细胞侵袭和迁移过程的评价: 视频 Microscope-based 刮伤法与博伊登室法的比较

摘要

本研究报告了两种不同的细胞浸润和迁移分析方法: 博伊登室法和体外视频 microscope-based 伤口愈合试验。对这两种实验的协议进行了描述, 并对它们的优缺点进行了比较。

摘要

肿瘤细胞的侵袭和迁移能力是癌症进展和复发的主要因素。许多研究探索了迁移和入侵的能力, 以了解癌症细胞传播, 目的是制定新的治疗策略。分析这些能力的细胞和分子基础, 导致细胞的移动性和理化性质的骨架和细胞微环境的表征。多年来, 博伊登室法和刮伤法是研究细胞侵袭和迁移的标准技术。然而, 这两种技术有局限性。博伊登室法检测困难, 费时, 刮伤法重现性低。现代技术的发展, 特别是在显微镜下, 增加了刮伤试验的重现性。利用强大的分析系统, "孵化器" 的视频显微镜可以提供自动和 real-time 的细胞迁移和入侵分析。本论文的目的是报告和比较两种方法用于研究细胞侵袭和迁移: 博伊登室法和优化的体外视频 microscope-based 刮伤法。

引言

细胞侵袭和迁移参与癌细胞的传播, 这是抵抗治疗的主要原因¹ , 并可导致癌症治疗后的局部或转移复发²。上皮-间充质过渡 (急诊) 是细胞浸润-移行的初始过程, 癌细胞从上皮细胞转变为间质表型。e-钙黏蛋白是上皮表型的胞外标记物³, 增加的 n-钙黏蛋白和波形的表达是骨髓间质表型的特征⁴。迁移还取决于癌细胞的内在能力, 通过矩阵蛋白酶⁵的作用侵入细胞外基质 (ECM)。

这种 invasion–migration 机制已经被描述为癌症在许多地方, 特别是头颈部癌症⁶。许多研究人员把重点放在迁移和入侵过程上, 以便更好地理解癌细胞的传播, 希望这些知识能导致新的治疗策略。这是至关重要的, 这些研究是使用可靠和重现性的化验。

体外对细胞运动的分析可能具有挑战性。多年前, 博伊登室检测被认为是 invasion–migration 分析的标准⁷。然而, 它是费时, 往往是不准确的。第二个测试是伤口愈合试验⁸, 它涉及在细胞单层培养上进行划痕, 并在固定时间间隔捕获细胞入侵和迁移的图像。由于连续两次试验的结果相差很大, 这一技术受到了广泛的批评。然而, 现代技术的应用, 特别是在显微镜下, 提高了刮伤试验的重现性。视频显微镜可以很容易地在孵化器中引入, 并能产生细胞迁移的 real-time 图像。这些装置记录了显微镜数据, 并提供了一段时间内缠绕细胞汇流的自动分析。本文的目的是描述博伊登室法和优化的刮伤法, 并讨论每种方法的优缺点。

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研究方案

注: 不含 ecm 的博伊登室和划痕分析被称为迁移试验, 与 ecm 相同的化验被称为入侵检测。

1. 博伊登室试验

注: 本协议适用于 SQ20B 细胞系, 这是从复发头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 喉癌, 并获得从约翰小 (波士顿, 马萨诸塞州, 美国)。

1天

1. 细胞播种
   1. 种子 2 10⁶ SQ20B 细胞在12毫升培养基中 (cm) 在175厘米²烧瓶中72小时前一天, 允许细胞生长到80% 细胞汇合。
      1. 为 SQ20B 细胞准备 CM, 补充 Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM) 与10% 胎小牛血清 (FCS), 0.04 毫克/毫升氢化可的松, 100 U/毫升青霉素, 和0.1 克/L 链霉素。
   2. 在层流罩下, 处理细胞。取出培养基, 用无菌磷酸缓冲盐 (PBS) 冲洗细胞, 并加入2.5 毫升的胰蛋白酶乙酸酸 (EDTA) (0.5 克/升)。孵育细胞5分钟在37° c, 然后停止反应, 增加12.5 毫升的 CM 温暖到37° c。使用单元格计数器计数单元格数。
   3. 在 25 cm²烧瓶中的单元格中, 对每个要计算的条件的单元密度为 6 10⁵单元格进行种子。在3毫升的 CM 中孵育24小时的细胞。

2天

2. 细胞饥饿与包衣室的制备
   1. 用0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 代替 FBS, 用3毫升的 low-fetal 牛血清 (FBS) 培养基取代每个烧瓶中的培养基, 使细胞挨饿。在孵卵器中将细胞饿死24小时。
      1. 准备饥饿 cm (s cm), 补充 DMEM 与 0.1% BSA, 0.04 毫克/毫升氢化可的松, 100 U/毫升青霉素和0.1 克/L 链霉素。
   2. 对于迁移化验, 请转到步骤1.3。
   3. 为入侵试验, 12 小时在3天之前, 准备涂层的博伊登室通过增加500μ l CM 对每个被涂的房间。使用商业准备的涂层博伊登室, 并保持在4° c 使用前。将每个博伊登室放在伴板中, 并在37° c 过夜将其放在孵化器中。

3天

3. 博伊登室的细胞播种
   1. 使用伴板来制备趋化因子。用 10% FBS、0.04 毫克/毫升的氢化可的松、100毫升青霉素和0.1 克/l 链霉素, 填充24井伴侣板的750μ l 的完整培养基。
      1. 适应每个细胞线和每个治疗条件的趋化因子。制备趋化蛋白 cm (ca cm), 补充 DMEM 与 10% FCS, 0.4 毫克/毫升的可的松, 100 U/毫升青霉素, 0.1 克/L 链霉素。
   2. 将上部腔室转换为预伴板, 注意避免气泡。
   3. 为入侵化验, 小心地从每个博伊登室去除450μ l CM。
   4. 在层流罩下, 处理细胞。取出培养基, 用无菌 PBS 清洗细胞, 加入0.5 毫升的胰蛋白酶 (0.5 克/升), 然后在37° c 下孵育5分钟的细胞。通过增加 CM 加热到37° c 停止反应。使用单元格计数器计数单元格数。
   5. 种子 3 10⁴ SQ20B 细胞在500μ l 0.1% BSA 培养基中, 最后稀释 6 10⁴细胞/毫升。
      注意: 细胞浓度应适应每个细胞系。
   6. 将板放入孵化箱中, 在37° c 为24小时。

4天

4. 细胞固定和染色
   1. 在特定于该单元格线的加倍时间之前修复单元格。在24小时前修复 SQ20B 细胞。
   2. 从辅助板上取下每个插入物, 用棉签小心地从上部腔中取出细胞。这是特别重要的是要删除所有的细胞位于上腔。
   3. 使用所提供的染色套件分别修复和着色每个插入, 以获得可格伦瓦德姬姆萨着色⁹ 。另外, 使用4% 甲醛在另一个同伴板块中进行30分钟的固定。
   4. 将插入物放在一个空的24井伴侣板下, 在实验室罩下晾干每个腔室。

5天

5. 显微分析
   1. 在20相衬显微镜上插入伴板与插入物, 并计算膜下部的每个迁移细胞。通过将目标从底部移到顶部来优化右焦点位置, 并停止膜底部的位置。
   2. 计算迁移细胞数与种子细胞的比值。重复每个治疗条件的每三个计数。

2. 刮伤试验: 细胞迁移

注意: 指令必须适应每种类型的单元格。

1天

1. 细胞播种
   1. 种子 2 x 10⁶ SQ20B 细胞在12毫升厘米在175厘米²烧瓶72小时前一天, 并允许细胞生长到80% 细胞汇合。
   2. 在层流罩下, 处理细胞。取出培养基, 用无菌 PBS 洗涤细胞, 加入2.5 毫升的胰蛋白酶 EDTA (0.5 克/升), 并在37° c 下孵育5分钟的细胞。停止反应, 增加12.5 毫升的 CM 加热到37° c。使用单元格计数器计数单元格数。
   3. 在 4 x 10⁵/mL 的单元格密度下生成一个小修样本, 在每个井中给出每10μ l 的 4 4¹⁰⁰单元格的最终密度。此浓度必须适应每个单元格线, 并且应在 1 x 10⁴到 6 10⁴单元格的范围内。
   4. 通过沉积100μ l 在步骤2.1.2 中制备的溶液, 将种子细胞放入96井板的每一个井中。
   5. 将板材置于室温下5分钟, 将细胞均匀地分散在井底。
   6. 将板放入孵化箱中, 并允许电池在37° c 时附着在12至 16 h (最大) 的板上。

2天

2. 刮伤试验
   1. 从孵化器中取出步骤2.1 中准备的盘子。
   2. 在引擎盖下, 根据制造商的协议, 用商业伤人装置制造伤口。
   3. 立即从每个井中取出介质, 使用一个适应锥尖端的吸管, 注意不要碰到伤口。
   4. 两次洗涤细胞通过重复的愿望和使用100μ l CM 温暖到37° c 每井。
   5. 在洗涤步骤后, 用吸管与一个适应的锥形尖端移除 CM。
   6. 每一个良好的治疗条件, 添加100μ l 介质。
   7. 尽量避免在油井中产生气泡。反向移技术在这里可能会有所帮助。或者, 用注射器针除去气泡。
   8. 把盘子放到视频显微镜的改装架上。
   9. 为了提高图像质量, 允许板在第一次扫描前至少预热15分钟, 以避免板的下侧凝结。
   10. 计划扫描的时间表, 使用视频显微镜软件在一个图像每井。入侵迁移试验需要最大2小时间隔。如果实验的目的是制作一个视频, 一个间隔30分钟的最大值是首选。
   11. 在实验结束时, 仔细清洗伤人装置, 并按照制造商指示的四洗涤步骤进行操作。

天 3, 4, 和5

3. 利用视频显微镜进行偏移分析
   1. 至少24小时和5天, 监测和检查细胞迁移。
   2. 使用适合每个单元格类型的适当的单元掩码来分析单元格迁移。若要获取适合于每个单元格线的单元掩码, 请使用特定的单元格图像集合从软件生成单元格处理定义。
   3. 跟踪曲线并将数据导出到电子表格, 可用于分析和比较结果。

3. 刮伤试验: 细胞侵袭

注意: 指令必须适应每种类型的单元格。

1天

1. 细胞播种
   1. 如步骤2.1 所述, 对单元播种使用相同的协议。

2天

2. 准备 ECM
   1. 在4° c 使用前, 将基体解冻至少12小时。确保没有可见的聚合。如果聚集体是可见的, 保持矩阵在4° c 较长的时期, 直到聚合体消失。把母体放在冰上使用冷吸管提示。
      注: 如果不保持在4° c, 基体将凝固。
   2. 在冰上冷却离心管5分钟。
   3. 采取 CM 冷却到4° c 从冰箱和稀释基体在冷离心管子获得最后的集中300微克/毫升。
   4. 返回离心管与小修矩阵到冰箱在4° c。
      注: 适用于离心管的冷却机架有助于在整个实验中保持4° c 的管子。

2天

3. ECM 的伤伤分析及处理
   1. 从孵化器中取出步骤3.1 中准备的盘子。
   2. 在引擎盖下, 根据制造商的协议使伤口使用商业伤人装置。
   3. 立即从每个井中取出介质, 使用吸管与适应的锥形尖端, 注意不要触摸伤口。
   4. 通过重复吸入程序和使用100μ l 的 CM 加热到37° c, 清洗两次细胞。
   5. 第二次洗涤后, 将板放在4° c 恒温箱上, 平衡其温度为5分钟。
   6. 取出每个井中的冷媒, 用锥形尖端吸管, 小心地从边缘移开吸管, 避免碰到伤口。
   7. 在4° c 的情况下使用冷锥尖, 将50μ l 的小修矩阵添加到每个井中。
   8. 把盘子放在37° c 的孵卵器里30分钟。
      注:37 ° c 的 prewarmed 支撑架有助于加速96井板的升温。
   9. 从孵化箱中取出盘子, 并在每种治疗条件下加100μ l 的适应 CM。
   10. 尽量避免在油井中产生气泡。反向移技术在这里可能会有所帮助。或者, 用注射器针除去气泡。
   11. 在视频显微镜下把盘子放到适应的货架上。
   12. 为了提高图像质量, 允许板在第一次扫描前至少预热15分钟, 以避免板的下侧凝结。
   13. 计划扫描的时间表, 使用视频显微镜软件在一个图像每井, 在划伤扫描模式。入侵迁移试验所需的最大2小时间隔。如果实验的目的是制作一个视频, 一个间隔30分钟的最大值是首选。
   14. 在实验结束时, 仔细清洗伤人装置, 并按照制造商指示的四洗涤步骤进行操作。

天 3, 4, 和5

4. 利用视频显微镜对细胞浸润进行分析。
   1. 重复步骤2.3。

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结果

我们在这里报告两种不同的方法来分析细胞入侵和迁移。图 1显示了博伊登室实验。插入物被放置在具有趋化介质的伴板中, 细胞在 CM 中播种。该膜可以被涂覆 (迁移化验) 或涂层 (入侵检测)。细胞在 s CM 中被播种入上部房间。下部腔内填充 CM 作为趋化因子。细胞在加倍的时间之前被固定。

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讨论

我们在这里报告两种不同的模式来研究细胞入侵和迁移过程。对这一过程的分析对于了解转移复发的因素是很重要的, 这可能是由于癌细胞亚群的增加运动而解释为肿瘤干细胞^10,11。

博伊登室实验是研究细胞侵袭和迁移的最常用技术之一。这种方法的一个优点是它的重现性, 虽然这项技术是高度依赖于实验者的专长。细胞计数是手动...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Calf Serum Gold	GE Healthcare	A15-151
Hydrocortisone water soluble	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
Penicillin/Streptomycin 100 X	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	The solution must be prepared just before use because it is very unstable
Z1 coulter particle	Beckman Coulter	6605698
Optical microscope	Olympus	CKX31
SQ20B cell line	Gift from the John Little’s Laboratory	-
Wound Maker	Essen Bioscience	4494	Store in safe and dry place
96-well ImageLock Plate	Essen Bioscience	4379
CoolBox 96F System with CoolSink 96F	Essen Bioscience	1500-0078-A00
CoolBox with M30 System	Essen Bioscience	1500-0078-A00
Boyden Insert	Dominique Dutcher	353097
Boyden Coated Insert	Dominique Dutcher	354483	Store at -20 °C
Companion 24-well Plate	Dominique Dutcher	353504
BD Matrigel standard	BD BioScience	BD 354234	Store at -20°C.
RAL 555 Staining Kit	RAL Diagnostics	361550	Store in safe and dry place
Microcentrifuge tubes	Eppendorf	33511