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摘要

这项研究实施了全基因组测序分析的基因突变, 赋予抗真菌药物耐药性的念珠菌光滑。对棘、唑和 5-嘧啶的耐光滑的菌株进行了测序, 以说明方法。分离株的敏感性分布与基因特异性突变模式的存在或缺失相关。

摘要

光滑念珠菌可以快速获得导致耐药性的突变, 特别是对唑和棘。基因突变的识别是必不可少的, 因为检测到的电阻体外往往与临床失败相关。我们研究了使用全基因组测序 (WGS) 进行基因组分析抗真菌药物耐药性的可行性, 在C. 光滑中。目的是 torecognize 执行 WGS 的推动因素和障碍, 并衡量其有效性。本文概述了关键的质量控制检查点和 WGS 方法的基本组成部分, 以研究与降低抗真菌药易感性相关的遗传标记。它还估计了数据分析的准确性和测试的转过来时间。

通过抗真菌药敏试验测定了12例临床和一 ATCC光滑的表型敏感性。其中包括三个隔离对, 来自三患者, 在药物最小抑制浓度上升。在两对, 每对的第二个隔离开发了抵抗对棘。第三对的第二个分离开发了抵抗对 5-嘧啶。其余组成的易感性和唑耐药菌株。在抗棘、唑和 5-嘧啶抗性的基因中, 单核苷酸多态 (snp) 通过 WGS 的下一代测序, 在耐药菌株中得到证实。识别抗 真菌抗性基因的非同义 snp, 如FKS1、 FKS2、 CgPDR1、CgCDR1和FCY2 。总的来说, 平均98% 的 WGS 读取的C. 光滑孤立映射到参考基因组, 大约有75倍的读深度覆盖率。周转时间和费用与桑格测序相媲美。

总之, 在不需要多重 PCR/DNA 测序反应的情况下, WGS 的C. 光滑是可行的, 可以揭示抗性不同抗真菌药物类的临床重要基因突变。这是一个积极的步骤, 建立 WGS 能力的临床实验室, 同时检测抗真菌耐药性授予替代品。

引言

念珠菌光滑是一种日益受到重视的病原体, 其重要性作为一个物种, 它对唑以及最近的棘1、2、3进行了抵抗。不同于二倍体的c. 白念珠菌,光滑的单倍体基因组可能允许它获得突变和更容易地发展多重耐药性。两个药物类的共同抵抗也被报告了4。因此, 早期评估的抗真菌药敏性和检测耐药性在C. 光滑是至关重要的正确的, 有针对性的治疗, 以及在抗真菌的情况下, 以限制驱动器的抗菌素耐药性1,5,6. 建立一个有效的工作流程, 快速检测耐药菌株中的抗性生物标志物的验证性突变, 也有助于改善处方决定和临床结局。

抗真菌药易感性通常通过测量最小的抑制浓度 (MIC) 来评估, 这被定义为最低的药物浓度, 从而导致微生物的生长与无药物的生长相比显著降低。控制.临床和实验室标准研究所 (CLSI) 和欧洲抗菌药易感性检测委员会 (EUCAST) 有标准化的易感性测试方法, 以使 MIC 测定更准确和一致的7, 8。然而, 抗真菌 MIC 的效用仍然有限, 特别是对棘, 特别是在实验室比较, 在不同的方法和条件使用9。也有不确定的相关的中等收入与反应的棘治疗和无法区分重量 (或易感) 菌株与那些窝藏 FKS 突变 (棘耐药菌株)10,11。尽管有验证性基因 PCRs 和桑格测序的抗真菌抵抗标志, 结果的实现往往延迟, 由于缺乏同时检测多电阻标记5,12。因此, 在整个基因组 sequencing-based 分析的支持下, 同时检测基因组不同位置的抗性突变, 比目前的方法具有明显的优势。

整个基因组测序 (WGS) 已成功地实施, 以跟踪疾病传播在爆发期间, 以及在细菌和病毒的基因组范围内的风险评估和耐药性测试的方法13。核酸测序技术的最新进展使病原体的全基因组测序 (WGS) 在技术上和经济上都是可行的。DNA 测序提供了重要的优势比其他方法的病原体鉴定和定性在微生物学实验室使用14,15,16。首先, 它提供了一个具有高吞吐量、速度和质量的通用解决方案。测序可以应用于任何微生物, 并允许在地方或区域实验室的规模经济。其次, 它以 "经得起未来考验" 的方式生产数据, 可以在国家和国际两级进行比较。最后, WGS 在医学中的潜在效用已经通过包含参考基因组的公共数据库的快速增长而得到了增强, 这可以与包含其他临床和流行病学元数据的等效数据库相链接17 ,18。

最近的研究表明, WGS 用于鉴定临床分离的念珠菌的抗真菌性标志物的效用。10,19,20. 这主要是由于高通量台式器的可用性, 建立了生物信息学管道, 降低了测序的成本21,22。真菌 WGS 对桑格测序的优势在于, WGS 允许在一次运行中对多个基因组进行测序。此外, WGS 的念珠菌基因组可以识别药物靶点的新突变, 跟踪遗传进化, 以及临床相关序列类型的出现20,22,23。最重要的是, 在固有的多药耐药性的情况下, WGS 可以帮助及早发现治疗选择前的抗性突变22,24。

在这里, 我们研究了 WGS 的可行性筛选的突变相关的耐药性不同类别的抗真菌药物。我们提出了从 end-user 和诊断真菌实验室角度实施 WGS 的方法。我们在这项分析中包括三分离对培养从三独立的临床病例, 其中体外抗棘和 5-嘧啶在经过一段时间的抗真菌治疗后发展。

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研究方案

这项研究不需要道德上的认可。

1.光滑念珠菌的亚文化和接种制备

  1. 选择要研究的c. 光滑隔离的面板, 其中还应包括至少一个c. 光滑美式类型区域性集合 (ATCC), 并具有已知的敏感度模式。
  2. 亚文化, 通过触摸一个单一的殖民地使用无菌一次性塑料循环和裸奔到一个 Sabouraud 的葡萄糖琼脂 (不育) 板8。
  3. 在35° c 的情况下孵育24-48 ĥ的纯培养基, 生长良好。

2. 抗真菌药敏性的测定

  1. 使用无菌一次性塑料循环, 从一个新鲜的继C. 光滑隔离板上选取大约1毫米直径的4-5 菌落。重在3毫升的无菌蒸馏水中。用温和的移混合均匀的悬挂。
  2. 使用密度5将单元格密度调整为0.5 麦克法兰, 该值相当于 1 x 106到 10 x 68单元格/mL。
  3. 使用商业化验 (见材料表和试剂) 对所有的C. 光滑进行敏感性测试, 按照制造商的说明进行隔离。根据 CLSI 指南和准备报告 (表 1)8, 解释基于合成的抗真菌药物对菌株的敏感性。

3. 基因组 DNA 提取测序

  1. 重在1.5 毫升的试管中, 用50毫米的 EDTA 在300µL 中, 从一个刚生长的自失能板中 loopful 出菌落。
  2. 在悬浮液中加入40µL zymolyase (10 毫克/毫升), 轻轻吸管5次, 直至悬挂均匀。
  3. 孵育样品在37° c 为 1-2 h 消化细胞壁。室温冷却5分钟。
  4. 离心悬浮在 1.4万x g为2分钟, 然后小心地去除上清。
  5. 提取 dna 提取试剂盒的基因组 dna 的指南 (见材料表)。
  6. 重提取的 DNA 颗粒在50µL 10 毫米的三个缓冲 (pH 7.5-8.5), 而不是洗脱缓冲器提供的套件。
  7. 通过测量 260/280 nm25的光学密度 (O. D) 来检查 DNA 的纯度。

4. 基因组 DNA 定量

  1. 根据制造商的荧光检测指南 (见材料表), 在化验试剂盒中准备一个1x 的三 EDTA (TE) 缓冲器。
  2. 通过在一次性96井板中加入2µL 至98µL 的 1x TE 化验缓冲液 (最终容积100µL, 稀释因子 1:50) 稀释 DNA 样本。此稀释步骤可以手动使用多通道吸管或自动液体处理工作站进行。
  3. 通过稀释荧光检测试剂盒 (表 2) 中提供的 lambda DNA (100 µg/毫升) 来准备标准的范围, 并包括用于测量的样品。
  4. 添加100µL 的荧光染料到100µL 稀释的 DNA 样品和标准的反应。在室温下孵育5分钟, 免受光照。
  5. 根据制造商的指导方针测量所有样品的荧光。
  6. 使用荧光读数绘制标准曲线, 并计算 DNA 样本的原始浓度。
  7. 确定 dna 的体积和10毫米的三个缓冲 (pH 值 8) 来调整 dna 浓度到 0.2 ng/µL。
  8. 使用自动液体处理工作站执行 DNA 稀释。这一步也可以通过手动移实现。

5. DNA 文库的制备

注意: 库的准备和排序是按照制造商提供的协议和指南 (图 1A) 执行的 (请参阅材料表)。

  1. Tagmentation 与 PCR 扩增
    1. 标签一个新的96井硬壳薄墙板。
    2. 添加5µL 的定量输入 DNA 在 0.2 ng/µL (总共 1 ng), 以每个样本井的板块。
    3. 添加10µL 的 tagmentation 缓冲和5µL 的放大缓冲, 每一个井含有 DNA 和轻轻吸管混合。用胶板密封密封板。
    4. 将盘置于热循环中, 并运行以下 PCR 程序:55 ° c 为5分钟, 并保持在10° c。当样品到达10° c 时, 立即进行中和。
    5. 加入5µL 中和缓冲器, 以中和增反应, 轻轻吸管混合。密封板, 室温孵育5分钟。
    6. 在样品中加入15µL 的 PCR mastermix。
    7. 使用一箱索引底漆管的设置 96-井板格式, 使每个样本得到一个独特的组合索引模板的基础上 (表 3)。
    8. 使用表3中模板中提供的顺序, 在索引板机架 (图 1B) 中排列索引底漆管, 并记录该模板上指数的位置。
    9. 将 tagmentation 板与添加的 PCR mastermix 放在指数板架上, 并按顺序排列。
    10. 将索引引物1管置于垂直排列, 并在索引架上的水平排列上索引底漆2管。使用多通道吸管, 小心地为每个样品添加5µL 的索引底漆。
    11. 用新的盖子取代旧的索引管帽, 以避免指数之间的交叉污染。
    12. 密封板使用 96-清楚的板封口和执行第二 PCR 如下:95 ° c 为三十年代, 12 个周期95° c 为十年代, 55 ° c 为三十年代, 72 ° c 为三十年代和72° c 为 5 min。
  2. PCR 清除
    1. 将 pcr 产物转移到 pcr 清除, 从 tagmentation 板到深井板 (见材料表)。
    2. 涡流的商业磁珠解决方案 (见材料表) 根据制造商的说明, 并添加30µL 的每个 PCR 产品的深井板。
    3. 摇动在 1800 rpm 2 分钟的微振动筛板, 在室温下孵育, 无需晃动5分钟。
    4. 把盘子放在一个磁性的支架上2分钟, 直到清液清除。
    5. 将上清液小心地丢弃在磁性支架上。
    6. 添加200µL 新鲜准备的80% 乙醇与板的磁性立场。
    7. 在三十年代的磁性支架上孵育板, 小心地除去和丢弃上清, 而不干扰珠子。
    8. 重复洗涤步骤, 让珠子风干15分钟. 如果有的话, 去掉多余的乙醇。
    9. 从磁性支架上取下板, 并在珠子上加52.5 µL 的悬浮缓冲器。
    10. 在 1800 rpm 的微振动筛上摇动盘子2分钟, 在室温下孵育2分钟而不摇晃。
    11. 将盘放在磁性支架上, 使上清液清晰。
    12. 使用多通道吸管, 小心地转移50µL 的上清从清理板到一个新的硬壳板。
  3. 库规范化
    1. 根据制造商的指导方针, 解冻库规范化试剂 (见材料表)。
    2. 从清理盘转移20µL 到新的深井板。
    3. 加45µL 磁珠悬浮液, 用平板封口机封板。
    4. 在 1800 rpm 的微振动筛上摇动盘子30分钟。这种潜伏期是至关重要的, 不应超过。
    5. 将板放在磁性支架上2分钟, 确认清液已清除 (图 1B)。
    6. 在一个适当的危险废物容器中除去并丢弃上清液, 而该板仍在磁架上。
    7. 从磁性支架上取下盘子, 用45µL 洗涤缓冲器清洗珠子。
    8. 在 1800 rpm 为5分钟的微振动筛上用洗涤缓冲器摇动盘子。
    9. 将板放在磁性支架上2分钟, 当它变清晰时丢弃上清。
    10. 从磁性支架上取下板, 再用洗涤缓冲器重复洗涤。
    11. 从磁性支架上取下板, 并加入30µL 0.1 N 氢氧化钠。
    12. 摇动板与 0.1 N 氢氧化钠在一个微振动筛在 1800 rpm 5 分钟, 并把板上的磁性立场为2分钟或直到液体是明确的。
    13. 将30µL 的洗脱缓冲液添加到新的96井硬壳薄墙最终规范化的库板中。
    14. 将30µL 上清液从正常化板转移到最终规范化的库板, 使最终体积60µL。现在, 这些库已准备就绪, 可以进行排序。
  4. qPCR 法测定 DNA 文库浓度
    1. 根据制造商的指南, 解冻 qPCR 套件中提供的 mastermix、底漆和标准 (见材料表)。
    2. 结合 PCR 试剂 mastermix 和 qPCR 试剂盒中提供的底漆, 按照制造商的说明和等分可以存储在-20 ° c。
    3. 为了确定 dna 库的浓度, 通过执行1:100 稀释 (1.5 µL 脱氧核糖核酸库到148.5 µL 三缓冲), 然后1:80 稀释 (2 µL 从1:100 到158µL 三缓冲), 使脱氧核糖核酸图书馆的1/8000 稀释使用10毫米三个缓冲 (pH 8)。
    4. 摇动稀释板在 700 rpm 至少1分钟, 然后离心机在 14000 x g为1分钟。
    5. 通过混合4µL 稀释 dna 库或 dna 标准和16µL mastermix, 制备20µL 的最终 PCR 反应。
    6. 执行 PCR 以下制造商的设置在 thermocycler:95 ° c 为 5 min, 35 周期95° c 为三十年代和60° c 为四十五年代, 并且最后65° c 到95° c 为融解曲线分析。
    7. 从 qPCR thermocycler 中获取样本 DNA 库和标准的 Ct 值。
    8. 从标准的 Ct 值生成标准曲线 (图 2)。定义上和下 QC 范围由±3周期的平均值。例如, 如果平均 Ct 值是13周期, 那么 QC 范围是在16和10周期之间。
    9. 根据标准曲线和 Ct 值确定个体和平均库浓度 (ALC)。
    10. 确定要使用的总计库 (PAL) 的体积, 根据下面给出的计算结果, 考虑到目标库的浓度介于 1.4-1.8 pM 之间。
      注意:从 qPCR = ALC 获得的平均图书馆浓度;汇总库 (PAL) = ALC/2;变性 pal (达尔) = pal * 0.666
      根据与缓冲混合的达尔的体积, 是将库的浓度添加到流单元中。例如, 如果将库的65µL 添加到835µL 的缓冲区中, 则从该稀释 (Dil 1) 195 添加到1300年的总容量µL: (65/900) * dnPAL = Dil1
      Dil1 * (195/1300) = 最终浓度 (应介于 1.4-1.8 pM 之间)

6. 台式排序器中的库池和初始排序

  1. 根据制造商的指导方针, 解冻试剂盒。从4° c 的存储中取出一个新的流动单元, 并在测序前至少30分钟将室温带入房间温度。使用前取出缓冲盒和 prechill 测序缓冲器 (见资料表)。
  2. 通过混合5µL 库 (1 nM) 和5µL 0.2 N 氢氧化钠, 准备一个控制库。在室温下进行5分钟的涡旋和孵育, 将控制库变性成单股。
  3. 添加5µL 200 毫米的三盐酸, pH 7 和涡流。添加235µL prechilled 测序缓冲器并轻轻混合。总容量是250µL 与控制图书馆最后的集中在晚上20点。
  4. 通过将每个样本库的5µL 传输到一个单一的 low-bind 1.5 mL 管中, 将每一个采样文库的序列从最终规范化的库板中进行排序。
  5. 添加30µL 的共用库和30µL 的 0.2 N 氢氧化钠, 变性图书馆在另一个低绑定管。
  6. 涡 low-bind 管和孵化5分钟的室温变性图书馆成单股。
  7. 添加30µL 200 毫米的三盐酸, pH 7 到管与变性库中和反应。
  8. 添加65µL 的中和变性图书馆悬浮和835µL 的 pre-chilled 测序缓冲和旋涡混合好。
  9. 在最后的低束缚管结合以下: 195 µL 从中立的变性图书馆, 1.30 µL 的控制库和1103.70 µL 的测序缓冲器。正确混合。
  10. 将最终的库组合 (1300 µL) 加载到试剂盒上的指定位置。
  11. 设置排序运行通过输入项目和样本详细信息在排序器指定的网站遵循的准则。
  12. 按照指导方针开始测序。台式排序器中的负载流单元、带库的试剂盒和缓冲盒。
  13. 记录顺序中使用的所有试剂盒和墨盒的批号。

7. 从测序网站下载数据

  1. 按照制造商在网站上提供的说明下载 FASTQ 文件。
  2. 为一个良好的质量运行检查百分比 Q30 是≥75% 和集群密度是介于 170-280 k/mm2与最佳在 200-210 k/毫米2 (表 4)。

8. 测序数据分析

  1. 将已测序样本的 FASTQ 文件导入数据分析集成软件包 (见资料表)。
  2. 通过使用表5中列出的设置, 在软件中添加功能, 即修剪、映射到参考 (选择参考基因组)、局部重新排列和变体分析 (图 3a), 创建一个排序工作流。
  3. 通过选择单个示例或一批示例 FASTQ 文件并将输出文件保存在指定的示例文件夹中来运行工作流。
  4. 生成序列覆盖率深度、映射区域和基因组中结构变量列表的报告 (图 3B)。
  5. 使用结构变量列表搜索同义单核苷酸多态性 (snp) 的基因赋予抗药性和毒力。
  6. 通过列出 SNP 位置、基因和耐药或易感菌株的数量来准备报告 (表 6)。

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结果

十三c. 光滑包括c. 光滑ATCC 90030 和12株从临床真菌参考实验室 (分离 CMRL1 到 CMRL12), Westmead 医院, 悉尼进行了研究 (表 1)。其中包括三对分离 CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 和 CMRL-5/CMRL-6 获得的抗真菌治疗前后没有流行病学联系, 他们之间的24 (表 1)。

采用 CLSI 解释断点对九抗真菌药物进行了测定, 即两性霉素...

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讨论

本研究确定了在光滑中 WGS 引导检测耐药性的可行性、近似时间线和精密度。图书馆准备和测序的周转时间为四天, 报告分析结果1/2 天。这与培养皿和桑格测序中的药敏测定方法相比, 至少有相当数量的样品。大约 30-90 C. 光滑基因组可以根据测序流细胞容量进行测序, 80-100% 测序覆盖率。由于测序是在 in-house WGS 实验室设置, 因此本研究的成本/资源需求相当于桑格测序和探测器分析的?...

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披露声明

作者没有相互竞争的金融利益, 也没有利益冲突的披露。

致谢

这项工作得到了传染病和微生物学、公共卫生中心的支持。作者没有收到任何其他资助这项研究。作者感谢 Drs 阿诺特, 内森. 巴赫曼和 Ranjeeta 梅农对整个基因组测序实验的专家建议和帮助。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
DensiCHECK PlusBioMérieux IncK083536Densitometer used for McFarland readings
Sensititre YeastOneTREK Diagnostic Systems, Thermo ScientificYO10Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs.
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and NeedlesFisher Scientific, Thermo Fisher Scientific22-363-605Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required.
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubesSigma Aldrich, MerckT2795   Volume 2.0 mL, natural
 
ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteusMP Biomedicals, LLC8320921Used for cell wall lysis of fungal isolate before
DNA extraction
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120Does 100 DNA extractions
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitThermo Fisher ScientificP7589 Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol.
Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay.
Nextera XT DNA Sample Preparation KitIlluminaFC-131-1096Includes Box 1 and Box 2  reagents for 96 samples
Nextera XT Index Kit v2IlluminaFC-131-2001,
FC-131-2002,
FC-131-2003,
FC-131-2004		Index set A
Index set B
Index set C
Index set D
NextSeq 500/550 High Output Kit v2 IlluminaFC-404-2004300 cycles, More than 250 samples per kit
NextSeq 500 Mid Output v2 KitIlluminaFC-404-2003300 cycles, More than 130 samples per kit
PhiX Control KitIlluminaFC-110-3001To arrange indices from Index kit in order
TruSeq Index Plate Fixture KitFC-130-1005 2 Fixtures
KAPA Library Quantification Kit
for Next-Generation Sequencing		KAPA BiosystemsKK4824Includes premade standards, primers and MasterMix
Janus NGS Express Liquid handling system PerkinElmerYJS4NGSUsed for DNA dilutions during sequencing
 0.8 mL Storage PlateThermo ScientificAB0765BMIDI Plate for DNA Library cleanup and
normalisation
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881 Magnetic beads in solution for library purification
Magnetic Stand-96Thermo Fisher ScientificAM10027Used for magnetic bead based DNA purification
OrbiShaker MP Benchmark ScientificBT150296-well plate shaker with 4 platforms
Hard Shell PCR PlateBioRadHSP9601Thin Wall, 96 Well
LightCycler 480 Instrument II Roche 5015278001Accomodates 96 well plate
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001Clear 96-well plate sealers
CLC Genomics WorkbenchQiagenCLCBioSoftware for data analysis, Version 8
NextSeq500 instrumentIllumina Illumina Benchtop Sequencer used for next generation sequencing

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