理, 使重要的考虑蛋白的稳定性和降解。因此, 这种方法是最适合的研究者考虑下游分子分析蛋白质的因素。

研究方案

这项研究是由爱荷华大学和 #39 的机构审查委员会批准的, 并遵循《赫尔辛基宣言》中所规定的原则.

1. 中心和黄斑活检穿孔

1. 打开和蝶形人眼, 如前一出版物所述, 它由4独立的组织瓣组成. ⁵
2. 开始时, butterflied 人眼放置在培养皿中, 将一个 4 mm 的穿孔活检工具放在凹窝上, 向下按压, 然后轻轻滚动, 直到在凹腹周围进行切口.
3. 接下来, 在黄斑的拱廊内, 通过居中并按下一个 8 mm 的皮肤穿孔活检工具, 在黑点周围产生切口, 施加柔和的压力和滚动。这将产生第二个外环的组织周围的第一.

2。外周视网膜活检穿孔

1. 使用 4 mm 的皮肤穿孔活检工具在外围视网膜上进行一系列击打, 就在拱廊外。在这里, 为每个象限襟翼做两拳.
   注: 在所有的拳打后, 眼睛将有两个同心拳在中心, 代表中央凹和黄斑, 两个拳在底部的每瓣-总计8拳在周边视网膜.

3。凹和黄斑活检收集

1. 当组织现在准备好收集, 收集所有组织活检在分开的离心管和冷冻使用液氮为下游处理。将所有样品存储在-80 和 #176; C 直到使用.
2. 使用弯曲的 0.12 Colibri 钳抓住视网膜凹的半透明组织的边缘。从底层视网膜色素上皮中收集、提升和分离中心组织.
3. 同样, 使用 0.12 Colibri 钳来抓住半透明的黄斑组织的外环。如果组织仍然连接到基础或相邻组织, 使用一副保罗·韦斯科特剪刀仔细修剪边缘, 捕获只是视网膜成分和解剖的任何视神经组织包括在冲床.

4。周边视网膜采集

1. 使用弯曲的 0.12 Colibri 钳将周围的视网膜组织瓣轻轻分开, 从底层的 RPE-脉络膜, 并在单个离心管中放置.
2. 在残留的玻璃体凝胶的情况下, 使用镊子解除和分离的凝胶尽可能多之前收集的视网膜组织。一旦视网膜被移除, 色素 RPE-脉络膜仍在下方.

5。中心和黄斑视网膜色素上皮集合

1. 使用 0.12 Colibri 钳来抓住暗 RPE-脉络膜组织的边缘, 位于所移除凹区的下方。仔细分离这个组织从巩膜和收集.
2. 使用同样的钳子, 抓住边缘的黑暗 RPE-脉络膜组织的基础上清除黄斑区。仔细地把这个组织从巩膜上分离出来, 抓住环周围不同点的边缘, 轻轻地拉。最终, RPE-脉络膜组织的环会脱落, 并可能被收集.
   注意: 相反手上的二次钳在去除视网膜色素上皮组织的过程中可以起到帮助作用。像视网膜组织, Wescott 剪刀可以用来帮助删除任何组织, 没有完全切割使用冲床工具.

6。外周视网膜 rpe-脉络膜集合

1. 使用 0.12 Colibri 钳将 RPE-脉络膜剥离到8外围冲头区域.
2. 如前所述, 将 RPE-脉络膜组织置于离心管中, 并使用液氮进行下游加工。将所有样品保持在-80 和 #176; C 直到使用.

7。剪刀解剖

注意: 如果穿孔活检刀片是钝的或穿孔活检工具不够用力, 可能不会有一个 clean-cut 周围的组织.

1. 在这些情况下, 尽可能地将组织拉离, 然后使用保罗·韦斯科特剪刀修剪和分离.

结果

视网膜和 RPE-脉络膜组织可以以各种方式进行处理, 以适应个人的调查。收集后, 研究员将拥有视网膜和 RPE-脉络膜组织从中心地区, 外黄斑和周边视网膜 (图 1) 的样本。具体来说, 中心区域冲床将包括凹, parafovea, 和少量的相邻 perifovea。黄斑冲头包括 perifoveal 区的其余部分以及邻近近周边区域的少量。最后, 对 mid-peripheral 和远外围区域进行了外围冲压?...

讨论

组织收集后, 样品处理和处理是至关重要的考虑因素¹⁴。液氮的保存优于化学固定, 因为后者可能导致蛋白质结构的破坏, 这可能会扭曲下游分析。此外, 液氮保存是首选的方法, 不涉及冻结样品。值得注意的是, 与0° c¹⁵相比, Ferrer et al.在4° c 或室温下保存的脑样品的蛋白质水平有显著差异。此外, 重要的是要小心, 当处理样品, 由于特定的化学和物理治疗前?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-34
8-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-37
0.12 Colibri Forceps	Stephens Instruments	S5-1145
Wescott Scissors	Sklar Surgical Instruments	64-3146
Microfuge tubes	Eppendorf	#022364111	1.5 mL
Liquid Nitrogen	Praxair, Inc.	7727-37-9 [R]